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.2012年9月；8（9）：e1002945。
doi:10.1371/journal.ppat.1002945。 Epub 2012年9月27日。

体温下生长的铜绿假单胞菌单核苷酸解析转录组

奥姆里·伍泽尔 1, 黛博拉·R·约德-希姆斯, 韩国, 阿贾伊·丹德卡, 萨里特·爱德海特, E彼得·格林伯格, 罗特姆·索雷克, 斯蒂芬·洛里
附属公司

体温下生长的铜绿假单胞菌单核苷酸解析转录组

奥姆里·伍泽尔等。 公共科学图书馆-病理学. 2012年9月.

摘要

机会性病原体的特征之一是它们能够调节和应对各种环境和宿主相关条件。人类病原体铜绿假单胞菌能够在多种宿主中生长，并在宿主防御能力受损或囊性纤维化的个体中引起一系列急性和慢性感染。在这里，我们报告了该生物体在宿主相关温度下生长时的深度转录图谱。使用在28°C和37°C下生长的铜绿假单胞菌样本的RNA-seq，我们检测到在哺乳动物宿主的体温下优先表达的基因，这表明它们在感染过程中发挥作用。这些温度诱导的基因包括III型分泌系统（T3SS）基因和效应子，以及负责吩嗪生物合成的基因。通过RNA-seq进行全基因组转录起始位点（TSS）定位，我们能够准确定义许多基因的启动子和顺式作用RNA元件，并发现了新基因和以前未被识别的非编码RNA，它们直接由LasR群体感应调节器控制。总的来说，我们鉴定了165个小RNA和380多个顺反义RNA，其中一些预测具有调节功能，并发现非编码RNA优先定位于致病岛和水平转移区域。我们的工作确定了铜绿假单胞菌基因的调控特征，其产物在感染期间的环境适应中发挥作用，并为该病原体提供了参考转录环境。

