本文中提到：

介绍

端粒是位于染色体。它们由重复的核苷酸序列组成（5'-TTAGGG-3'）。这些功能性非编码重复保护真核生物染色体末端的磨损和损伤。端粒酶在有丝分裂细胞分裂期间由于DNA的无能而缩短聚合酶来完全复制DNA。这通常称为“最终复制”问题”。

端粒长度（TL）逐渐减少每年约20-40个碱基对(1)。端粒的缩短可能是被端粒酶逆转，端粒酶在高增殖细胞，如雄性生殖细胞，被激活淋巴细胞、干细胞和癌细胞(2,三).然而，在大多数成人体细胞中端粒酶缺乏，TL随着年龄的增长而降低(1)。端粒酶活性与妊娠并发症相关(4,5).此外，端粒缩短在各种疾病和与年龄有关的疾病，如癌症，心血管疾病（CAD）、糖尿病、类风湿关节炎和精神障碍(6-10)。此外，TL是体细胞的复制过去和复制潜能细胞。以前的研究主要集中在平均TL的估计上（MTL）与年龄相关疾病(11,12); 然而，当前的概念突出了极短端粒在细胞内环境稳定中的关键作用(13)。瓦科纳基等之前证明TL与药物滥用之间存在关联，导致过早的生物老化(14)。最近，创建了名为“BIOTEL 2.4版”的数据库，端粒长度数据库项目（TLDP），已报告(15)。此数据库是一个功能性数据库计算各种TL的半自动化工作表统计数据，因此是研究中应用的有用工具端粒生物学以及生物年龄估计(15)。值得一提的是当端粒长度缩短到阈值以下时限制，细胞生长受到限制，细胞经历细胞衰老或凋亡(16).细胞端粒持续缩短衰老，导致端粒极短（<3kb），易于与染色体融合。融合染色体在有丝分裂，导致基因组不稳定和染色体细胞分裂期间的重排(17)。事实上，端粒短负荷作为一种比MTL或端粒酶(18,19)。实际上，最近的研究已经表明短TL与几个年龄相关疾病，包括CAD、中风、癌症、关节炎、骨质疏松症、，白内障、2型糖尿病、高血压、精神疾病、慢性阻塞性肺病与痴呆(9,20-22)。戈格兰等建议端粒较短的个体死亡率较高与端粒较长的人相比(23)。人类研究表明，TL可以通过端粒的直接遗传来遗传通过父母身上发现的特定遗传因素配子(24)。此外，端粒缩短会受到环境因素的影响，包括体力活动、体重指数（BMI）、激素替代疗法、吸烟、慢性炎症、氧化压力、饮食抗氧化剂和重要的维生素摄入(25-28).

几项研究检查了TL的个人营养素。事实上，B12维生素缺乏与TL和DNA甲基化改变有关(26)。此外，维生素B12缺乏叶酸会导致DNA甲基化不足，基因组不稳定性与端粒缩短(29-31)。在之前的研究中ω-3（n-3）脂肪酸对患者TL的影响慢性肾脏疾病，归因于氧化还原应力(32)。此外，它还有研究表明，ω-3多不饱和脂肪酸（PUFAs）可以减少炎症和氧化应激(33-35)从而保护端粒免受损耗(36)。另一项研究表明较短的TL与绝经前妇女和妇女患乳腺癌的风险增加摄入较低的膳食和补充的β-胡萝卜素维生素C或E进水口(37).体外实验证明端粒缩短被延迟通过抗坏血酸或其衍生物(38-40)和某些躯体的寿命α-生育酚可增加细胞数量(41)。迄今为止，TL已关联只摄入单一维生素或微量营养素，但知之甚少关于二者结合对端粒状态的影响。最近Tsoukalas的研究等表明协同作用营养素和天然化合物的作用可以激活端粒酶酶在体外，在人外周血单个核细胞中细胞；需要对这些配方进行人体临床研究为了揭示端粒酶激活对健康的益处通过天然分子(42).流行病学研究表明多种并发微量营养素在全球非常普遍与慢性病相关；这些研究强调需要通过饮食和营养恢复这些缺陷补充剂（NS）(43,44).

