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介绍

肠上皮屏障是防御入侵共生体的重要免疫屏障细菌和肠道病原体(1). 肠上皮损伤屏障可能导致细菌和代谢物的移位进入血液和组织(2，三). 在严重的情况下，这种移位可能引发全身炎症和多器官功能障碍综合征(4). 多种病理状态，例如缺血再灌注损伤、炎症和癌症，如肝癌或胰腺癌(5),对肠粘膜屏障造成损害(6)导致临床上的复杂性实践与患者预后不良(7). 因此，当前的研究重点是探索保护和修复肠道的新方法屏障功能。

奥曲肽（OCT）是一种合成的八肽天然生长抑素衍生物(8). 以往研究结果证明OCT可以预防化疗引起的腹泻，重症胰腺炎和炎症引起的肠道损伤肠病(9–11). 因此，华侨城可能在以下方面表现出潜力肠损伤的治疗。

生长抑素受体（SSTRs）是G蛋白偶联的在人体细胞膜上广泛表达的受体大脑和肾脏(12，13)和结肠组织中(14). 以往对SSTR的大量研究专注于其在防止肿瘤细胞增殖中的应用(15–17). 生长抑素结合SSTRs发挥作用对细胞的影响(12，18). 先前研究结果显示在SSTRs的五个亚型中，亚型2、3和5表现出对华侨城的高度亲和力(8，19).虽然生长抑素通过以下途径保护肠粘膜屏障调节紧密连接（TJ）蛋白的表达(8，20–23),具体的分子机制尚待完善阐明。

自噬是细胞质蛋白质的一个过程或细胞器被吞噬成囊泡，与溶酶体。在自噬溶酶体形成后溶酶体的内容物被降解(24–26).生理上，细胞新陈代谢需要自噬细胞内细胞器的更新。以往研究结果证明肠上皮细胞的自噬是与TJ和肠上皮屏障直接相关功能(27，28).

脂多糖（LPS）是唯一的革兰氏阴性菌的膜，与肠道有关上皮固有免疫(29).LPS触发炎症信号级联，诱导TJ功能障碍，导致肠上皮屏障功能障碍(30，31). 因此，本研究旨在探讨OCT对自噬和SSTR功能的影响LPS诱导的Caco2细胞。此外，OCT对TJ和western blot检测肠黏膜屏障功能印迹和逆转录定量（RT-q）PCR。现在这项研究为肠上皮屏障的保护和修复。此外，本研究的结果可能提供一种新的肠粘膜炎治疗的理论基础临床实践。

材料和方法

细胞培养和治疗

人结肠腺癌细胞系Caco2和Sw480是从李宗陵教授处获得的，身份为细胞系经短串联重复序列测定证实。细胞最初购自美国类型培养集合。Caco2细胞在最低基本培养基中培养（包括非必需氨基酸；目录号PM150410；Sigma-Aldrich；Merck KGaA），含20%胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Inc.）并在37°C下5%的温度下储存一氧化碳2具有饱和湿度。培养Sw480细胞DMEM（目录号RNBL7920；Sigma-Aldrich；Merck KGaA）中含有10%胎牛血清，在相同条件下保存。他们每隔一天传代一次，细胞为对数生长期用于实验研究。

OCT和LPS体外治疗

LPS的治疗方法（分类号L4391；Sigma-Aldrich；Merck KGaA）对两种细胞系进行将其添加到相应的培养基中100、50、10、1和0.1µg/ml的浓度持续时间。OCT（目录号HY-17365；MedChemExpress）将10、20或50µM的浓度添加到相应的添加LPS前2小时培养基。Caco2细胞接种到初始密度为5×104细胞/孔和Sw480接种初始密度为6×104细胞/孔。在随后的实验中，细胞被分为三组：对照组，50μg/ml LPS和10µM OCT。对照组未经治疗。对于LPS+OCT组，细胞首先用OCT预处理2h然后与LPS共孵育24小时，然后加入各种指标检测到。

