Interaction of TSG101 with the PTAP Motif in Distinct Locations of Gag Determines the Incorporation of HTLV-1 Env into the Retroviral Virion

doi:10.3390/ijms242216520

.2023年11月20日；24(22):16520.

doi:10.3390/ijms242216520。

TSG101与Gag不同部位PTAP基序的相互作用决定了HTLV-1 Env与逆转录病毒的结合

前田洋介¹, Kazuaki Monde公司¹, Hiromi Terasawa先生¹, 田中悦（Yuetsu Tanaka）², Tomohiro Sawa先生¹

附属公司

PMID： 38003710
预防性维修识别码：项目经理10671467
内政部： 10.3390/ijms242216520

TSG101与Gag不同部位PTAP基序的相互作用决定了HTLV-1 Env与逆转录病毒的结合

前田洋介等。国际分子科学杂志. 2023.

.2023年11月20日；24(22):16520.

doi:10.3390/ijms242216520。

作者

前田洋介¹, Kazuaki Monde公司¹, Hiromi Terasawa先生¹, 田中月子², Tomohiro Sawa先生¹

附属公司

¹日本熊本860-8556，熊本大学生命科学学院微生物系。
²日本冲绳903-0215琉球大学医学研究生院免疫学系。

PMID： 38003710
预防性维修识别码：项目经理10671467
内政部： 10.3390/ijms242216520

摘要

已知人类嗜T细胞病毒1型（HTLV-1）主要通过细胞间接触传播，因为无细胞病毒的传染性较低。然而，无细胞HTLV-1感染不良的原因尚不清楚。在本研究中，我们发现当使用人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）产生病毒时，带有HTLV-1病毒包膜糖蛋白（Env）的假型逆转录病毒具有传染性。我们发现，当使用HTLV-1 Gag生产VLP时，HTLV-1 Env与类病毒颗粒（VLP）的结合率较低，而使用HIV-1 Gag生产的VLP有效地结合了HTLV-1 Env。利用HTLV-1和HIV-1 Gag之间的Gag嵌合体和HIV-1Gag的缺失突变体生产VLP表明，HIV-1gag的p6结构域负责将HTLV-1 Env有效地并入VLP。对HIV-1 Gag p6结构域的进一步诱变分析表明，HIV-1 Gag p6区域中的PTAP基序有助于HTLV-1 Env并入VLP。由于已知PTAP基序在萌芽过程中与肿瘤易感基因101（TSG101）相互作用，我们评估了TSG101敲除对HTLV-1 Env并入VLP的影响。我们发现TSG101基因敲除抑制了HTLV-1 Env与VLP的结合，并降低了HTLV-1Env假型的无细胞HIV-1的感染性。我们的结果表明，TSG101与逆转录病毒L结构域PTAP基序的相互作用不仅参与出芽过程，而且还参与HTLV-1 Env有效并入无细胞病毒。

关键词：HTLV-1；PTAP；TSG101；传染性；逆转录病毒Gag。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
HIV-1和HTLV-1的无细胞和细胞间感染，以及不同环境下的假型病毒感染。(A类)将相同体积的转染HTLV-1-inGLuc和HIV-1-inGLuc的293T细胞培养上清及其各自的包装载体和Env表达质粒用于NP-2/CD4/CCR5/CXCR4细胞的无细胞感染。将转染细胞加入NP-2/CD4/CCR5/CXCR4细胞进行细胞间感染。在感染48小时后测量无细胞和细胞间感染的高斯荧光素酶活性。无细胞病毒感染性分别通过HTLV-1和HIV-1的每1ng p24-Ag的萤光素酶活性来标准化。将未转染的293T细胞作为非病毒对照。柱和条形分别表示三次试验的平均值和标准偏差(**第页< 0.01, ***第页<0.001使用未配对t吨-测试）。(B类)转染HTLV-1-inGLuc或HIV-1-inGLuc载体的293T细胞产生的假型病毒；使用不同的Env进行NP-2/CD4/CCR5/CXCR4细胞的无细胞感染。感染48 h后，测定感染细胞培养上清的高斯荧光素酶活性。通过HTLV-1和HIV-1每1 ng p24 Ag的荧光素酶活性分别对假型病毒感染性进行标准化。柱和条形分别表示三次试验的平均值和标准偏差(*第页< 0.05, **第页<0.01使用未配对t吨-测试）。