本研究的目的是分析TL使用NS和评估组合的人口概况补充剂对热释光的假定影响，与健康人群未接受任何补充剂。

材料和方法

材料和试剂

一粒我的健康胶囊（Lumis Research SA）含有以下成分：混合维生素（抗坏血酸、维生素E50%天然醋酸盐、烟酸、维生素B1、维生素K2 Mena Q7 0.2%、，维生素B6、β-胡萝卜素、维生素B12（1%）、防结块剂（微晶纤维素、脂肪酸的单甘油酯和双甘油酯，硬脂酸镁和二氧化硅。一滴维生素D（纯D3，自然医生）含有2000 IU维生素D完整的D3和K2辅因子（自然医生）含有2000 IU维生素D3100µg K2和56 mg镁。两粒胶囊欧米茄3-6-9（Lumis Research SA）含有以下成分：740 mg鱼类油，740毫克亚麻籽油，740毫克硼砂油(博尔戈药用植物L）、200 mg磷虾油、370 mgα-亚麻酸、，312,6 mg二十碳五烯酸（EPA），154,2 mg二十二碳六烯酸酸（DHA），162,8 mgγ-亚麻酸（GLA），400 mg亚油酸酸和273.8 mg油酸。我的抗氧化剂四粒胶囊（Lumis Research SA）含有以下成分：混合维生素（抗坏血酸酸、维生素C钙、维生素C棕榈酸酯、天然维生素E醋酸盐50%，维生素B3，维生素B12 1%，β-胡萝卜素，维生素B5，维生素B6、维生素B2、维生素B1、叶酸、维生素D3生物素），我的益生菌（Lumis Research SA）的一粒胶囊含有以下：冻干开菲尔粒，干酪乳杆菌（LMG-S27763），罗伊氏乳杆菌（LMG S-27759），双歧双歧杆菌(双歧杆菌; LMG S-27761），嗜酸乳杆菌（LMG S-27762）、菊粉、阿拉伯胶纤维和羟丙基纤维素。一勺我的胃（卢米斯研究SA）含有以下成分：2500 mg L-谷氨酰胺（共同社®)和500毫克低聚果糖（FOS）。一个胶囊My Ubiquinol（Q10）（Lumis Research SA）含有50毫克泛醇。

研究设计

TL估计过程如所示图1。参与者已选定来自雅典一家私人诊所进行例行检查的个人体检，以及来自赫拉克利翁。基本人口数据和慢性病病史获得了疾病。人口统计数据包括姓名、，姓氏、出生日期和性别。病史包括所有慢性病（如糖尿病）的自我报告声明，癌症、类风湿关节炎等，可能接触杀虫剂（职业）和抗抑郁药物的使用。个人有慢性病病史的患者包括排除。根据这些标准，47名受试者被选为这项研究。在研究之前，他们从未服用过任何补充剂他们属于40-55岁年龄组。参与者身体健康而且没有限制饮食。他们被分为两组如下：一个由16个人组成的实验组补充了NS和对照组的31名受试者没有收到任何补充。所有补充剂的每日剂量是根据制造商的建议分配的。从所有人身上采集血样，柠檬酸盐用作抗凝剂。所有人的补充期参与者持续6至12个月。本研究的方案由患者和生物伦理委员会批准克里特大学材料及参考号。2019年3月22日。患者的生物材料和信息根据欧盟总协定，获得书面知情同意数据保护条例（GDPR）。在中执行的所有程序涉及人类参与者的研究符合伦理1964年赫尔辛基宣言及其后版本的标准修正案或类似的道德标准。

图1 端粒概览图估算过程。使用测量的荧光强度值人类血液中中期白细胞的Q-FISH分析使用BIOTEL电子表格对收集的数据进行了进一步分析。统计度量、图形表示和提供了数据列线图。

定量荧光原位杂交（Q-FISH）分析

采集外周血样（2.5 ml）来自所有参与者。肝素化血液在RPMI-1640中培养添加10%胎牛血清的培养基，1%L-谷氨酰胺、1%青霉素和链霉素（均来自Sigma-Aldrich）并在CO中刺激72小时2含有植物血凝素的培养箱。对于中期染色体准备，10µ在每个培养基中添加g/ml秋水仙碱2收获前h，然后是KCl低渗休克和甲醇/乙酸（3:1）固定。中期Q-FISH分析为如前所述执行(14,15).