使用小型干扰SSTR2干扰（si）RNA

细胞接种到六孔板中密度为5×105细胞/每孔，允许他们粘附在井底，并增长到50-70%的汇流处。GP-transformate制造商提供的说明（苏州吉马基因有限公司）转染细胞转染后4～6h更换培养基。总RNA或蛋白质在48–72小时后提取检测转染。siRNA序列由Jima基因合成Co.Ltd.的siRNA集如下：阴性对照，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′（意义）和5′-ACGUGACACGUGGAATT-3′（反感知）；SSTR2-Homo-1097 5′-GCUCUAAGAGGAGAATT-3′（感觉）和5′-UUCUUCCUUAGAGGAGCTT-3′（防感）；SSTR2-Homo-1264型5′-GUCCUACCUUGCUAAACAAT-3′（意义）和5′-UGUUAGCAUAGGUGAGACT-3′（反感知）；SSTR2-Homo-1049 5′-GCUACCUUCAUUAUCAUTT-3′（意义）和5′-AUGAUAAUGAACAGAGCTT-3′（防感）。

细胞活力测定

CCK-8试剂盒（目录号C0038；Beyotime Institute of生物技术）用于检测细胞的活性用药物治疗。密度为5×10的电池4将细胞/孔接种到96周的平板中并培养24小时直到根据说明显示出粘附生长然后用药物刺激细胞24小时37°C时为h。随后，用CCK-8培养细胞溶液在37°C下放置1小时，在450 nm处检测吸光度带有微型板阅读器。每组的每个实验条件设置在三口井中。虽然对照组有三个经过反复实验，它已被标准化作为参考活动计算标准。

蛋白质印迹分析

首先，细胞在六孔板中培养密度为1×106细胞/孔。细胞粘附24小时后并加入生长、LPS和OCT对细胞进行预处理。这个按照说明提取全细胞蛋白质由RIPA制造商提供，电池芯块使用RIPA混合物重新悬浮（分类号R0020；Beyotime含有PMSF（目录号P0100）和磷酸酶抑制剂（目录号：P1082；Beyotime Institute of生物技术），然后在冰浴中孵育30分钟，在此期间，每5分钟进行一次反复移液，以确保全细胞裂解。12000×g离心20次min，提取蛋白作为上清液。这个然后使用2000c纳米液滴测量蛋白质浓度（赛默飞世尔科技公司）。蛋白质样品（10–20µg）然后使用SDS-PAGE在10%或12%的凝胶上分离。中的蛋白质然后将凝胶转移到硝化纤维素膜上膜上的非特异性结合位点在室温下加入5%的脱脂牛奶。培养细胞膜在4°C下过夜，用一级抗体，随后辣根过氧化物酶标记二级抗体孵育在室温下放置1小时。最后，增强的发光药剂A溶液和稳定剂B溶液（类别号。BL520B1/BL520B2；Biosharp）以1:1的比例混合以可视化蛋白质带。主要抗体包括：微管相关蛋白1轻链3B抗体（LC3；分类号ab192890；1:1500稀释；Abcam），闭塞带1（zo-1；分类号10019107；1:1500稀释；Proteintech Group，Inc.），GAPDH（目录号AF7021；1:8000稀释；亲和性生物科学）、SSTR2（目录号YT-5740）、SSTRA3（目录号NN-2540）、，SSTR5（目录号YN-2541；全部1:1000稀释；ImmunoWay生物技术），羊抗鼠（目录号orb229658；1:8000稀释；Biorbyt）和山羊抗兔（目录号ZB-2301；1:8000稀释；中山市金桥生物科技有限公司）。强度使用ImageJ软件版本1.49对条带中的条带进行量化（美国国立卫生研究院）。

LC3双标记腺病毒转染

将目标细胞接种到24孔浓度为1×10的平板5细胞/嗯，它是确保当细胞被Ad-monomeric红色荧光转染蛋白（mRFP）-绿色荧光蛋白（GFP）-LC3腺病毒（韩恒生物科技有限公司）第二天。根据说明和技术指导，病毒被添加到培养基，在37°C下培养3小时，以及培养基然后用新鲜培养基代替。24小时后，GFP和可观察RFP表达，细胞固定、密封（安装介质防褪色；北京索拉比奥科技有限公司）可在36至48小时内进行成像分析共焦显微镜成像（徕卡微系统股份有限公司）用于捕获并手动计数自噬点。已捕获图像使用40倍物镜，重复实验三次；在每次重复中，选择三个视图来计算荧光点。

