肽GWN和GW以SIRT1依赖性方式保护肾细胞免受达萨替尼诱导的线粒体损伤

2.2。细胞培养

293个T细胞（CRL-3216™）购自美国型培养物收藏中心（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）。293个T细胞在100x15mm Nunc™细胞培养皿（加拿大安大略省赛默飞世尔科学公司）中培养，初始密度为50000个细胞/板。细胞保存在37°C、5%CO、添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM）中₂。将细胞培养至指定的时间，并用显微镜观察，直至达到～70%的融合。达到该汇合水平后，用达沙替尼（1µM）或所选肽（50µM）处理细胞。

2.3. 肽合成

三种卵转铁蛋白衍生肽GWNI GWN和GW由GenScript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）合成。肽序列和纯度（99.8%）通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）验证。在水中（100 mM储备液）重新配制肽，并将其等分样品储存在−20°C下，直到进一步实验。

2.4. 细胞治疗

如上所述培养胚胎肾细胞（293 T），并在达到～70%融合后用达沙替尼或肽处理。选择这种汇合水平是为了给细胞提供充足的时间，使其在存在药理活性肽的情况下达到完全汇合。简单地说，为了检查达沙替尼诱导线粒体DNA损伤的能力，添加1µM达沙替尼达6小时。接下来，为了研究候选肽的细胞保护能力，用肽预先培养肾细胞24小时，然后用达沙替尼（1µM）进行细胞应激。经过这些处理，获得了蛋白质、组蛋白和胰蛋白酶化细胞。肽的剂量选择基于我们之前的报告，该报告表明50µM的有效剂量(Jahandeh等人，2016年)而达沙替尼的剂量选择（1µM）基于其IC₅₀在癌细胞系（IC）中的价值₅₀<1μM）(Tryfonopoulos、O'Donovan、Corkery、Clynes和Crown，2009年).

2.5. 细胞活力

使用TC10™细胞计数器（加拿大安大略省米西索加市Biorad）评估细胞活力。在用肽f、GWNI GWN和GW处理后，293个T细胞被胰蛋白酶化，用PBS洗涤两次，并在离心后重新悬浮在完全培养基中。使用台盼蓝法在TC10™细胞计数器（加拿大安大略省米西索加市Biorad）的双琥珀色细胞计数玻片上评估细胞活力。

2.6. 蛋白质和组蛋白提取

使用添加蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液从细胞中提取蛋白质。处理后，从培养皿中取出培养基，用10mL冰镇PBS洗涤细胞两次。洗涤后，向10cm的培养皿中加入300µL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，并用细胞刮片刮除细胞。细胞裂解液在冰上培养15分钟，然后用一次性杵手动进一步裂解。接下来，将裂解液再培养15分钟，并在4°C下在13000×g下离心5分钟，以收集蛋白上清液。根据前面描述的方法，使用颗粒提取组蛋白(Shechter、Dormann、Allis和Hake，2007年). 在如上所述提取总蛋白后，如前所述进行组蛋白的酸基沉淀(Shechter等人，2007年). 在免疫印迹之前，用0.5 M NaOH（1:1 v/v）中和提取组蛋白的pH值。

2.7. 蛋白质印迹

在用载体、达沙替尼和/或候选肽处理后，去除培养基，并使用RIPA缓冲液溶解细胞，如前一节所述。这些细胞裂解物在SDS-PAGE上运行，转移到硝化纤维素膜上，并根据制造商推荐的浓度用一级抗体进行免疫印迹。在与二级抗体孵育后，使用Licor Odyssey BioImager（Licor Biosciences，Lincoln，NB）检测蛋白质带，并使用Image Studio Lite 5.2软件通过密度测定进行量化，如我们最近的报告所述(Bhullar等人，2021a).

