前扣带回介导大鼠慢性胰腺炎引起的痛觉过敏和焦虑

慢性胰腺炎大鼠模型

根据以前的报告，CP是通过输注2%TNBS诱导的（西格玛，密苏里州圣路易斯，美国）通过胰腺导管灌注[29]. 假手术组大鼠注射等量生理盐水。幼稚的大鼠没有接受手术。

行为测试

在术后第3、7、14和28天（POD）进行行为测试。腹部退缩阈值（AWT）是指腹部机械性超敏反应的测量值，是内脏敏感性的间接标志[29]. AWT使用von Frey细丝（VFF；Stoelting，Kiel，WI，USA）进行计算。试验前，将指定用于刺激的腹部区域剃光。小心处理大鼠，并使其习惯于测试仪器至少30分钟，直到它们在测试前连续3天安静下来。在右上腹部垂直施加5次力递增的VFF（0.16–26 g），每次5–8秒，间隔5分钟，引起至少3次撤退反应的最小力被视为AWT。与我们之前的工作一样，我们也测量了后爪退缩阈值（PWT）[30].

如之前的研究所述，对大脑高级功能进行了行为测试[31,32]. 在旷野试验中，大鼠被驯化到观察室，然后放置在一个新的旷野（100 cm×100 cm×60 cm）的中心。使用运动跟踪系统（中国上海移动数据信息技术有限公司）记录他们15分钟的运动情况。焦虑行为是通过总行程（总距离）和在开阔场地中心花费的距离百分比（%中心距离）来估计的。

在高架+迷宫测试中（美国佛蒙特州圣奥尔本市Med Associates），将大鼠置于中心广场（10 cm×10 cm），头部朝向一个闭合的手臂（50 cm×10厘米），并用运动跟踪系统记录5分钟。通过手臂进入次数（总交叉次数）和张开手臂的时间（张开手臂的%时间）评估焦虑行为。

采用旋转试验（中国上海生物科技有限公司）评估运动协调性。试验前，对大鼠进行三次试验，以每分钟5转（r/min）的恒定速度旋转杆。试验期间，将大鼠放在旋转装置上，旋转速度从3 r/min开始，最大为30 r/min。记录跌倒潜伏期以评估运动协调。

强迫游泳试验用于评估抑郁行为。大鼠被强迫在一个装有水（保持在25°C）的开放式塑料圆筒（直径28 cm，高50 cm）中游泳，高度为35 cm。在5分钟的训练中测量静止时间（漂浮时前爪没有任何挣扎或主动动作）。

胰腺组织苏木精和伊红染色

行为测试后，将大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行深度麻醉，获取胰腺组织以确认胰腺炎。将胰腺组织在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2–7.4）中的4%多聚甲醛中固定过夜，转移到渐进二甲苯洗涤中，并包埋在石蜡中。将石蜡块切成5μm的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。

脑立体定向注射

用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉每只大鼠，然后固定在立体定向仪上（68025，RWD Life Science，Shenzhen，China）。常规消毒后，用电动颅骨钻在颅骨上钻孔。为了进行顺行标记，将0.2μL rAAV-CaMKIIα-EYFP-WPRE-pA（rAAV9-107-1-3，BrainVTA，中国武汉）注入左侧NTS，坐标如下：前-后，AP:-14.16；内侧，ML:±0.30；背腹侧，DV:+7.80 mm。对于逆行标记，将溶解在0.9%生理盐水中的0.02μL 4%氟金（FG；80014，荧光色素，丹佛，科罗拉多州，美国）注入右侧ACC（AP:+1.20；ML:±0.60；DV:−2.80 mm）。使用微量注射泵进行注射约15分钟。注射后5分钟取出注射针。然后缝合头皮。每只大鼠被送回其家中笼子，在灌流前喂养4周（用于病毒注射）或1周（用于FG注射）。注射部位在FluoView1000共焦显微镜下观察（日本东京新宿市奥林巴斯）。

