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.2009年7月；23(7):2186-96.
doi:10.1096/fj.08-128066。 Epub 2009年2月26日。

一种新的促肾上腺皮质激素释放因子受体剪接变异体显示显性负活性：与应激性心脏病的推测联系

叶赫兹克尔·斯泰伯格（Yehezkel Sztainberg） 1, 耶尔·库佩尔曼, 奥尔娜·伊斯勒, Shosh Gil公司, 琼·沃恩, 让·里维尔, 怀利谷, 阿隆·陈
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一种新的促肾上腺皮质激素释放因子受体剪接变异体显示显性负活性：与应激性心脏病的推测联系

叶赫兹克尔·斯泰伯格（Yehezkel Sztainberg）等。 美国财务会计准则委员会J. 2009年7月.

摘要

越来越多的实验和临床研究支持心理压力与心血管疾病之间的密切联系。促肾上腺皮质激素释放因子受体2β（CRFR2β）在心脏生理学中起着重要的内源性心脏保护作用。在这里，我们报告了从小鼠（m）心脏分离出编码新CRFR2β剪接变异体的cDNA。该插入变体（iv）-mCRFR2beta亚型的翻译产生421-aa蛋白，该蛋白包含一个独特的C末端细胞质尾部。我们的功能分析和细胞定位研究表明，当与野生型mCRFR2beta共表达时，iv-mCRFR2beta通过ER-Golgi复合物滞留显著抑制野生型mFRFR2bea膜的表达及其功能信号传导，表明存在剂量依赖性显性负效应。有趣的是，与非应激对照小鼠相比，暴露于慢性可变应激（人类慢性心理应激模型）4周的小鼠心脏中mCRFR2beta水平显著降低，iv-mCRFR2beta mRNA表达水平显著升高。iv-mCRFR2beta的显性负效应及其由心理应激引起的上调提示了mCRFR2beta心脏保护作用的一种新的调节形式，以及这种新的亚型在应激性心脏病中的潜在作用。