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数字

图1
图1。不同温度下毒力相关基因的表达。
已知与毒力相关的基因的相对表达（下载自毒力因子数据库[89]）通过RNA-seq在28℃和37℃下进行测量和比较。表达由重复样本的基因长度和库大小标准化的测序读取计数表示。每个点代表一个基因，根据其毒力相关功能进行颜色编码。灰色虚线表示37°C（上线）和28°C（下线）条件下的2倍过度表达。
图2
图2。选定毒力因子的温度调节表达。
（A） 的T3SS铜绿假单胞菌在37°C下感应。编码T3SS成分的基因的转录水平；其监管机构；分泌效应器ExoT，Y，U；和监护人SpcU。在两个生长温度下，每个基因的标准化基因表达（材料和方法）用每个基因的条表示（绿色和红色，分别为37°C和28°C）。日志2-37°C和28°C表达的比率用每个基因的菱形表示[红菱形表示统计显著差异（χ2，p<0.05），而蓝钻石标记的基因没有超过显著性阈值。由代表钻石之间的线连接的基因是同一转录单位（TU）的一部分。误差线表示与平均值的单个标准偏差。水平红色箭头表示TU及其绞线方向（分别为右和左、正向和反向绞线）。（B） T3SS分泌蛋白和外蛋白在PA14和PAO1菌株中的表达分析。使用SDS-PAGE分离37或28°C（分别标记为37或28）培养物中的细胞（顶面板）和分泌（中面板和下面板）蛋白质，然后使用针对PscC（α-PscC）、ExoU（α-ExoU）或ExoS（α-Exes）的抗体进行Western免疫印迹。分子蛋白质标准物的迁移以千道尔顿为单位。用α-PscC抗体探测的所有印迹上的共同带代表一种交叉反应蛋白。（C） 吩嗪生物合成操纵子基因的表达。与奋乃静生物合成操纵子中的基因（黑色箭头）对应的标准化测序读取数显示在37°C和28°C（分别为红线和蓝线）。操纵子中检测到的TSS显示为黑色垂直线（箭头分别表示转录链的左右、正向和反向；数字表示TSS的基因组位置）。在TSS上游52 nt处发现了一个回文LasR结合位点电话A1-G1操纵子和TSS下游54 ntphzM公司（D）在促进吩嗪生物合成前体的途径中，酶的基因表达。
图3
图3。温度对绿菁和PQS生产的影响。
培养物的生长动力学铜绿假单胞菌PA14在外径处进行监测。600在28°C和37°C从指数相（E/S）过渡到固定相（S/S）和固定相（S）时测定了绿脓苷（A）和PQS（B）的水平。类似生长的文化铜绿假单胞菌Δ菲律宾比索和ΔpqsA基因分别用作绿脓杆菌素和PQS生产的阴性对照。
图4
图4。识别新的LasR结合位点。
（A） 与TSS相关的基因LasR盒的位置。大多数LasR结合位点（LasR盒）位于基因TSS上游51–52 nt处。结合位点显示为TSS上游的一条线（蓝色、红色和紫色；新的结合位点、先前已知的结合位点和具有多个结合位点的基因）。（B） 激光盒（蓝线）的位置紧邻西格玛因子结合位点（绿线）的上游。黑色箭头表示TSS。（C） 预测的LasR调节基因DNA片段的EMSA。每个分析中使用的纯化LasR的浓度显示在反应的上方。基因启动子区的DNA片段相对安全水平和来自hrpA（驻车辅助系统）基因分别作为阳性对照和阴性对照。
图5
图5。LasR和RhlR在调节绿脓杆菌素生物合成中的作用。
（A） LasR和/或RhlR结合位点的位置显示在顶部。结合序列以红色突出显示，结合序列中的星号表示回文结合位点正向和反向序列之间的核苷酸一致性；不相同的位置用箭头标记。此外，还显示了LasR、RhlR识别的一致序列以及从先前研究中获得的LasR-RhlR盒序列。（B） 的增长（线）和活动lacZ公司报告子（条）融合到哲学博士野生型操纵子铜绿假单胞菌PA14，Δ激光雷达和Δ相对湿度菌株。（C） 中的启动子活动大肠杆菌; （i） 启动子片段与lacZ公司转录报告子（显示在面板左上角）和（ii）表达激光雷达（pJTT201，表示为pLasR）或相对湿度（pJTT202，表示为pRhlR）或空矢量pMMB67。酰基高丝氨酸内酯3OC12-HSL（2µM）和C4-如图所示添加HSL（10µM）。这个相对安全水平先前显示直接结合LasR的启动子被用作阳性对照，而含有mvfR（百万英尺/小时）基因启动子作为阴性对照。
图6
图6。温度调节基因、反义RNA转录片段和基因间小RNA在小鼠基因组中的分布铜绿假单胞菌第14页。
外圆代表前面定义的核心（蓝色）和辅助基因（黄色）。最里面的两个圆圈表示在28℃和37℃下差异表达的基因（蓝色和橙色，分别在28℃与37℃上调）；中间的两个圆圈显示来自基因间区（红点）和asRNAs（绿点）的sRNAs表达。对于每个类别，表达的相对排名被分为五个颜色编码的箱子（较深的颜色代表较高的表达）。
图7
图7。激光调节小RNA Lrs1和Lrs2的特性。
（A） 生长（线条）和表达lrs1或lrs2号机组报告者以野生型或Δ构造（条）lasR铜绿假单胞菌图中显示了PA14。（B） Hfq在控制Lrs1和Lrs2 sRNA水平中的作用。显示了sRNAs与纯化Hfq量增加相互作用的凝胶位移分析。除了标记的探针外，两个面板中的泳道5还含有100倍过量的未标记Lrs1或Prrf1 RNA铜绿假单胞菌野生型和Δ高频振荡器Prrf1和RsmZ分别作为sRNA与Hfq相互作用和不相互作用的阳性和阴性对照。
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