免疫染色

Western Blot分析

将每只大鼠的ACC立即移入冷的人工脑脊液中，并在含有蛋白酶抑制剂（REF04693159001，瑞士巴塞尔罗氏）和磷酸酶抑制剂（REF 04906837001，罗氏）的裂解缓冲液中均质。总蛋白（用于VGluT1分析）是根据我们先前研究中描述的步骤制备的[30]. 使用Minute™质膜蛋白分离试剂盒（SM-005，Invent Biotechnologies，Eden Prairie，MN，USA）的程序分离膜蛋白和细胞质蛋白。蛋白质浓度使用双钦酸试剂盒进行量化（Thermo Scientific™，美国伊利诺伊州罗克福德市）。使用的抗体及其浓度如下：小鼠抗VGluT1（1:500；MAB5502，Millipore）、兔抗pNR2B-Tyr¹⁴⁷²（1:500；AB5403，Millipore），兔抗NR2B（1:500；ab65783，Abcam），兔抗GluR1（1:500；AB2285，Millipore），兔抗pGluR1-Ser⁸⁴⁵（1:500；PA5110124，Invitrogen）、兔抗β-肌动蛋白（1:5000；A1978，Sigma）和兔抗N-钙粘蛋白（1:2000；AB1550，Millipore）以及辣根过氧化物酶结合二级抗体（山羊抗兔，1:5000；ZB-2301，Zsgb Biotech，Los Altos，CA；山羊抗鼠，1:5000，ZB-2305，Zskb Biotech.）。使用增强化学发光试剂盒（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯）对蛋白质带进行可视化，并使用ChemiDoc成像系统（美国加利福尼亚州里士满市Bio-Rad）进行扫描。使用ImageJ对谱带强度进行量化，并使用β-肌动蛋白或N-钙粘蛋白作为负荷对照对所有样本进行归一化。

插管手术和药物微量注射

手术前一周，将TNBS和假大鼠麻醉并固定在立体定向架上（RWD，中国深圳）。将双导套管（26号）双侧植入ACC（AP:+1.20，ML:±0.60，DV:–2.50 mm）。在建立CP模型之前，进行了基线AWT测试。在POD 13上，进行AWT测试，以验证疼痛CP模型的成功建立。在POD 14上，通过位于导管下方0.2 mm处的双注射器套管（30号）进行ACC内注射。哈密尔顿注射器（10μL）通过一根薄聚乙烯管与注射器相连，并由一个电动泵驱动（中国上海阿尔奇比奥）。将氨基-5-磷酸（AP-5，50 mmol/L，0.4μL，每侧；托克里斯，英国布里斯托尔）或氰基-2，6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX，20 mol/L，0.4μL/侧；托科斯）以0.05μL/min的速度注入对照大鼠双侧ACC，加入等量的生理盐水。注射完成后5分钟取出注射套管。微量注射30分钟后测量AWT。此外，为了评估CNQX和AP-5对CP大鼠的镇痛作用，将阿片类药物注射到ACC中作为阳性对照进行测试。在对POD 3、5、7、10和14进行行为测试前30分钟，将吗啡（25μg/0.4μL/侧；PH014355，Sigma）、内吗啡素-1（EM-1；25μg/0.3μL/方；1055，Tocris）、内啡素-2（EM-2；25μg/m.4μL/边；E3148，Sigma]）或载体（生理盐水；0.4μL每侧；）双侧注射到ACC。已验证注射部位事后（post-hoc），并将具有不准确位置的大鼠从研究中剔除。

光遗传学、化学遗传学和行为测试

在光遗传学测试中，在CP诱导前一周，将rAAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry（0.4μL/30 min）注射到双侧ACC（AP:+1.20，ML:±0.60，DV:-2.80 mm）。注射后一周，测量基线AWT，然后在病毒注射部位植入一根光纤（AP:+1.20，ML:0.00，DV:−2.50 mm），然后用牙科水泥固定。在POD 14上，使用激光源（Aurora-220，Newdoon Technology，中国杭州）发射蓝光（5 mW，10-ms脉冲，10 Hz，473 nm）15分钟（开5分钟，关5分钟，开5分钟）。在照明之前、期间和之后评估AWT。AWT测试后，旷野测试进行了15分钟，从第五分钟到第十分钟发出蓝光。