免疫荧光

细胞稀释至5×10的密度4细胞计数后，接种在24孔板的盖玻片上提前。在24孔板中转染细胞后Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒48小时，用4%固定多聚甲醛在室温下放置15分钟，然后清洗用PBS三次。然后丢弃上清液用无菌镊子取出盖玻片。使用防褪色安装介质滴（目录号20210427；北京Solarbio Technology Co.，Ltd.）盖玻璃安装在幻灯片。使用激光进行数字图像采集共焦显微镜（Leica Microsystems GmbH）。

RT-qPCR

细胞以一定密度接种到六孔板中共1×106电池/孔，允许连接到然后用指示浓度的OCT和/或LPS。使用RNAiso plus（cat.no。AM33539A；塔卡拉生物科技有限公司）手册中的说明。然后使用Evo进行RTM-MLV RT Mix试剂盒（目录号AG11728）和500 ng RNA定量纳米滴系统2000c（Thermo Fisher Scientific，Inc.）是反转录为cDNA。下一步是实时PCRSYBR Advantage定量分析紧密连接基因mRNAqPCR预混料（产品目录号AG11701；Takara Bio公司）。两步走选择程序进行qPCR。在步骤1中，温度设置为95°C持续30秒，持续1个循环。在步骤2中，温度设置为95°C持续5秒，60°C持续30秒，持续40次循环。相对mRNA表达由2-∆∆Cq计算方法(32). GAPDH被用作mRNA的看家基因。目标引物序列为由Sangon Biotech合成。引物组如下：β-肌动蛋白正向，5′-CCTTGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′和反向，5′-caggaaggagaggctggaagagtg-3′；GAPDH转发，5′-GCCGTCAAGGCTGAAC-3′和反面，5′-TGTGAAGAGAGAGACCGTGGA-3′；TNF-α正向，5′-CCTTCTCTAATCAGCCCTCCTG-3′反向，5′-GAGGACCTGGGAGTAGAGAGAGGAG-3′；IL-6向前，5′-ACTCACCTCTCAGAACGAATTG-3′和背面，5′-CCATCTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；ZO-1前进，5′-GCGGATGCTACAAGTGATG-3′和背面，5′-GCCTTTCTGTGTCTGTCTTCATAG-3′；闭塞素（OCLN）向前，5′-TACGGAAGTGGCTATGTATCTATGTATGG-3′和背面，5′-CTTTGCTGCTCTTGGGTCTTATAG-3′；克劳丁（CLDN）1前进，5′-TGGTGGTTTGGCATCCTCCTG-3′和背面，5′-TCATCGTCTTCCAAGCACTTCATAC-3′。

跨上皮电阻（三通）

Caco-2细胞单层的TEER测量使用Millicell ERS仪器（EMD Millipore）进行。细胞以1×10的密度播种4a中的每口井24孔Transwell板（目录号02822019；康宁公司），确保顶部（AP）侧的液位和基底外侧（BL）侧水平。每次更换液体直到第21天细胞形成紧密连接。在使用电阻计之前，对其进行了清洁并将其设置为零酒精和PBS。正负电极分别为按照制造商的要求插入孔板直到电阻计能够顺利读数和计数。每个井的电阻值Ω和百分比为根据公式计算，每个井有3口复合井以减少实验误差。这些单元格的TEER值治疗后记录。电池产生的电阻在有无OCT的情况下测定单层在减去空白滤波器的贡献之后。TEER是计算如下：TEER=（R1-R0）×A（Ω），其中R1和R0用单元格和no-cell背景井。A（厘米2)表示细胞单层的表面积插入。