2.8. 流式细胞术

流式细胞术在阿尔伯塔大学流式细胞仪核心设施进行。细胞线粒体的含量或密度由MitoTracker™Green FM（Invitrogen™，M7514）根据制造商的说明使用流式细胞仪（FACS Canto II，BD Bioscience，CA，USA）测量。简单地说，按照上述方法培养和处理细胞。处理后，用400 nM浓度的MitoTracker™Green FM将细胞胰蛋白酶化、收集并重新悬浮在PBS和FBS（3:1）制成的缓冲液中。在37°C下与染料孵育45分钟后，使用BD FACSCanto™（BD FACS Canto II）流式细胞分析仪（BD Biosciences，San Jose，CAL，USA）分析线粒体含量。FlowJo软件用于流式细胞术数据分析（Tree Star，Inc.OR，USA）。

2.9. DNA提取和琼脂糖凝胶

首先，根据我们最近的报告，线粒体是从细胞中提取出来的(Bhullar等人，2021a). 接下来，根据之前的报告，进行了DNA提取(Boccellino等人，2003年). 简单地说，将来自10 cm板的细胞重新悬浮在500μL Tris–EDTA缓冲液中，并用0.2%Triton X-100进行裂解。在0.5 M NaCl存在下，DNA在乙醇中沉淀6 h。然后，采用高速离心进行DNA沉淀，并用异丙醇沉淀水相中的片段DNA提取物。Tris–EDTA缓冲液再悬浮后，在37°C下用RNase A（0.1 mg/mL）培养样品30分钟。最后，用SYBR™Safe DNA凝胶染色法在琼脂糖凝胶上运行提取的DNA。

2.10. KO电池

使用我们最近报告中描述的CRISPR-Cas9方法制备293 T SIRT1 KO细胞(Bhullar等人，2021b). 寡核苷酸序列包括SIRT1 crRNA:CUGAAUACCUCAGCCA、SIRT1测序引物Fwd:TTTTCACACTTCCCCTTCAT、SIRT1Sequenting Primer Rev:TCCTTGCTATCGAGTTCACA。如上所述，用达沙替尼（1µM）和/或肽（50μM）处理KO细胞。

2.11. 活性氧和抗氧化酶测定

使用从Abcam（加拿大安大略省多伦多）获得的活性氧分析试剂盒测量细胞中的活性氧（ROS）。该试剂盒使用细胞渗透试剂2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）定量评估活细胞样品中的活性氧，可在485 nm/535 nm激发/发射荧光光谱法检测。对于ROS测量，细胞以每孔25000个细胞的密度接种在96孔板的黑色底板中。所有步骤均按照供应商粘附细胞协议（ab113851）中给出的说明进行。抗氧化酶、SOD2和过氧化氢酶的蛋白质水平通过细胞处理（如第2.4节所述）和western blot分析进行测量。

2.12. 代谢预测

通过SwissADME进行代谢预测，并通过软件方法分别评估详细的代谢参数。拓扑极表面积（TPSA）等关键参数；iLOGP（用于隐式log P），基于在水和正辛醇中通过GB/SA计算的溶剂化吉布斯自由能；log Kp（Kp单位为cm/s），皮肤渗透指数；生物利用度评分，化合物在大鼠模型中具有至少10%口服生物利用度的概率；计算GI和脑吸收。简而言之，两种活性肽GWN和GW的标准微笑是使用Open Babel软件生成的。将两个肽串NCC（=O）N[C@@]（[H]）（CC（=CN2）C1=C2C=CC=C1）C（=0）N[C@@]O）O}和奥美拉唑{CC1=CN=C（C（=C1OC）C）CS（=O）C2=NC3=C（N2）C=CC（=C3）OC}。运行该程序以获得煮蛋结果，而药理学数据是使用瑞士ADME提供的CSV文件获得的。