在化学遗传学试验中，在基线AWT试验和CP诱导前一周，向双侧ACC注射rAAV-CaMKIIa-hM4Di-mCherry（0.4μL/30 min）。在POD 13上，进行AWT测试，以验证疼痛CP模型的成功建立。在POD 14上，腹腔注射生理盐水或氯氮平-N-氧化物（CNO，3 mg/kg；C4759，美国明尼苏达州LKT实验室），1小时后进行AWT试验。AWT试验后，进行旷野试验15分钟。验证注射部位事后（post-hoc）对于光遗传学和化学遗传学测试，以及注射部位不准确的大鼠均被排除在研究之外。

慢性胰腺炎刺激诱导NTS、ACC和NTS-ACC投射神经元中FOS的表达

由于FOS表达与有害的躯体或内脏刺激密切相关[35]在CP诱导后，我们对NTS和ACC进行了FOS免疫染色。从POD 3到POD 28，CP大鼠NTS和CCC中FOS免疫反应神经元的数量与假手术组相比显著增加（图。​（图2A-L）。2A–L）。进一步分析表明，TNBS处理显著增加了浅层II-III的FOS表达（TNBS:1260.78±151.48与假手术：503.89±75.07，P（P）<0.01）和深层V-VI（TNBS:630.33±75.66与假手术：252.11±37.54，P（P）< 0.01; 图。​图2M）。2M） 。这些数据为疼痛性CP激活NTS和ACC奠定了形态学基础。

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图2

TNBS治疗增加NTS和ACC中FOS-ir神经元的数量。A类–J型NTS中FOS的免疫化学染色(A类–E类)和ACC(如果–J型)在POD 14的假大鼠和POD 3、7、14和28的TNBS治疗大鼠中（比例尺，200μm）。K（K）,L（左）NTS中FOS-ir神经元的数量(K（K）)和ACC(L（左）)在POD 14的假大鼠和POD 3、7、14和28的TNBS治疗大鼠中。M（M）POD 14上假大鼠和TNBS处理大鼠ACC不同层FOS-ir神经元的数量(n个=每组3人*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，TNBS与假手术，单因素方差分析K（K）,L（左），未成对t吨-在中测试M（M）.

为了确定ACC是否接受NTS的直接输入，将顺行示踪病毒rAAV-CaMKIIα-EYFP注射到左侧NTS。注射部位主要位于NTS内，对周围区域的扩散最小（图。​（图3A–C）。三A–C）。双侧ACC可见EYFP标记的纤维和终末，主要分布在对侧。纤维和终端分散在ACC的表层和深层（图。​（图3三D–F）。

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图3

慢性胰腺炎大鼠的NTS-ACC通路被激活。A类左侧NTS中rAAV-CaMKIIα-EYFP注射部位的显微照片（比例尺，200μm）。B类显示NTS注射部位的典型Nissl染色切片（比例尺，400μm）。C类显示不同水平（黑色区域）注射部位口唇沟范围的追踪。D–F型显示ACC中顺行标记纤维和末端的典型荧光显微照片D类放大倍数为E类，而框架区域位于E类在中放大如果[比例尺，350μm(D类)，100微米(E类)和40微米(如果)].G公司右侧ACC中FG注射部位的显微照片（比例尺，400μm）。小时,我显示NTS中逆行标记ACC投射神经元的代表性荧光显微照片[比例尺，125μm(小时)和40微米(我)].我,J型框架面积放大小时显示FG标记的NTS-ACC投射神经元(我，绿色）快递FOS(J型，红色）。K（K）放大框架面积(J型)显示NTS中的FG和FOS双标记神经元（黄色）（比例尺，25μm）。ACC，前扣带回皮质；AP，最后面积；cc，胼胝体；CC，中央管；FG，氟金；M2，次级运动皮层；孤束核；sol，孤束。