TEER的百分比变化计算如下如下：TEER%=TEERtest/TEERinitial×100。

细胞通透性

将细胞接种到24孔Transwell板中密度为1×105细胞/孔。细胞培养至模拟小肠紧密连接结构上皮细胞。检测前，Hank的平衡盐溶液含1 mg/ml FITC-Dextran4000（FD4；目录号HY-128868A；MedChemExpress）添加到细胞的AP侧，PBS为添加到BL侧。向基础培养基中添加FD4（0.1 mg/ml）在Transwell室。媒体从Transwell收集3小时后插入荧光信号（在485 nm和538nm处的发射），FD4浓度为根据荧光强度计算。

透射电子显微镜（透射电镜）

Caco-2细胞自噬体的观察使用Leica TEM（Leica Microsystems GmbH）执行。细胞是收集在1.5毫升离心管中，用戊二醛固定（分类号G6257；默克公司）溶液在4°C下过夜洗涤两次PBS后，然后用1%的锇酸固定在4°C下保持1-2小时，用PBS进行三次洗涤并梯度脱水每个梯度15分钟。下一步是使用渐变包埋剂渗透，然后37°C渗透纯包埋剂过夜。加热和在70°C下聚合至少24小时，切片为双切片用柠檬酸铅和过氧化乙酸油染色，然后使用Leica TEM（Leica Microsystems GmbH）观察。

统计分析

所有实验都是三个平行的实验。每个图中的结果表示为平均值±平均值的标准误差。GraphPad Prism 8软件；Dotmatics）用于统计分析。P值为使用Tukey的post-hoc进行单向方差分析计算测试。P<0.05被认为是统计学上的差异显著。

结果

OCT预防LPS诱导的肠道Caco2和Sw480细胞的上皮细胞损伤

不同浓度LPS对在Caco2和Sw480细胞中测量细胞活力。这个结果表明，培养24h后，100和50µg/mlLPS显著降低了这两种细胞系的细胞活力(图1A). 浓度较低在随后的实验中选择50µg/ml的LPS。确定无论OCT是否对细胞产生任何影响，他们都被培养用10、20和50µM OCT处理24小时，细胞活力为评价的。结果表明，OCT没有显著影响关于这两种细胞系的活性(图1B). 根据之前的参考结果，10µM OCT通常被用作处理单元(33). 因此，50选择µg/ml LPS和10µM OCT用于随后的试验实验中，Caco2和Sw480细胞均用10µM OCT，在用50µg/ml LPS处理24小时前2小时注意，用10µM OCT预处理可显著改善细胞与单独用LPS处理的细胞相比的活力(图1C). TNF-α和IL-6是两种重要的促炎细胞因子IBD增加，并测量了这些基因的表达使用RT-qPCR。如所示图。一维，LPS显著诱导TNF-α和IL-6的分泌在Caco2和Sw480细胞中。此外，OCT抑制了LPS对TNF-α和IL-6表达的影响。总的来说，这些结果提示OCT可能减弱LPS诱导的肠上皮细胞损伤与炎症在体外.

图1。 OCT减弱肠上皮LPS对Caco2和Sw480细胞的损伤。（A） 二氧化二钙细胞（左）和Sw480细胞（右）与LPS（0–250）孵育µg/ml）24小时。（B）Caco2细胞（左）和Sw480细胞（右）用OCT（0-50µM）培养24小时（C）Caco2细胞（左）和Sw480细胞（右侧）用OCT（10µM）预处理2 h然后用LPS（50µg/ml）刺激24小时。CCK-8分析为然后用于检测细胞活力。（D） TGF-α和IL-6通过以下方法测定Caco2细胞和Sw480细胞中的表达逆转录定量PCR*P<0.05，**P<0.01，***如图所示，P＜0.001，***P＜0.0001。LPS、，脂多糖；OCT，奥曲肽；CKK-8，细胞计数套件-8。

OCT抑制肠上皮调节SSTR2对细胞Caco2的损伤

调查哪种SSTR亚型在OCT介导的肠上皮细胞保护蛋白检测SSTR2、−3和−5的表达水平。结果表明SSTR2的表达水平显著OCT治疗后增加，但无显著差异在SSTR3和SSTR5中观察到表达(图2A和B). 因此，我们假设OCT可以通过结合随后使用siRNA进行SSTR2敲除转染(图2C). 这个转染效率的最高水平如下因此，选择使用siRNA-1264转染在随后的实验中。结果表明，OCT治疗并没有逆转LPS诱导的Caco2和SSTR2敲除后Sw480细胞存活率(图2D). 此外，在SSTR2击倒中细胞，OCT处理不能逆转LPS诱导的促炎细胞因子表达水平(图2E).