每张幻灯片的图像都是用63X1024×1024像素物镜和电荷耦合器件相机分辨率和8位深度。对于每张幻灯片，>10个不同扫描图像来自3个独立的生物复制。图像的最大投影和反褶积使用徕卡Q-FISH软件[徕卡应用程序徕卡TCS套件高级荧光灯（LAS-AF）3.1.3版使用ImageJ分析SP8]和端粒荧光强度(https://imagej.nih.gov/ij/)乘以2独立调查人员。端粒荧光值为通过使用L5178Y-S细胞转化为kb（目录号93050408；Culture Collections，Public Health England），拥有稳定且知名的TL，估计约为7 kb(45).

统计分析

TL（整个端粒基因组）和短端粒（TLS）的TL（TL<20%）为估计。评估TL和TLS的正常性检查使用Kolmogorov-Smirnov检验和Liliefors修正。使用Pearson的Chi-square检验比例差异检验或Fisher精确检验，当未达到假设时。年龄比较采用独立样本t检验。多个应用线性回归检验NS对根据年龄和性别进行调整后的TL和TLS长度。盒子和Whisker图和条形图用于数据图形代表。数据使用IBM SPSS Statistics 23.0软件分析和接受零假设的水平设定为P=0.05。

结果

参与者的人口统计特征对照组（CG）和NS组（NSG）见表一.性别分布两组之间没有显著差异（P=0.609）NSG和CG中男性比例相似（n=9，37.5%）（n=15，62.5%）。年龄分布，将人口划分为5年间隔组，显示两组年龄匹配（P=0.505）。为了阐明人口统计学是否对TL有任何影响，我们对两组患者进行了以下方面的统计分析性。在各个年龄段进行了单独分析组。如所示表二,女性的TL比男性长，差异为248TL为474个碱基，TLS为195-200个碱基。然而，这些差异并没有达到统计显著性，因为没有一个四分位的完整端粒或短端粒显示出两种性别之间的统计显著差异（P＞0.300）。

表一 人口统计特征营养补充剂组（NSG）和对照组（CG）。

表一

人口统计特征营养补充剂组（NSG）的参与者，以及对照组（CG）。

	NSG（n=16）		重心（n=31）		总计	P值
性别（n，%）一
男性	9	37.5%	15	62.5%	24	0.609
女性	7	30.4%	16	69.6%	23
年龄，年（平均值±SD）b条	46.4	3.5	47.6	4	47.1 (3.8)	0.323
年龄组，（n，%)c（c）
40-45	6	42.9%	8	57.1%	14	0.505
45至50	8	34.8%	15	65.2%	23
50-55	2	20.0%	8	80.0%	10

{需要标签（或@符号）对于fn[@id='tfn1-ijmm-44-01-0218']}对数据进行了分析使用

皮尔逊齐方检验；

b独立样本t检验；或

c费希尔精确测试。

表二 整个端粒基因组的比较（TL）和短端粒长度（TLS）（<20%）（in碱基）。

表二

整个端粒基因组的比较（TL）和短端粒长度（TLS）（<20%）（in碱基）。

	性别				P值
	男性（n=24）		女性（n=23）
	平均值	标准偏差	平均值	标准偏差
TL公司一
第一个四分位数	8,444	1,296	8,692	1,374	0,528
中间带	10,142	1,315	10,490	1,537	0,407
第三个四分位数	12,107	1,505	12,582	1,910	0,348
TLS公司一
第一个四分位数	6,321	1,288	6,516	1,079	0,577
中间带	7,052	1,270	7,247	1,173	0,587
第三个四分位数	7,592	1,283	7792个	1,293	0,598

a使用独立样本分析数据t检验。

TL（整个端粒基因组）和TLS（<20百分位数）。NSG和CG之间TL和TLS的差异如所示图2和三估计TL和TLS的四分位数来自每个患者的原始数据。有一个TL值的差异具有统计学意义（P<0.05）与CG相比，NSG组的平均四分位数增加第1和第2个四分位的值（中间值）。TL测量为NSG组比CG组高844和953个碱基。因此，有统计学意义上的增加值TLS在第二个（中位数）和第三个四分位的值为P=0.044P=0.033。发现存在差异的趋势第一个四分位比较（P=0.051）。