双重免疫染色结果进一步显示，与ACC中GAD-67表达神经元相比，EYFP标记的纤维和终末更有可能与CaMKII表达神经元相对立（图S1）。为了检测疼痛性CP下ACC CaMKII和GAD67表达神经元中FOS的表达，对FOS和CaMKIII以及FOS和GAD57进行双重免疫染色。我们观察到，CP大鼠ACC中CaMKII表达神经元表达FOS的比例明显高于GAD67表达神经元（CaMKII:95.22±1.37%与GAD67:9.72±1.43%；n个=每组4人；P（P）< 0.001; 图S2）。这些形态学数据表明，ACC的突触后锥体神经元在疼痛性CP的传递或调节中起着主导作用。

最后，用逆行标记法验证NTS–ACC直接通路在疼痛性CP中的参与。​（图3G），三G） ，对侧NTS可见逆行标记的细胞体。有趣的是，这些神经元表达FOS（图。​（图3H-K），三H–K），表明投射到ACC的NTS神经元在疼痛的CP条件下被激活。

TNBS注射后ACC中VGluT1和谷氨酸受体表达增加

VGluT将谷氨酸封装在小泡中，用于突触释放和传递[36]. VGluTs的表达水平决定了装入囊泡并释放到突触间隙的谷氨酸的数量，从而调节神经传递的功效[36]. 在所有VGluT中，VGluT1在大脑皮层强烈表达[37]. 在本研究中，我们应用免疫染色和生化分析来检测ACC内VGluT1的表达。VGluT和NeuN的双重免疫染色显示，与POD 14上的假大鼠相比，CP大鼠的VGluT-ir轴突末端似乎与神经元紧密接触的更多（图。​（图4A）。4A） ●●●●。然后通过western blotting证实了在CP过程中VGluT1的上调表达（图。​（图4B-C）。4B–C）。这些结果表明，CP刺激谷氨酸释放，为增强ACC突触前传递提供了证据。

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图4

TNBS处理增强ACC中VGluT1的表达。A类显微照片显示ACC中VGluT1（绿色）和NeuN（红色）免疫反应的双重免疫荧光染色。图像中的框架区域A1类和A2类在图像中放大第3页和A4（A4）白色箭头表示，VGluT1标记的轴突末端与ACC中NeuN标记的体细胞或树突轮廓紧密接触（标尺，25μm inA1类,A2类和5μm英寸第3页,A4（A4）).B类POD 14上假大鼠和POD 3、7、14和28上TNBS处理大鼠ACC中VGluT1的代表性蛋白质印迹。C类与假手术大鼠相比，TNBS处理的大鼠中VGluT1的表达从POD 3到28显著增强(n个=每组3人*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，TNBS与假手术，单因素方差分析，然后是LSD事后的，事后的测试）。

AMPAR和NMDAR的表达分别对ACC内疼痛相关LTP的诱导和表达至关重要[19]. 分离出膜蛋白和细胞质蛋白，神经膜特异性标记物N-钙粘蛋白的分布证实了膜蛋白和胞质蛋白的成功分离（图。​（图5A）。5A） ●●●●。作为AMPAR的关键亚单位，GluR1在突触膜内产生AMPAR转运和整合[38]. GluR1的过度表达导致躯体和内脏相关的慢性疼痛[20,39]. 我们发现，与假手术组相比，TNBS治疗后膜GluR1的丰度显著增加（图。​（图5B，5B、，​B、 D），D类)，细胞质GluR1的变化不明显（图。​（图5C5C和​和E）。E类). 此外，在CP过程中，膜pGluR1的量也增加了（图。​（图5B，5B、，​B、 F），如果)，而细胞质pGluR1的表达保持不变（图。​（图5C，5C、，​C、 G）。G公司). 这些数据表明，TNBS诱导的CP大鼠ACC突触后传递增强可能归因于GluR1亚单位的招募和修饰。

