本文中提到：

介绍

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六常见癌症，约为5年生存率50%(1).HNSCC患者的预后取决于肿瘤的表现以及淋巴结的存在转移和远处转移。大约三分之一患者出现早期疾病，而三分之二的患者伴有淋巴结转移的晚期癌症(2). 早期肿瘤用手术或放射治疗，预后良好。三十五到55%的晚期HNSCC患者仍然无病3标准治疗后数年(三). 然而，局部复发30–40%的患者出现（LRR），并发生远处转移在20–30%的HNSCC病例中(4).

晚期肿瘤的护理标准是手术联合辅助放射治疗和/或化疗。生存率很低（五年生存率为40-50%）这种治疗导致发病(5). LRR通常需要以下组合手术、放射治疗和/或化疗以及转移这种病用化学疗法治疗。然而，尽管如此治疗方法中，对LRR的控制很少。因此，解决与局部疾病将改善临床管理并减少HNSCC的负担。

热等离子体和非热等离子体是电离介质含有许多活性成分，包括电子和离子、自由基、反应分子和光子(6). 热等离子体已被广泛应用修改材料表面；这种修改通常是在真空中进行(7,8). 冷空气等离子体（CAP）是一种非热等离子体已被证明在杀菌照射和杀菌、伤口愈合、血液凝固、材料表面改性和交联，如以及治疗各种疾病，包括癌症(9–11).

与热等离子体相比，CAP可以达到较高电子温度，但与弱电离率(7).CAP中电子自碰撞的热力学平衡比电子之间的平衡快得多粒子，例如离子。因此，总等离子体温度为远低于接近室温的电子温度温度。冷等离子体已被用于生物医学研究可以达到接近室温的离子温度(12).

许多研究建议使用癌症治疗中的不同冷等离子体模式(10,13,14). 我们的实验室最近检查了手动CAP喷射装置的治疗潜力癌细胞系和肿瘤，显示选择性肿瘤根除细胞功能与凋亡信号通路的解除调控黑色素瘤细胞系和SCaBER荷瘤小鼠模型(15). 我们证明CAP可以可能提供一种微创手术方法用于特定癌细胞或肿瘤组织的清除而不影响周围的健康细胞和组织，从而使其成为有希望的癌症治疗技术。

尽管有广泛的潜在生物医学应用程序(16,17)感冒对细胞的特异性影响等离子体治疗在分子水平上尚不清楚(18). The generation of细胞内活性氧（ROS）导致细胞凋亡已由不同团体提出(19,20). 细胞坏死(11)和衰老(21)也被提议解释冷等离子体治疗癌细胞的机制。两个CAP高选择性的潜在机制可以归因于复杂的成分CAP以及癌症和正常细胞的不同特征。虽然尚未确定具体的行动机制，很明显，冷等离子体治疗可能更有效对某些肿瘤部位有益。

其选择性肿瘤根除能力CAP喷射装置使其成为一种潜在的有吸引力的佐剂HPV阴性口咽鳞癌的治疗因LRR表现出较高残留疾病率的患者与HPV阳性患者相比(22). 本研究的目的是检查不同暴露时间的CAP处理是否显示4例HNSCC和2例正常人的选择性肿瘤根除能力口腔上皮细胞系。

材料和方法

细胞培养

HNSCC细胞系（JHU-022、JHU-02、JHU 029、，SCC25）在RPMI-1640细胞培养基（Sigma，St。Louis，MO，USA）补充10%胎牛血清（Sigma）和Pen/Strep（100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素）（均来自美国纽约州格兰德岛的生命科技公司）。2个正常值口腔上皮细胞系（OKF6和NOKsi）生长于角质细胞-SFM（1X）补充角质细胞补充剂（均来自Gibco/Life Technologies）。所有细胞均取自约翰斯·霍普金斯大学头颈癌科细胞储存并在37°C、5%的大气中培养一氧化碳2.

