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.2009年10月；5（10）：e1000601。
doi:10.1371/journal.ppat.1000601。 Epub 2009年10月2日。

白细胞中信息素选择性上调的基因参与白色念珠菌生物膜的形成

尼迪·萨赫尼 1, 宋毅, 卡拉·丹尼尔斯, Thyagarajan Srikantha公司, 克劳德·普约尔, 大卫·R·索尔
附属公司

白细胞信息素选择性上调基因参与白念珠菌生物膜形成

尼迪·萨赫尼等。 公共科学图书馆-病理学. 2009年10月.

摘要

为了交配，酵母病原体白色念珠菌的MTL纯合菌株必须从白色阶段切换到不透明阶段。然后，交配型不透明细胞释放信息素，在交配型相反的不透明细胞中诱导极化、G1阻滞和接合管形成。信息素还诱导交配不活跃的白细胞变得粘着，形成更厚的生物膜，促进交配。白细胞的信息素反应途径与不透明细胞的上游成分相同，但靶向不同的转录因子。在这里，我们证明白细胞中信息素上调的基因通过一个共同的顺式作用序列WPRE被激活，这与负责不透明细胞中上调的顺式反应序列OPRE不同。此外，我们发现这些白细胞特异性基因在白细胞生物膜形成中发挥作用，并且在没有额外信息素来源的情况下对生物膜形成至关重要，这表明这可能是一种自分泌或信息素无关的机制。这些结果表明，切换、交配和MTL纯合白细胞生物膜形成之间存在密切、复杂和独特的关系，后者是白念珠菌的一个推定毒力因子。