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图5

TNBS处理促进谷氨酸受体亚单位进入细胞膜及其在ACC中的磷酸化。A类ACC分馏检测N-钙粘蛋白和β-肌动蛋白，以验证亚细胞分馏程序的准确性。B类,C类膜的典型western印迹(B类)和胞浆(C类)POD 14上假大鼠和POD 3、7、14和28上TNBS处理大鼠ACC中的GluR1、pGluR2、NR2B和pNR2B。D类,E类在POD 3、7、14和28上注射TNBS后，膜GluR1的表达显著增强，而胞浆GluR1.没有变化。如果,G公司在POD 3、7、14和28上注射TNBS后，膜pGluR1的表达显著增强，而胞浆pGluR1没有改变。小时,我在POD 3、7、14和28上注射TNBS后，膜NR2B显著增强，而在POD 7、14、28上胞浆NR2B明显降低。J型,K（K）在TNBS治疗组的所有时间点，膜pNR2B的表达都显著增加，但胞浆pNR2B的表达没有改变(n个=每组3人*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，TNBS与假手术，单因素方差分析，然后是LSD事后的，事后的测试）。

NR2B是ACC中主要的NMDAR亚单位，在持续疼痛的条件下经历长期的可塑性变化[40]. 不同时间点ACC中NR2B的生化分析表明其膜蛋白表达显著上调（图。​（图5B，5B、，​B、 H），小时)与假手术组相比，CP大鼠的细胞质表达显著下调（图。​（图5C，5C、，​C、 I）。我). 此外，在CP过程中，膜pNR2B的表达显著增加（图。​（图5B，5B、，​B、 J）。J型). 尽管CP组中pNR2B的细胞质表达有下降的趋势，但未检测到显著差异（图。​（图5C，5C、，​C、 K）。K（K）). 这些结果表明，TNBS诱导细胞膜转运并修饰ACC中NR2B亚基的磷酸化。

痛觉过度缓解通过向ACC微量注射CNQX或AP-5

为了确定ACC中增强的兴奋性传递在疼痛性CP发展中的作用，通过行为测试测量了局部给予CNQX和AP-5以阻断ACC谷氨酸传递对动物行为的影响。同时，阿片受体激动剂已知可在慢性疼痛下引发镇痛[41,42]微量注射到ACC作为阳性对照。实验范式如图所示。​图6A，6A、，​A、 B。B类如图所示。​图6C，6C、 连续向ACC双侧微量注射EM-1和EM-2对CP大鼠从POD 3到POD 14有显著、稳定的镇痛作用（AWT:4.78±0.32g生理盐水与EM-1为11.98±0.57克，EM-2为9.65±0.49克，P（P）两者均<0.001，n个=每组6人）。然而，注射吗啡后，从POD 3到POD 10的镇痛效果有下降趋势，表明吗啡耐受。在POD 14上，注射吗啡和注射盐水的CP大鼠的AWT没有显著差异。

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图6

双侧ACC微量注射CNQX和AP-5可减轻CP大鼠的腹部痛觉过敏。A类上面板，行为实验示意图；下面板，显示ACC插管位置的代表性冠状断面（比例尺，2 mm）。B类图中显示了AP-5（黑点）和CNQX（红点）注入ACC的套管尖端位置。C类双侧微量注射吗啡、EM-1和EM-2显著增加CP大鼠的AWT(n个=每组6人***P（P）<0.001，吗啡与盐水；^###P（P）<0.001，EM-1与生理盐水；^&&&P（P）<0.001，EM-2与生理盐水，单因素重复方差分析，然后是LSD事后的，事后的测试）。D类,E类双侧微量注射CNQX(D类)和AP-5(E类)POD 14显著增加CP大鼠的AWT，但生理盐水没有(n个=盐处理组为5，CNQX和AP-5处理组为6*P（P）<0.05，TNBS与假结婚t吨-测试）。