图2。 OCT减轻肠上皮通过调节SSTR2导致细胞损伤。（A和B）Caco2细胞用10µM OCT预处理2 h，然后用50µg/ml刺激LPS 24 h。SSTR2、SSTR3和用western blot分析测定SSTR5。（A） 代表western blots和（B）定量表达水平。（C） 检测RT-qPCR检测SSTR2基因干扰效率。（D） 细胞使用计数试剂盒-8检测Caco2的活性用LPS（50µg/ml）和OCT处理的细胞（左）和Sw480（右）（10µM）。（E） TGF-α和IL-6采用RT-qPCR方法检测Caco2和Sw480细胞的表达*P<0.05，**如图所示，P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001；ns，否重要性。逆转录定量PCR；LPS、，脂多糖；OCT，奥曲肽；NC，阴性对照；硅，小干扰RNA；SSTR，生长抑素受体。

OCT可防止LPS诱导Caco2细胞的肠上皮屏障功能障碍

进一步探讨OCT对LPS诱导的影响肠上皮屏障功能障碍、完整性和使用TEER评估肠上皮的通透性Caco2细胞中的FD4分析。孵育24小时后对照组细胞阻力和通透性保持不变处于稳定水平。此外，结果显示电阻降低，FD4显著增加LPS处理后的渗透性。这也证明了用OCT预处理的细胞表现出较高的TEER值(图3A)和更低水平的FD4渗透率(图3B)与之相比用LPS单独处理细胞。继SSTR2击倒之后，华侨城预处理没有挽救TEER值或FD4渗透率Caco2细胞，表明OCT可以保持单层完整性通过SSTR2在Caco2细胞中。

图3。 OCT保护肠道脂多糖诱导Caco2细胞上皮屏障功能障碍。（A）和B）Caco2细胞用10µM OCT预处理2 h，然后用50µg/ml LPS刺激24小时（A）TEER和（B）测定FITC-右旋糖酐-4的流量以评估副细胞渗透。（C） Caco2细胞用10µM OCT预处理2h，然后用50µg/ml LPS刺激24 h测定OCLN、CLDN1和zo-1的蛋白表达水平通过逆转录定量PCR和western blot分析。（D） 用10µM OCT预处理Caco2细胞2 h然后用50µg/ml LPS刺激24小时westernblot检测zo-1的表达水平。*如图所示，P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001。LPS、，脂多糖；OCT，奥曲肽；NC，阴性对照；硅，小干扰RNA；生长抑素受体；CLDN，克劳丁；zo-1，闭塞带1；OCLN，闭塞素；三通，跨上皮电阻。

用RT-qPCR检测其表达TJ蛋白水平(图3C).结果表明，zo-1的表达水平为LPS治疗后下降；然而，它在LPS和OCT的联合治疗没有类似的变化观察到的另外两个紧密连接的表达式分子。随后，zo-1蛋白表达水平为用western印迹法评估(图。三维)，所得结果与使用RT-qPCR观察。

华侨城保持基本水平Caco2细胞通过SSTR2的自噬

先前的研究表明，自噬具有在维持肠上皮屏障中的重要作用调节TJ蛋白(34，35).确定OCT对肠道TJ的保护机制屏障功能、自噬体的形成和透射电镜观察Caco2细胞中的自噬体。这个结果表明，肠上皮细胞表现为正常生理条件下自噬的基础水平；然而，自噬水平在以下情况下显著降低LPS治疗24小时后，自噬水平恢复OCT治疗后基线检查(图4A). 总的来说，这些结果提示Caco2细胞的自噬可能在OCT诱导的肠上皮屏障保护。