图2 端粒长度值（基数）整个端粒基因组（TL）和短端粒（TLS）营养补充剂组（NSG）（<20%）和对照组（CG）。星号（*）表示组间差异P<0.05，由线性年龄和性别调整后的回归分析。

图3 分组中值的堆积条形图对照组（CG；浅灰色）的端粒长度（以碱基计）营养补充剂组（NSG；深灰色）。每个酒吧对应于分组的中间端粒增加5%长度。在所有研究中，NSG组的数值往往更高百分位数比CG组高。TL，端粒长度。

NSG和CG在生成的列线图中的位置来自TLDP数据(13)如所示图4.第1、2行显示了TL与年龄的（中位数）和第三个四分位数，显示了年龄减少。平均年龄为2SD，TL为2SD小组被放置在图表上。很明显，平均TLNSG水平高于健康人的中位数人群，而CG的平均TL水平低于该线健康人群的中位数。不同之处在于观察到大约1000个碱基。

图4 中位TL在营养补充剂组（NSG）和对照组（CG）TL与年龄的列线图。在图表中的每一对数字上，第一个数字表示年龄，第二个数字表示TL千字节。误差条指的是年龄和TL离散度（2倍标准偏差）。TL，端粒长度。

此外，如中所示图5，有关详细信息，请参阅表SI，没有显著性差异各年龄组TL差异（P>0.500）。TL与年龄的P值在第一个四分位数为0.964，在第二个四分位为0.908第三个四分位数的中位数和0.537，而TLS的P值与年龄相比，第一个四分位数为0.741，中位数为0.826第三个四分位数为0.912。

图5 TL和TLS的方框图使用四分位数作为所有数据长度指标的年龄组[对照组（CG）和营养补充剂组（NSG）]。这个○符号表示异常值。星号（*）表示组间差异P<0.05，由线性性别和营养调整后的回归分析补充组。TL，端粒长度；TLS，短端粒长度。

多元线性回归模型应用于平均TL（或TLS）及其四分位数被设置为依赖项变量。解释性变量为NSG、年龄和性别参与者。每个回归模型的结果如所示图6。有一个阳性对平均TL的影响（β：918；95%置信区间：38-1799）四分位TL（beta:889；95%CI:65-1714），用于中间TL（beta:1004; 95%CI:125-1883），但不适用于第三个四分位TL（β：953; NSG中95%置信区间：-128-2035）。还有一个积极的方面对TLS中位数的影响（beta:0.728；95%CI:1-1521）和3四分位TLS（beta:842；95%CI:45-1639），以及在平均TLS（P=0.051）和第一个四分位数中观察到影响TLS（P=0.060）。此外，图。6显示了从多个线性回归，根据年龄和性别进行调整（β和95%置信区间）。

图6 βas的95%置信区间从TL或TLS与。调整年龄和性别的营养补充剂组。星号（*）表示营养品的有效模型（效果）补充组TL或TLS测量。TL，端粒长度；TLS、，端粒长度短。

讨论

本研究结果表明每日服用NS对全身长度有良好影响端粒短，与性别和年龄无关。虽然NS作用的潜在机制尚不清楚对几个关键机制的影响，包括氧化应激和慢性炎症，可能与TL维持有关(46)。事实上，研究表明氧化应激和炎症的增加与牙周炎患者白细胞TL降低(47)，以及患者帕金森氏病(48).此外，马等据报道，老年人中枢性肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和低血糖抗氧化水平的白细胞TL较短；具体来说作者证明，TL降低与TL增加相关1型和2型糖尿病患者的氧化应激(49)。此外，氧化在老化过程中，应力与TL缩短有关比较研究得出结论，老年男性生活在希腊的氧化应激指数较低，但较高抗氧化剂水平，与相应人群相比荷兰老年男性(50)。这个作者认为，白细胞中端粒的长度为希腊语明显高于荷兰语人口，因为后者生活在压力更大的城市环境中并遵循缺乏抗氧化营养素的饮食。的确，抗氧化剂和抗炎剂已被证明可以减少TL缩短的速度(51).在之前的一项研究中，保罗将维生素B的可用性联系起来和D伴白细胞（LTL）(52).此外，在该研究中，血清叶酸及其代谢产物与LTL呈正相关。有人建议这些营养因子减弱的机制端粒磨损是抗氧化活性、DNA甲基化和DNA损伤的预防(53)。此外，还指出类胡萝卜素、ω-3-脂肪酸、辅酶Q10、硒和维生素D可以降低端粒缩短率(51)。2013年，Kiecolt-Glaseret（等）铝证明40-85岁的男性和女性一直在服用包括ω-3脂肪酸在内的补充剂减少氧化应激和增加TL(54).