进一步的行为数据显示，双侧微量注射CNQX（AWT:4.80±1.09 g，n个=5，含盐水与9.40±3.97克，n个=6（含CNQX），P（P）< 0.05; 图。​图6D）6D） 或AP-5（AWT:4.48±3.11克，n个=5，含盐水与9.10±3.60克，n个AP-5为6，P（P）< 0.05; 图。​图6E）6E） POD14进入ACC可部分逆转CP大鼠的腹部痛觉过敏；这相当于向ACC注射EM-1或EM-2对POD 14的影响。根据我们的生化数据，这些行为结果表明，通过突触后募集AMPAR和NMDAR，ACC中兴奋性谷氨酸能传递增强，导致CP大鼠的腹部痛觉过敏。

TNBS诱导CP大鼠的焦虑

在本研究中，通过大鼠导管内给予TNBS建立了慢性胰腺炎模型。这导致慢性胰腺炎的机制尚未完全阐明。一般认为，作为半抗原，TNBS与上皮细胞上的赖氨酸残基反应，然后刺激对组织的免疫反应。TNBS还可能通过形成具有促炎和细胞毒性特性的极端活性化合物，包括超氧化物和过氧化氢自由基，而具有直接毒性作用[45]. 在这项研究中，我们发现TNBS诱导的病理生理变化与慢性胰腺炎患者相似[46]提供了一个可靠的疼痛性CP动物模型，具有成功率高、稳定性和可重复性以及死亡率低的优点。

作为一种常见的共病，慢性疼痛条件下的情感障碍严重损害患者的生活质量，加剧慢性疼痛的感觉异常[47]. 正如预期的那样，慢性胰腺炎患者焦虑和抑郁的发病率很高[48]. 不幸的是，在临床和临床前研究中，很少关注胰腺相关疼痛的情感层面的缓解。在本研究中，我们发现CP大鼠在旷野试验和高架迷宫试验中表现出运动减少和探索行为减少，这与之前在肠易激综合征和慢性胰腺炎诱导的VH大鼠中的行为观察一致[31,34].

虽然在动物行为实验中，探索行为的减少被认为反映了焦虑，但静止可能是由许多因素引起的，包括情绪障碍、运动障碍和运动欲望下降[33]. 以下证据表明，负面情绪可能是CP大鼠静止不动的唯一原因。首先，人们认识到慢性疼痛会干扰运动功能[47]. 然而，在旋转试验中，我们未能区分CP大鼠和假大鼠之间运动性能的任何变化，因此排除了运动障碍的可能性。第二，POD 14上的吗啡治疗缓解了腹部痛觉过敏，但未能提高开放场乳头的运动能力（未公布的数据），表明疼痛的CP可能不会降低大鼠的运动欲望。第三，尽管临床观察表明CP患者在偏远地区表现出躯体过敏[14]，我们未能观察到CP大鼠的后爪体细胞超敏反应，这与之前在CP小鼠中报道的结果不同[49]. 最后，强迫游泳测试中的抑郁样行为进一步支持了CP诱导的情绪障碍的存在。根据这些发现，运动障碍可能与CP疼痛条件下的情感障碍密切相关，因此本研究将其用于测量胰腺疼痛的情绪方面。值得注意的是，在神经病理性疼痛中很少出现运动减少[47]. 一种可能的解释是，内脏疼痛通常比躯体疼痛更难以忍受，并会导致更严重的情绪和自主神经紊乱，进而导致运动障碍。

直接NTS-ACC通路参与疼痛性CP

NTS是迷走神经传入纤维的主要靶点，迷走神经传出有害和非有害的内脏感觉信息到前脑通过臂旁核[8,9,50]. NTS在内脏或自主信息的传递或调节中的作用已被广泛探讨[51–54]. 利用轨迹追踪技术研究了啮齿动物NTS的上行投射。除了包括PBN在内的众多脑干区域外，NTS的投射还可追溯到一系列前脑结构：终纹床核、下丘脑室旁核、背内侧核和弓状核、中央杏仁核和丘脑室周核[55,56]. 在这里，我们证明了大鼠的NTS–ACC直接通路。尽管投射很少，但这种联系提供了证据，证明皮层疼痛中心可以被NTS处理的内脏传入直接激活。进一步观察表明，NTS的投射物与锥体和GABA能的ACC神经元密切接触，前者更常见。另一个有趣的现象是，与GABA能神经元相比，ACC锥体神经元更容易被疼痛的CP激活。这一形态学证据表明，ACC谷氨酸能神经元在疼痛性CP的传递或调节中起着关键作用，这已被随后的功能研究所证实。然而，不能完全排除GABA能的ACC神经元在疼痛性CP调制中的作用，这是本研究的局限性。我们迫切需要进一步的功能实验来回答这个问题，这是我们实验室的一个重要研究重点。