图4。 OCT维持基础自噬生长抑素受体2介导的Caco2细胞。（A） Caco2细胞自噬体/自溶体的超微结构用透射电子显微镜观察（由橙色箭头；下部面板显示放大的窗口上部面板。上下面板中的比例尺为1和2µM）。（B） Caco2细胞被50µg/ml LPS 24小时。（C）Caco2细胞用10µM OCT预处理2小时，然后用50µg/ml LPS刺激24小时（D）之后干扰SSTR2，用10µM OCT预处理Caco2细胞2小时，然后用50µg/ml LPS刺激24小时western blot检测LC3蛋白的表达水平在0至24小时的不同时间点进行分析。*P<0.05，**如图所示，P<0.01，****P<0.0001；ns，无显著性。信用证，轻链；脂多糖；OCT，奥曲肽；NC，负极控件。

由于自噬是一个动态过程在不同时间点观察自噬水平。结果western blot分析显示治疗后LC3-II/GAPDH表达达到最大水平6小时后，表达水平降低延长LPS治疗。LC3-II表达水平低孵育24小时后在Caco2细胞中观察到(图4B). 值得注意的是OCT治疗后，LC3-II/GAPDH的表达也有所下降孵育24小时后恢复基线(图4C). 然而，遵循SSTR2敲除，OCT治疗不能恢复自噬水平Caco2细胞(图4D).

OCT调节细胞自噬的变化Caco2细胞

Caco2细胞转染Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒用于评估自噬。在该系统中，GFP信号在酸性介质中猝灭溶酶体环境，而mRFP信号保持稳定。因此，自溶体和自噬体被标记为红色或分别为黄色(36).利用这种荧光特性，每个细胞的自噬通量药物治疗组接受监测(图5A). 黄色和红色的数字单用LPS治疗后，dots显著增加，6小时后达到最大值，24小时后下降(图5B). OCT预处理6小时后，黄点和红点的数量也增加了24小时后，这些水平恢复到基线水平(图5C). 值得注意的是，这些结果是与western blot分析中获得的结果相比较LC3-II蛋白表达(图4B和C类).

图5。 OCT调节自噬流Caco2细胞的改变。（A） 细胞自噬感染双标记腺病毒治疗不同时间，然后仅使用50µg/ml LPS或与50µg/ml LPS孵育10µM OCT刺激24小时。徕卡激光共焦显微镜检测自噬流的变化。放大显微镜是×40。（B） 黄色荧光点的数量在自噬流中GFP和RFP（自噬体）合并后已计数。（C） 合并后红色荧光点的数量计算自噬流中GFP和RFP（自噬小体）的数量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，***P<0.001，****P<0.0001表明；ns，无显著性。脂多糖；华侨城，奥曲肽；NC，阴性对照；si，小干扰RNA；SSTR、，生长抑素受体；绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白。

总的来说，这些结果表明OCT可能防止LPS诱导的肠上皮屏障SSTR2导致的功能障碍。这些变化可能与肠上皮细胞自噬。

讨论

生长抑素类似物广泛应用于临床实践(37)并被考虑肢端肥大症和急性肢端肥大的安全有效治疗方案胰腺炎(38). 华侨城，a生长抑素类似物，减少肠粘膜损伤屏障(39)，防止化疗引起的腹泻和其他顽固性腹泻(40)缓解IBD和肠粘膜屏障损伤(41). 然而，潜在的机制OCT对肠上皮细胞的保护作用仍然难以捉摸。因此，需要进一步调查确定OCT在肠上皮中的调节机制细胞和探索治疗疾病的新靶点导致肠粘膜损伤。

Caco2细胞的LPS处理广泛用于模拟肠粘膜炎在体外(31，32，42).本研究旨在确定OCT对LPS处理Caco2细胞，使用Sw480细胞确认结果本研究的结果表明，LPS诱导的OCT预处理Caco2后，细胞活力受到抑制和Sw480细胞，提示OCT可能对肠道炎症环境。然而，OCT的作用肠上皮细胞损伤残留物的保护不清楚的。