图2
HTLV-1 Env在无或存在逆转录病毒Gag的情况下的表达水平和融合活性，以及HLTV-1 Env并入逆转录病毒Gag产生的VLP的效率。(A类)用对照Venus载体（橙色）、HTLV-1-Gag-Venus（蓝色）和HIV-1-Gag-Venas（绿色）将HTLV-1 Env表达质粒转染293T细胞。转染24小时后，回收细胞并用抗gp46、LAT-27的单克隆抗体染色。用流式细胞术分析静脉阳性细胞群。红色表示缺乏抗体染色（对照）。(B类)用对照FLAG载体、HTLV-1-Gag-FLAG和HIV-1-Gag-FLAG质粒将HTLV-1 Env表达质粒转染293T细胞。转染24小时后，恢复转染细胞并将其添加到TZM-bl细胞中。混合细胞在共培养24小时后测定荧光素酶活性。柱和条分别表示四份实验的平均值和标准偏差(***第页<0.001使用未配对t吨-测试）。(C类)使用抗FLAG、LAT-27和抗CypA抗体通过Western blotting分析转染对照载体HTLV-1-Gag-FLAG或HIV-1-Gag-FLAG-HTLV-1 Env的293T细胞产生的细胞裂解物和VLP。箭头显示了Env蛋白的~53-kDa大小。分子质量标记（kDa）的位置显示在右侧。

图3
HTLV-1 Env并入HTLV-1和HIV-1 Gag嵌合体以及HTLV-1与HIV-1 Gag突变体中产生的VLP的效率。(A类)HTLV-1和HIV-1 Gag之间嵌合体和HTLV-1与HIV-1 Gag中突变体的示意图。(B类)用抗FLAG、LAT-27和抗CypA抗体进行Western blotting分析转染HTLV-1 Env的293T细胞的细胞裂解产物和VLP，以及HTLV-1与HIV-1 Gag的嵌合物或HTLV-1和HIV-1 Gag的突变体。箭头显示了Env蛋白的~53-kDa大小。分子质量标记（kDa）的位置显示在右侧。

图4
HTLV-1 Env并入HIV-1 p6 Gag突变体产生的VLP的效率。(A类)HIV-1-Gag p6结构域缺失和突变的示意图。野生型p6结构域的氨基酸序列显示为PTAP和YPXL基序。破折号表示氨基酸的同一性。(B类)使用抗HA和抗β-肌动蛋白抗体，通过Western blotting分析转染1μg p6-Gag缺失的293T细胞和不同量pAdVantage（0、1和2μg）突变体产生的细胞裂解物和VLP。(C类)用抗HA、LAT-27和抗β-肌动蛋白抗体进行Western blotting分析转染1.5μg HTLV-1 Env和3.5μg p6缺失和HIV-1-Gag-HA突变体的293T细胞产生的细胞裂解物和VLP。箭头显示了Env蛋白的~53-kDa大小。分子质量标记（kDa）的位置显示在右侧。

图5
HTLV-1 Env在HIV-1-Gag VLP中的掺入，以及HIV-1 Gag伪型与TSG101或ALIX敲除的293T细胞中产生的HTLV-1 Env的无细胞和细胞间感染性。(A类)用抗TSG101抗体和抗ALIX抗体通过Western blotting分析TSG101和ALIX在shRNA靶向对照转导的293T细胞中的表达水平。用HIV Gag FLAG和HLTV-1 Env转染敲低的293T细胞，转染48小时后回收得到的细胞裂解物和VLP，并使用抗FLAG、LAT-27和抗β-肌动蛋白抗体通过Western印迹进行分析。箭头显示了Env蛋白的~53-kDa大小。分子质量标记（kDa）的位置显示在右侧。(B类)TSG101或ALIX敲低293T细胞用于用HIV-1包装载体和HTLV-1 Env表达质粒在GLuc中产生HIV-1。相同体积的转染细胞培养上清用于NP-2/CD4/CCR5/CXCR4细胞的无细胞感染。将转染细胞加入NP-2/CD4/CCR5/CXCR4细胞进行细胞间感染。在无细胞培养和细胞间感染培养48小时后，测量产生的培养上清液的Gaussia荧光素酶活性。通过HIV-1每1 ng p24 Ag的荧光素酶活性标准化无细胞病毒感染性。用对照shRNA载体（shCon）转导的293T细胞作为对照。柱形图和条形图分别显示了三次实验的平均值和标准偏差(**第页<0.01使用未配对t吨-测试）。

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