在这项研究中，我们提出了服用复合维生素的参与者的TL评估补充。本研究的一个优点是方法论热释光测量。我们测量了外周血的TL使用高灵敏度方法（Q-FISH）产生白细胞使用BIOTEL的TL和TLS（<20%）百分比数据(15)。我们决定NS使TLS和TL显著增加，具有统计学意义。这是一个非常有趣的发现，因为有证据表明短端粒负荷比MTL对细胞内环境稳定更为关键，或端粒酶的表达(18,17)。短端粒增加，以百分比衡量，可以预测哺乳动物的寿命与大多数与年龄相关的疾病相反。虽然大多数白细胞TL的测量通过flow-FISH或实时PCR进行亚群分析，Q-FISH提供了短端粒的平均长度单个端粒中位数长度的结果短端粒并概述端粒的比率缩短和寿命(13).

在本研究中，我们对TL进行了分析以及两种性别之间的TLS，没有发现统计数据男女之间存在显著差异。这一发现可能归因于该集团规模相对较小。A上一个Herrmann的研究等表明端粒更长女性体内雌激素水平升高会增加端粒酶活性和抗氧化作用(53).

本研究的局限性包括参与者的数量，以及并非所有的生活方式影响TL和端粒酶活性的参数有已确定。考虑到这一限制，NS的影响本文提出的TL强调了进一步对潜在机制的评估。

总之，在本研究中，我们证明NS可能影响短端粒的长度。短端粒是对细胞内环境稳定至关重要，也是唯一可靠的迄今为止，对短端粒分布的评估是Q-FISH。因此，本研究提供了证据证明抗氧化剂NS的作用与TL维持有关。未来的研究是需要重点关注NS影响的机制端粒缩短。

补充资料

基金

本研究由代谢组学医学股份有限公司资助。和Toxplus S.A.，并由克里特大学（ELKE编号4602、4920和3963）。

数据和材料的可用性

本研究中的数据集可用根据合理要求，从相应作者处获得。

作者的贡献

DT、PF、AT、DAS和DC构思并设计了研究并撰写手稿。PF、EV和AOD执行数据加工和质量控制评估。EvS、AKA和DN进行统计分析和数据解释。斯里兰卡解释了数据并对文章进行了批判性修改。EK和ErS进行了成像分析。所有作者均经过审查和批准提交之前的手稿，并已批准最终版本手稿。

道德批准和同意参与

本研究方案由病人和生物材料伦理委员会克里特大学，参考号：63/22.03.2019。生物学患者的材料和信息通过书面形式获得根据欧盟一般数据保护的知情同意法规（GDPR）。在涉及以下内容的研究中执行的所有程序人类参与者符合1964年的道德标准赫尔辛基宣言及其后来的修正案，或类似的道德标准。

患者同意发布

不适用。

相互竞争的利益

DAS是该杂志的主编，但没有个人参与审查过程，也没有任何影响就本文而言，就最终裁决而言。DT是Lumis Research SA和Natural Doctor的科学顾问其他作者声明没有相互竞争的利益。为了避免实验数据收集中的偏差由医学毒理学实验室进行克里特大学学院。Lumis Research SA和NaturalSA医生没有参与手稿的准备工作，研究结果和监督。

缩写：

致谢

本研究是博士论文特殊部分的一部分来自克拉约瓦医药学大学。作者感谢所有的行政、技术和医疗Toxplus、代谢组学医学健康诊所和毒理学实验室致力于此研究。

工具书类