生长抑素通过与属于G蛋白偶联的SSTRs相互作用受体超家族(43，44).迄今为止，已鉴定出五种SSTR亚型，即SSTR1-5、，这五种亚型在人体组织中广泛表达(14，43).先前的研究结果表明SSTR2甲基化可能起作用结肠癌的预后指标(45). SSTR1和SSTR2表示为IBD和溃疡性肠病患者结肠中的高水平结肠炎(46，47). 值得注意的是，OCT绑定到SSTR2和SSTR5具有高亲和力，SSTR3具有低亲和力(48). OCT未绑定到SSTR1或SSTR4(8). 朱利安尼(48)之前报道过长效可注射SSTR配体OCT和Lantenside适用于肢端肥大症患者的一线治疗方案(49). 此外，瓦伦卡等(23)据报道，DOTA-Tyr OCT在临床实践中通常用于治疗神经内分泌肿瘤，并通过与SSTR2结合发挥作用(23). 此外先前的研究表明，OCT可以有效地用于治疗表达SSTR2的胸腺上皮肿瘤患者(50). 生长抑素用于临床实践中炎症反应的抑制(51). 值得注意的是SSTRs用于IBD的治疗和神经调节传播、增殖和凋亡(46). 根据以前的文献研究表明，SSTR的敲除主要集中在肿瘤模型中研究(52，53). 例如，淘汰SSTR亚型可以提高机体诱导的敏感性神经系统疾病(54).下调SSTR表达可以促进迁移和癌细胞侵袭(55);然而，SSTR的敲除模型在炎症中是罕见的疾病。在目前的细胞实验中，SSTR2的表达受到干扰，对其他细胞没有影响功能。因此，OCT的潜在保护作用本研究对肠上皮细胞进行了研究。本研究结果显示SSTR2的表达是OCT处理后Caco2细胞显著增加。在此外，脂多糖诱导的细胞活力降低并没有OCT预处理和Caco2中SSTR2击倒后逆转和Sw480细胞，表明OCT的保护作用是SSTR2击倒后被抑制。总的来说，这些结果提示OCT可能减弱LPS诱导的肠上皮通过调节SSTR2造成损伤。

肠上皮细胞直接受损与肠粘膜屏障的功能有关(56). The defensive role of the肠上皮屏障依赖于细胞间TJ(57). 值得注意的是，TJ的形成蛋白质复合物，包括OCLN和zo-1，对于维持肠粘膜屏障(1). 此外研究表明，TJ破坏和高水平粘膜渗透性是由LPS引起的(58). 之前的研究结果显示生长抑素可能介导LPS诱导的肠道恢复通过调节CLDN4导致上皮屏障功能障碍(59). 然而，具体所涉及的分子机制或信号通路不是透露。本研究结果表明，OCTLPS治疗逆转肠屏障功能障碍Caco2细胞，如TEER值升高所示，FD4减少通量和zo-1蛋白表达增加。然而在SSTR2击倒后，OCT被逆转。这些结果提示OCT可以保护肠黏膜屏障功能并通过SSTR2保护肠上皮细胞。

肠粘膜屏障功能，尤其是TJ功能，与自噬密切相关。a的结果先前的研究表明，自噬在通过以下途径维持肠上皮屏障功能TJ蛋白动力学的改变(27). 肠道TJ功能障碍上皮细胞和有缺陷的自噬是加重IBD的因素(60). 因此，研究重点是自噬与TJ蛋白之间的潜在相互作用。先前的研究结果表明，自噬诱导CLDN1降解，降低了肠上皮TJ(61).此外，自噬与CLDN蛋白密切相关(62). 先前研究的结果发现CLDN蛋白与肠道TJ通透性，在肠道中起作用病理过程(63).