冷等离子体处理

CAP设备，创建于工程学院和乔治华盛顿大学的应用科学，包含4个阻碍。块1为直流电源。2号楼是一个中央电源电极，接地外电极包裹在石英管，这是冷等离子体生产的一部分。区块3由电容器、晶体管和定时器组成；而块4是氦气供应，如前所述(6). 进行冷等离子体处理在8 kV电压下输出，使用10 l/min的氦气流量−1，带有从血浆源到细胞的3cm距离，以及治疗持续时间为10、30和45秒。

我们将细胞接种在96个板中并暴露他们将进行10、30和45秒的冷等离子体处理和氦气流量20 l/min−110秒作为阳性治疗控制(图1). 以下治疗时，我们将细胞转移到2组6孔板中用于MTT和克隆形成分析的细胞系。

图1 （A） 冷等离子体是电离气体，单位为英寸这种情况下，氦是在接近室温的温度下产生的温度。等离子射流是不连续的，代表一系列正在传播的等离子子弹。（B） 本研究的治疗在8 kV电压下，使用20l/min−1，等离子体源距离96个板中暴露的细胞。

MTT和克隆原测定

在电镀细胞上进行MTT分析（Sigma）根据制造商的要求，冷等离子体应用后48小时并测量570nm处的吸光度。克隆形成的或在治疗7天后进行菌落形成分析冷等离子体；用晶体染色观察菌落紫色（西格玛）。

免疫印迹法

进行PARP切割的蛋白质印迹分析冷等离子体处理后48小时：细胞裂解物在三甘氨酸凝胶上用SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA）用TBS-T+5%脱脂奶粉和在4°C下与PARP特异性抗体孵育过夜（美国得克萨斯州达拉斯市圣克鲁斯生物技术公司）。膜用辣根过氧化物酶结合物清洗和培养次级抗体。蛋白质检测通过增强化学发光。

结果

MTT分析结果显示，冷血浆选择性降低SCC25和JHU-O28 HNSCC的活性剂量-反应方式的细胞(图2A). JHU-O22和JHU-O39细胞仅在30和45秒治疗。OKF6细胞的活性不受冷血浆，而NOKsi细胞系的活性为治疗30秒和45秒后略有减轻(图2B). 菌落的结果形成分析也显示了细胞对寒冷的特异性反应等离子应用。暴露在氦气流中10秒没有阻止菌落形成。JHU-O28和JHU-O39细胞未形成用冷血浆治疗3名患者后的任何菌落不同的时间段(图3).JHU-O22、SCC25和OKF6细胞仅在以下情况下形成集落冷等离子体处理10秒(图3). NOKsi细胞形成集落在所有3个时间段用冷等离子体治疗后（数据未显示）。Western blot分析没有提供证据表明冷等离子体处理后PARP发生裂解(图4)表明冷等离子体应用可能通过以下途径导致选择性细胞死亡HNSCC中的非凋亡途径。

图2 冷后48小时MTT检测结果等离子应用。（A） 头颈部鳞状细胞的存活率癌（HNSCC）细胞系显示冷血浆具有选择性SCC25和JHU-O28细胞在剂量反应方式。（B） 正常口腔细胞的存活率结果线。正常口腔上皮细胞系OKF6和NOKsi不受冷等离子体的影响。

图3 代表性菌落形成测定用于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系（JHU-022、JHU-028、JHU-029和SCC25）和正常口腔上皮细胞系（OKF6）。

图4 48小时后Western blot分析接触冷等离子体。污点没有证据表明冷等离子体处理后PARP发生裂解。

讨论

本研究的主要目的是评估HNSCC细胞系冷等离子体的选择性及其机制这种选择性的基础。我们的结果表明冷等离子体该应用通过以下途径选择性地损害一些HNSCC细胞系非凋亡机制，因为PARP的裂解不是处理后的细胞发生显著变化对正常口腔上皮细胞系的影响。

许多研究表明冷等离子体对癌症影响的分子机制细胞。几个在体外机制被认为是与细胞表面表达减少有关蛋白质，如整合素和FAK：细胞分离，诱导细胞凋亡、衰老诱导和活性氧的生成(17,20,21,23–25). 肿瘤的选择性反应细胞对CAP的反应也可能是由于细胞周期的阶段性。它是已知S期癌细胞百分比较高这可能会使癌细胞更多如308所示，易受CAP的影响和PAM 212癌细胞系(26).