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数字

图1
图1。在白色a/a细胞中发现12个基因被α-信息素强烈上调，但在不透明的a/a细胞内没有。
每个基因的启动子中都含有一个或多个假定的白特异性信息素反应元件（WPRE）。A.在不存在（−）和存在（+）α-信息素（α-ph）的情况下，对白色和不透明A/A细胞中12个基因表达的Northern分析，在103个基因的筛选中鉴定为强烈上调。B.序列被认为是代表面板A中12个选定的白特定基因启动子中假定的白特定信息素反应元件（WPRE），在Multiple for Motif Elicitation（MEME）软件中使用≤0.001的高严格性E值阈值。小组底部给出了WPRE的共识顺序。C.序列考虑了六个基因启动子中假定的不透明特异性信息素反应元件（OPRE），在不透明细胞中信息素选择性上调，在MEME程序中使用0.001的阈值。OPRE的共识序列显示在小组底部。D.不透明细胞和白细胞中α-信息素上调的基因同时含有OPRE和WPRE。给出了与一致序列同源性最高的OPRE和WPRE序列相对于面板B、C和D中起始密码子的位置。
图2
图2。Eap1、Pga10、Csh1和Pbr1的定位以及WPRE在转录诱导中的作用。
A.GFP可视化显示Eap1和Pga10主要定位于细胞表面，Csh1和Pbr1在α-信息素诱导下主要定位于胞浆。补体菌株EAP1（EAP1） WPREΔ-EAP1/EAP1型,PGA10型 WPREΔ-PGA10/PGA10,CSH1型 WPREΔ-CSH1/CSH1型和PBR1型 WPREΔ-PBR1/PBR1对在羧基末端标记GFP的。B.在α-信息素缺乏（−）和存在（+）的情况下，对四个基因的亲本控制、缺失突变体和补充菌株的mRNA水平进行北方分析。C.信息素诱导表达的Northern分析CSH1型和PBR1型缺失突变体在α-信息素（α-ph）缺乏（−）和存在（+）的情况下，缺失高一致性（强）WPRE和低一致性（lc）WPRE，lcWPRE。D.信息素诱导表达的西方分析CSH1型和PBR1型在缺失突变体中，如C组中，使用抗GFP抗体。
图3
图3。基因上调CPH1（CPH1）和MFA1型byα-信息素需要不透明特异性信息素反应元件OPRE。
A.GFP可视化显示Cph1定位于假定的细胞核。应变CPH1（CPH1） OPREΔ-CPH1/CPH1具有C端GFP标记的用于分析。B.亲本对照、缺失突变体和补体菌株RNA水平的北方分析CPH1（CPH1）在不存在（−）和存在（+）α-信息素（α-ph）的情况下。C.亲本对照、缺失突变体和补充菌株RNA水平的北方分析MFA1公司在α-信息素（α-ph）缺乏（−）和存在（+）的情况下。
图4
图4。基因EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和PBR1型α-信息素诱导的shmoo形成或交配不需要。
A.对照菌株和突变菌株对3×10处理4小时后shmoo形成的定量−6Mα-信息素（化学合成13-mer）。对至少1000个细胞（四个独立实验的总和）进行了分析，并给出了shmoo形成百分比的平均值±标准偏差。N.S.，不显著。B.对照和突变不透明细胞之间融合的定量，以及交配伴侣WO-1的不透明α/α细胞。对每个菌株的至少2000个细胞（四个独立实验的总和）进行了分析，并给出了百分比的平均值±标准偏差。C.shmoo形成的示例。D.与α/α菌株WO-1.−，α-信息素缺失；+，α-信息素的存在。C和D中的比例尺代表4µm。
图5
图5。基因EAP1（EAP1）,第10页,CSH1型和PBR1型这些都在α-信息素诱导的白细胞粘附中起作用。
A.在α-信息素（α-ph）不存在（−）和存在（+）的情况下粘附在井底的细胞的定量。给出了三个盘子的平均值±标准偏差（误差条）。B.对照菌株和突变菌株清洗后的井底示例。
图6
图6。基因EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和PBR1型在缺乏或存在少数不透明细胞的情况下，所有这些都是白色a/a细胞生物膜发育所必需的。
A.对于四个测试基因的补体对照菌株、纯合缺失菌株和WPRE缺失菌株，在缺少（−Op）和存在（+Op）10%不透明细胞的情况下，以µm为单位测量生物膜厚度。不透明细胞为半a/a和α/α。对于每种菌株和条件，通过三个随机区域分析三个单独的生物膜，提供九个测量值。提供了在没有（−）和存在（+）10%不透明细胞（Op）的情况下进行测量的P值。在补充表S7中，给出了p值，以比较补体对照和两个缺失突变体。B.在不透明（Op）细胞不存在（−）或存在（+）的情况下，四个测试基因的亲本菌株P37005、互补对照菌株、纯合突变体和WPRE缺失突变体的生物膜组成的比较。最大基质染色代表++++，最小基质染色代表+。白细胞基底层（Wh细胞基底层）的存在或不存在分别表示为+或-。最大和最小菌丝密度（Hyph.des）分别表示为++++和+。菌丝方向（Hyph.orient.）要么垂直（vert.），要么相互缠绕（int.），要么水平（hor.）。C、 D.扫描生物膜基底层和菌丝区的共聚焦显微图像EAP1（EAP1）补体控制和WPRE缺失突变体EAP1（EAP1）E.生物膜上清液的β-葡聚糖测量F.用于测量厚度的像素强度扫描示例，用于补充对照和WPRE缺失突变EAP1（EAP1）分别是。
图7
图7。删除EAP1（EAP1）或PBR1型对信息素的调节没有影响STE2型,MFA1公司,CSH1型、和EAP1（EAP1）或PBR1型表达，如northern杂交所示。
A.四个基因在EAP1（EAP1）α-信息素缺失（−）或存在（+）的突变体。B.四个基因在PBR1型α-信息素缺失（−）或存在（+）的突变体。为了证明负载水平，18S rRNA水平显示为不透明和白色。
图8
图8。的过度表达PBR1型异位部位ADH1（ADH1）在亲本菌株和WPRE缺失突变体中EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和PBR1型，在缺乏α-信息素和EAP1（EAP1）,PGA10型和CSH1型表达式。
A.Northern分析表明100µg/ml多西环素（Dox）诱导PBR1型在α-信息素（α-ph）缺乏（−）和存在（+）的情况下，转录相似。B.控制菌株P37005-tet的白细胞粘附在微孔底部的示例PBR1型和CSH1型WPRE缺失突变体CSH1型WPREΔ/csh1型-泰特PBR1型在缺乏（−）或存在（+）多西环素的情况下。C.井底粘附性的定量。D.Northern分析证明用突变体的信息素进行处理cek1/cek1 cek2/cek2对α-信息素的完全粘附反应所需的四个测试基因的表达不会增加。E.证明错误表达PBR1型在突变体中cek1/cek1 cek2/cek2其中三个基因，EAP1（EAP1）,PGA10型,CSH1型和本地人PBR1型该基因未上调，导致粘附增加，为对照细胞的33%。因此，这种增加与α-信息素处理无关cek1/cek1 cek2/cek2突变体。
图9
图9。信息素诱导的不透明（A）和白色（B）反应调控途径的更新模型，包括通过不透明和白色特异性信息素反应元件OPRE（A）与WPRE（B）上调的下游基因。
该模型还包括在不透明和白色反应中上调的基因，因此在其启动子中同时包含OPRE和WPRE。这两条通路通过MAP激酶级联共享来自受体的相同成分。然而，有两个不同之处，用红色圈出。首先，第一细胞内环路（ICI）的一个额外区域对白色反应是必要的，而不是不透明反应。其次，该途径靶向的转录因子是CPH1（CPH1）在不透明的反应中，白色反应中还有一个未知的因素。
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