自噬是一种退化的进化机制细胞质成分，对多种生理和病理过程。自噬相关随着IBD的发生和发展(60)，尽管潜在机制仍然难以捉摸。先前的研究结果表明自噬缺陷可能加剧肠道炎症转基因小鼠模型(64). 结果表明肠上皮细胞自噬的影响。肠道上皮细胞缺乏自噬可能导致上皮屏障功能障碍。此外，自噬过程的恢复可能改善人和小鼠模型的肠道炎症(65). 因此，自噬显示出作为炎症反应调节靶点的潜力肠上皮细胞。为了进一步调查SSTR2介导的OCT在肠道中的保护机制本研究观察到上皮细胞自噬。

自噬的基本水平通常需要用于细胞生理学的维持。然而，自噬水平在对许多病理过程的反应中增加，例如如缺氧、炎症、感染和肿瘤形成，其中细胞试图抵抗应激反应(66). 福斯特等(67)之前建议细胞应激途径和自噬之间的串扰可能会恢复肠内稳态(67).因此，细胞需要基本水平的自噬体内平衡。

本研究结果表明自噬体和自噬小体数量减少Caco2细胞经LPS处理后OCT减弱了LPS诱导的效应。因此，自噬可能具有OCT介导的肠上皮保护的关键作用细胞。

值得注意的是，>20个自噬相关基因（ATG）具有在自噬中的作用。LC3属于ATG8系列，是一个自噬体膜上的标记蛋白分子高等真核生物。自噬体形成后，LC3-I与磷脂酰乙醇胺偶联形成LC3-II，并且随后定位于自噬体(68). LC3-II型在自噬体膜上保持稳定，直到与溶酶体，意味着LC3-II的表达水平为指示自噬体的数量。王等(69)之前报道称随着IBD的发生，LC3-I向LC3-II的转化程度增加患者的严重程度增加，表明肠道炎症与自噬水平相关(69). 最常用的方法用于自噬检测的是LC3的western blot分析转换（LC3-II/LC3-I）和观察到LC3点状聚集体荧光显微镜(70). 在本研究中OCT对自噬的影响，Caco2中LC3动力学的变化从0到24小时对细胞进行监测。结果表明LC3-II蛋白表达水平最高用LPS治疗6小时后的水平，这可能表明肠上皮细胞的自我保护机制对病理应激作出反应。LPS治疗12小时后，LC3-II蛋白表达水平降低LPS治疗24天后，自噬达到最低点h.然而，自噬水平在以下情况下恢复到基础水平OCT预处理，强调生理自噬在OCT治疗后保持不变。此外目前的研究表明，OCT对SSTR2敲除后，自噬被抑制。

OCT是生长抑素和通过与SSTRs结合在细胞中发挥作用。当前的结果研究表明，Caco2细胞的基本自噬水平为与OCT介导的SSTR2激活相关，导致细胞活力和屏障功能的改善。

总之，本研究表明OCT介导的SSTR2激活可能保护肠粘膜肠上皮细胞自噬调节屏障功能细胞。因此，OCT在肠道治疗方面显示出潜力炎症。此外，本研究可能提供一种新颖的肠粘膜损伤治疗的理论基础由各种病理状态引起的。然而，本研究具有局限性。例如，进一步调查SSTR激活的分子机制需要识别SSTR信号通路的上游成分。在此外，OCT对SSTR信号的调节作用路径需要进一步验证体内.

致谢

不适用。

基金

这项工作得到了国家自然科学基金的支持中国科学与技术基金（批准号：82000501）烟台市技术创新发展计划项目（批准号：。2022YD068）和徐荣祥再生医学研究计划滨州医科大学（批准号：BY2022XRX05）。

数据和材料的可用性

本研究中产生的数据可能是请求相应作者提供。

作者的贡献

XL负责实施在里面体外实验和手稿写作。YaZ参与了实验数据和图像处理以及草案修订。YuZ公司进行了统计分析和文献综述。XC公司协助进行研究设计和数据分析。DY帮助实验方法的设计、文献检索和排序规则。YL负责整个想法和项目资金获取、实验和手稿框架设计手稿修订。XL和YL确认所有原始数据。所有作者均已阅读并同意手稿。

道德批准和同意参与

不适用。

患者同意发布

不适用。

竞争性利益

作者声明他们没有竞争对手利益。

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