3.2. 卵转铁蛋白肽的毒性和组蛋白分析

比较级在体外进行毒理学研究以评估卵转铁蛋白肽（GWNI、GWN和GW）对293 T细胞的影响在体外(图2A） ●●●●。台盼蓝活性分析表明，所有测试肽（GWNI、GWN和GW）在人类胚胎肾细胞中的细胞活性均大于90%(图2B） ●●●●。然而，在这些肽中，GWNI表现出具有统计学意义的细胞毒性（p<0.05），表现为细胞活力下降，而GW和GWN保持了最高的细胞活力，并表现出低毒性在体外(图2B） ●●●●。我们还测试了三种肽（GWNI、GWN和GW）在肾细胞中诱导细胞保护组蛋白修饰H3K36me3的能力(图2C） ●●●●。在GWNI、GWN、GW中，GWN和GW（50μM）导致活性组蛋白标记H3K36me3的显著积累（分别为p<0.05和p<0.01），表明GW和GWN肽对细胞氧化应激和DNA损伤具有强大的细胞保护能力。然而，与溶媒组相比，GWNI治疗（50μM）并未增强细胞保护活性组蛋白标记H3K36me3(图2C） ●●●●。这些实验建立了GWN和GW的安全毒理学和细胞保护特性，而GWNI不包括在进一步的一组实验中。尽管需要注意的是，GWNI治疗确实表现出>90%的生存率，这突出了一个可接受的安全性特征，但考虑到统计分析，将其排除在进一步的实验之外。

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图2

卵转铁蛋白多肽的毒性和组蛋白修饰能力。（A）三种抗氧化肽中的两种肽GWN和GW诱导（B）对人胚肾293 T细胞的毒性最小，（C）显著提高活性组蛋白标记H3K36me3。简而言之，用三种肽GWNI、GWN和GW处理293个T细胞；并进行细胞活力和组蛋白提取。用台盼蓝法在双琥珀细胞计数玻片上评估细胞活力，同时用酸沉淀法提取组蛋白。实验至少进行三次，通过单因素方差分析和Dunnett的事后检验来确定显著差异，以比较肽组和对照组的平均值*p<0.05，**p<0.01。

3.3. GWN和GW对达沙替尼应激的细胞保护能力

首先，我们评估了两种卵转铁蛋白衍生肽GWN和GW对抗达沙替尼诱导的细胞损伤的能力(图3A） ●●●●。据报道，SIRT1是一个NAD⁺依赖性蛋白脱乙酰酶，调节细胞应激反应。用GWN和GW（50μM）预处理肾细胞，通过显著增加293个T细胞中SIRT1的蛋白水平来对抗达沙替尼应激（p<0.01）(图3B） ●●●●。我们的结果还表明，GWN（50μM）（而非GW）显著增加了SIRT3的蛋白水平（p<0.01），SIRT3是一种细胞保护性线粒体sirtuin，表明线粒体对达沙替尼应激具有保护作用。与这些结果一致，通过GWN治疗（50μM），线粒体健康的重要生物标志物COX4的蛋白质水平显著提高（p<0.01）(图3D） ●●●●。这些结果有力地证明了GWN和GW对达沙替尼诱导的细胞损伤具有线粒体保护和恢复作用。

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图3

来源于卵转铁蛋白的多肽对肾细胞达萨替尼损伤的细胞保护作用。（A） Dasatinib（1µM）损伤人类胚胎肾293 T细胞后，两种肽GWN和GW增加了（B）SIRT1（C）SIRT3（D）和COX4水平。简而言之，用GWN和GW预处理293个T细胞24小时，然后用达沙替尼（1µM）细胞应激6小时。在这些处理后，使用RIPA缓冲液收集总蛋白并进行免疫印迹。实验至少进行了三次，通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异，以比较肽组和对照组的平均值**p<0.01。