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数字

图1。
图1。
iv-mCRFR2β的序列和示意结构表示。一个)mCRFR2基因结构示意图，包括插入内含子13的外显子的核苷酸和翻译氨基酸序列。B类)已知mCRFR2β功能转录物（顶部）和新的iv-mCRFR2？亚型的结构示意图。翻译起始点（ATG）的位置在两份成绩单中都有标明。外显子编码N端胞外结构域、7个跨膜结构域和C端细胞质结构域。阴影框表示5′-和3′-未翻译区域；打开的框表示编码区域。C)含有已知mCRFR2β转录物（克隆1、2和4）和127-bp-longer iv-mCRFR2？转录物（clone 3）的pCRII-TOPO载体电泳分析的代表性图像，该转录物是从小鼠心脏分离出来的。用于iv-mCRFR2β分离的寡核苷酸引物位置见一个（P，底漆；RP，反向底漆）。D类)mCRFR2β和iv-mCRFR2？的氨基酸序列示意图，显示了一个独特的35-与。iv-mCRFR2β和mCRFR2？的46-aa胞内尾部。
图2。
图2。
iv-mCRFR2β转录物在小鼠心脏中的表达。一个)mCRFR2β、iv-mCRFR2？和核糖体蛋白S16 mRNA半定量RT-PCR电泳分析的代表性图像。B类)使用合成肽片段编码iv-mCRFR2β（aa 396-420）独特的C末端尾部在兔子体内制备的高特异性抗血清用于免疫印迹分析、细胞免疫染色和免疫组织化学(一). 瞬时转染COS-M6细胞分离的iv-mCRFR2β蛋白的Western免疫印迹(b条). 通道1、2和3分别对应于空的控制向量、iv-mCRFR2β和mCRFR2？结构体。C)瞬时转染iv-mCRFR2β构建物的COS-M6细胞的免疫荧光染色及抗iv-mCRFR2β血清和Cy3-结合二级抗体的染色(b条). 用空白对照载体瞬时转染细胞(一)或mCRFR2β-myc(c（c）)用抗iv-mCRFR2β血清染色，然后用Cy3-结合二级抗体染色，未显示任何染色。相同的mCRFR2β-myc瞬时转染细胞用单克隆抗myc抗体染色，然后用Cy2结合二级抗体染色(d日).D类)从心脏（右车道）或皮肤（左车道）组织提取物分离的iv-mCRFR2β蛋白的Western免疫印迹。E类)小鼠心脏iv-CRFR2β的免疫过氧化物酶染色(一,c（c）). 对照切片与正常兔血清孵育未导致任何染色(b条,d日).
图3。
图3。
iv-mCRFR2β的功能分析和细胞定位。一个)瞬时转染mCRFR2β或iv-mCRFR2？的HEK293T细胞中Ucn 2激活cAMP反应元件-核糖核酸酶报告子。将含有EVX1基因cAMP反应元件启动子片段的荧光素酶报告子与mCRFR2β或iv-mCRFR2？共同转染到HEK293T细胞中。用0.01–100 nM Ucn 2处理3 h后测量荧光素酶活性。B类)免疫荧光法测定mCRFR2β和iv-mCRFR2？的表面表达。用iv-mCRFR2β-myc瞬时转染COS-M6细胞(一,b条)或mCRFR2β-myc(c（c）,d日)含有或不含Triton的构建物，并用单克隆抗myc抗体和Cy3-共轭二级抗体染色。C)在瞬时转染mCRFR2β-myc或iv-mCRFR2？myc构建物的HEK293T细胞中，使用单克隆抗myc抗体通过ELISA测定mCRFR1β和iv-mCRFR2β的表面表达。D类)iv-mCRFR2β的细胞定位。用iv-mCRFR2β瞬时转染COS-M6细胞，并用抗iv-mCRFR2β血清和抗p115抗体双重染色(一–c（c）)或抗PDI(d日–（f）)分别作为高尔基体或ER标记。图中显示了一个实验中8次重复的平均值***P（P）< 0.001.
图4。
图4。
iv-mCRFR2β亚型的主要负效应。一个)与固定量（0.75μg）的mCRFR2β构建物瞬时共转染的HEK293T细胞中的Ucn 2激活cAMP反应元件-核糖核酸酶报告子，一种包含EVX1基因cAMP响应元件启动子片段的荧光素酶报告子和增加的iv-mCRFR2？构建物数量（0.1–0.75μg/）。用空的pcDNA3载体补充转染，以控制转染的总DNA。用10 nM Ucn 2处理3 h后测量荧光素酶活性。B类)分别以1:0、1:0.5和1:1比例的mCRFR2β和iv-mCRFR2α瞬时共转染HEK293T细胞，Ucn 2激活cAMP反应元件-核糖核酸酶报告子。将含有cAMP反应元件启动子片段的荧光素酶报告子与mCRFR2β和iv-mCRFR2？共同转染到HEK293T细胞中。用0.001–100 nM Ucn 2治疗3 h后测量荧光素酶活性。C)分别以1:0、1:0.5和1:1比例瞬时转染mCRFR2β和iv-mCRFR2α的HEK293T细胞，用单克隆抗myc抗体ELISA法测定mCRFR1β的表面表达。D类)瞬时转染mCRFR2β-myc的COS-M6细胞的免疫荧光染色，并用单克隆抗myc抗体和Cy3-结合二级抗体染色；注意mCRFR2β的完整膜表达(一). 瞬时共转染mCRFR2β-myc和iv-mCRFR2α的COS-M6细胞的免疫荧光染色(b条–d日)并用单克隆抗myc抗体和Cy3-结合二级抗体进行双重染色(b条)，和抗iv-mCRFR2β血清，然后是Cy2偶联的第二抗体(c（c）). 注意mCRFR2β在ER-Golgi区的保留以及与iv-mCRFR2？的共定位（合并和DAPI染色；d日). 图中显示了一个实验中8次重复的平均值。
图5。
图5。
慢性可变应激后小鼠心脏中iv-mCRFR2β和mCRFR2βmRNA的差异调节。通过实时PCR分析定量小鼠心脏表达的iv-mCRFR2β和mCRFR2αmRNA水平，包括慢性可变应激（CVS）暴露和未暴露。与对照组相比，CVS组小鼠心脏mCRFR2βmRNA表达水平显著下调(一个)而iv-mCRFR2βmRNA表达水平显著上调(B类). 数据为平均值±东南方； n个=5/组*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01; 学生的t吨测试。
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