黑色素瘤、膀胱癌、，发现用冷血浆治疗神经母细胞瘤和胶质瘤减少肿瘤体积，提高生存率(15,17,27). 此外，尽管有些肿瘤复发后，其生长速度与肿瘤相比降低在未经治疗的小鼠中。

目前在体外我们观察到冷等离子体应用选择性地靶向HNSCC细胞JHU-O28和SCC25，而它对JHU-022和JHU-02细胞，对正常口腔的影响最小腔上皮细胞系。这些机制似乎涉及非凋亡途径，因为未检测到PARP的裂解冷等离子体处理后。中等影响的一个原因HNSCC JHU-022和JHU-019电池可能是由于低温血浆诱导的TP53失活。在这方面，斯金纳et（等）铝显示出破坏性TP53型突变渲染头部和颈部癌细胞对辐射治疗更具抵抗力(28). 由于冷等离子体的作用尚不清楚，人们很容易推测冷等离子体诱导-TP53型突变也可能导致对冷等离子体治疗的抵抗。然而，我们的数据提示一种独立于p53的作用机制，如冷血浆无论p53状态如何，对HNSCC的影响不同这些细胞；3个JHU细胞系表达野生型p53(29,30)而SCC25细胞表达突变第53页(31).

HNSCC中LRR的控制是重要的临床管理目标。未能实现此目标导致与持续或原发肿瘤部位或区域淋巴的复发性疾病节点。此外，患者也可能发生转移性疾病由于原发肿瘤在最初诊断或从治疗耐药持续/复发局部疾病。这两种临床情况（持续/复发的局部或转移性疾病）代表极为困难的管理问题(32). 抢救治疗是可能的，但经常不成功，尤其是在患者中结束时或结束后6个月内，肉眼可见疾病首次放化疗。抢救治疗通常需要急性和长期发病率(33). 全身转移性疾病可能是通过细胞毒性化疗、生物制剂或低剂量缓解放射治疗，但仍无法治愈，中位生存率为大约6-9个月(34).其他治疗方法包括同步放化疗，以及放射治疗和靶向治疗相结合（例如EGFR抗体，西妥昔单抗）(35,36).然而，尽管有这些治疗方法，局部控制而存活率仅略有增加。

HPV阴性HNSCC患者死亡率为主要由肿瘤细胞的放射抗性导致LRR。患有以下疾病的患者的总体生存率和疾病特异性生存率较高HPV阳性HNSCC肿瘤(37),作为一种独特的分子和病理亚型每个肿瘤平均有4个体细胞突变，而HPV阴性的HNSCC肿瘤港20。HVP阳性的HNSCC患者有不同的与HPV阴性患者相比，其分子特征可能会调节它们对冷等离子体的敏感性。例如，HPV阳性HNSCC患者通常没有TP53型肿瘤的突变，但这些患者的细胞周期仍被解除管制，因为E6 HPV蛋白沉默TP53(38,39).CDKN2A型，校长细胞周期素依赖性激酶抑制剂，可减缓细胞周期，在HPV阴性HNSCC中丢失(40)并在HPV阳性HNSCC中扩增(41). 所有HNSCC细胞系我们在本研究中使用的是HPV阴性。因此，冷等离子体可能成功用作HPV阴性HNSCC的辅助治疗有或无p53突变的患者。

在王最近的一项研究中等(6)结果表明，由于复杂的CAP的组成和参数，对癌细胞可能会发生变化。事实上，组成CAP作为各种活性氧、活性氮物种、电荷粒子和UV以及参数，如电压、电阻、，等离子体发射和功率可以改变细胞对处理，从而促进带电粒子和活细胞，触发细胞内生化反应。在王的研究中等，CAP优化处理参数以选择性地杀死人类转移性乳腺癌（BrCa）细胞，但影响最小健康人骨髓间充质干细胞(6). 同样，在本研究中，我们表明将CAP的设置微调为专门针对癌细胞，同时保留邻近正常细胞组织未受损。

冷等离子体治疗是一种替代方法指选择性靶向HNSCC细胞对正常邻近组织的影响及可行的治疗如果与内窥镜技术相结合，则采用该策略。也可能是潜在用于一线根除小型恶性肿瘤恶性肿瘤的生长和辅助放射治疗手术前的组织和手术后的边缘。寒冷血浆是一种替代性辅助治疗，可能导致LRR降低，尤其是在HPV阴性患者中因此，需要进一步调查。

致谢

这项研究得到了国家癌症组织的支持学院拨款（U01CA84986和K01CA164092）。

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