除了直接投射外，NTS到ACC可能还有更复杂的间接投射。作为NTS内脏传入的关键中继中心，PBN向广泛的丘脑区域发送投射，包括层内（中央中央区、中央外侧区）和中线（室旁区、再聚区）丘脑核[57]，据报道将传出连接发送到ACC[58]. 因此，可能存在一条间接的NTS–PBN–丘脑–ACC通路，该通路与内脏疼痛向ACC的传递有关。此外，NTS向LC发送直接投射[55,56]为ACC提供直接去甲肾上腺素能传出[58]. 因此，NTS–LC–ACC通路可能参与ACC内脏疼痛处理的调节。这些潜在的间接通路值得进一步研究。

ACC中疼痛性CP的突触前和突触后扩增

ACC谷氨酸能传递的LTP是病理性疼痛的关键细胞机制[19]. 活性依赖性钙²⁺突触前谷氨酸过度释放诱导NMDAR激活的流量被认为在LTP诱导期间启动下游信号事件。腺苷酸环化酶1（AC1）是一种必需的钙²⁺-将ATP转化为cAMP，然后激活下游信号分子的受激酶，如蛋白激酶A（PKA）和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）。神经病理性疼痛和VH模型的证据表明，原发性损伤促进ACC中GluR1磷酸化和贩运通过AC1–cAMP–PKA通路，导致NMDAR介导的AMPAR增强[20,59]. 同时，AC1–cAMP–CREB通路的激活可能促进NR2B的表达和磷酸化，形成正反馈以增强NMDAR功能并有助于持续疼痛[40]. 除AC1外，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）是ACC突触可塑性的另一个关键分子。磷酸化CaMKI结合并稳定突触后NR2B，从而介导VH大鼠内脏疼痛[60].

在本研究中，发现CP大鼠ACC内VGluT1表达增加，GluR1和NR2B亚基的膜转运和磷酸化增加。我们认为，CP诱导的过量谷氨酸释放可能激活类似的信号通路通过ACC中的NMDAR导致谷氨酸受体的招募和内脏超敏反应。根据先前在神经性和胃肠道疼痛条件下进行的研究，ACC内的这些神经可塑性相关变化与CP条件下的行为性痛觉过敏呈正相关，因为AMPAR/NMDAR拮抗剂抑制谷氨酸能传递导致疼痛减轻[20,59]. 我们还测试了CP大鼠ACC局部注射阿片类药物的镇痛效果，作为评估AMPAR/NMDAR拮抗剂和随后的光遗传/化学遗传操作的镇痛效果的阳性对照。激活多卵磷脂受体（MOR）通过ACC中的吗啡已被证明在啮齿动物的各种慢性疼痛状态下具有有效的镇痛作用[41,42,61]. 有人提出MOR激活抑制ACC中兴奋性谷氨酸能的传递通过突触前谷氨酸释放的抑制和锥体神经元的失活[62,63]. 在这里，我们发现外源性（吗啡）和内源性（EM-1和EM-2）MOR激动剂对CP大鼠都有强大的镇痛作用，这些作用几乎与AMPAR/NMDAR拮抗剂在ACC中诱导的作用相同。总之，ACC在胰腺相关疼痛中起到了镇痛促进作用。我们研究的局限性在于，尚未检测到可能参与疼痛CP的其他谷氨酸亚基，相应的信号机制仍有待研究。

这项工作得到了国家自然科学基金（81620108008和31971112）和中国陕西省创新能力支持计划（2021TD-57）的支持。