3.4. 肽GWN和GW增加抗氧化酶并降低ROS

与细胞保护性sirtuins水平的增加相一致(图3B、 D），我们观察到GWN和GW治疗导致达沙替尼损伤引起的ROS水平急剧下降（p<0.001）(图4A） ●●●●。通过将ROS水平恢复到损伤前水平，卵巢转铁蛋白衍生肽GWN和GW在细胞中重新建立氧化还原稳态(图4A） ●●●●。GWN（p＜0.001）和GW（p＜0.01）显著增加了抗氧化酶过氧化氢酶的水平，证实了它们对氧化应激的保护作用(图4B、 C）。然而，只有GWN预处理显著增加了SOD2（超氧化物歧化酶2）水平（p<0.05）(图4C） ●●●●。

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图4

卵转铁蛋白多肽对肾细胞Dasatinib损伤的抗氧化作用在Dasatinib（1µM）损伤人类胚胎肾293 T细胞后，两种肽GWN和GW（A）降低ROS并增加（B）过氧化氢酶和（C）SOD2水平。简而言之，用GWN和GW预处理293个T细胞24小时，然后用达沙替尼（1µM）细胞应激6小时。在这些处理后，使用RIPA缓冲液收集总蛋白并进行免疫印迹。实验至少进行了三次，通过单因素方差分析和Dunnett事后检验确定显著差异，以比较肽组和对照组的平均值**p<0.01。

3.5. GWN和GW对达沙替尼应激的线粒体保护作用

接下来，我们进行流式细胞术以评估GWN和GW对抗达沙替尼诱导的线粒体丢失的能力(图5). 我们的结果表明，与载体相比，达沙替尼（1µM）导致肾细胞线粒体密度显著下降(图4A-B）。这种下降证实了之前观察到的肾细胞达沙替尼损伤后线粒体DNA损伤和COX4水平的丢失(图1B） ●●●●。然而，GWN和GW预处理肾细胞可显著消除达沙替尼在检测浓度（50μM）下诱导的肾细胞线粒体丢失(图5B-C）。然而，GWN保护肾细胞线粒体抵抗达沙替尼的能力强于GW(图5C-D）。流式细胞术分析的这些结果证实了GWN和GW减轻达沙替尼损伤引起的肾线粒体损失和损伤的能力。

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图5

源自卵转铁蛋白的肽保护线粒体免受达沙替尼对肾细胞的损伤。与（A）载体相比，（B）达沙替尼（1µM）治疗导致线粒体数量急剧下降，而线粒体数量在人类胚胎肾293 T细胞损伤后由（C）GWN和（D）GW池恢复。简而言之，用GWN和GW预处理293个T细胞24小时，然后用达沙替尼（1µM）细胞应激6小时。经过各种处理后，使用胰蛋白酶化法收集细胞，用400µM浓度的MitoTracker™Green FM培养细胞，并进行流式细胞术。实验至少重复三次，并使用FlowJo软件进行分析。（对于本图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的网络版。）

3.6. GWN和GW的SIRT1依赖性表现出线粒体保护

由于SIRT1与肾脏保护密切相关(Huang等人，2020年，Sun等人，2021年)以及GWN和GW激活SIRT1，我们询问这些肽的细胞保护作用是否依赖于SIRT1。我们的细胞活性结果表明，与SIRT1相比，GWN和GW对WT细胞中达沙替尼损伤具有更强的保护作用^−/−细胞（p<0.001）(图6A） ●●●●。同样，GWN增加COX4的能力(图3D） 在SIRT1中减少^−/−单元格(图6B） ●●●●。同样，GWN和GW增强SIRT1中H3K36me3组蛋白标记的能力也出现了强烈下降^−/−单元格(图6C） 与WT电池相比(图2C） ●●●●。总的来说，SIRT1的缺失导致GWN和GW表现出的细胞保护和表观遗传机制消失，表明GWN和GF具有SIRT1依赖性生物活性。

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图6

源于卵转铁蛋白的多肽对达萨替尼损伤的细胞保护的SIRT1依赖性。Dasatinib（1µM）以SIRT1依赖性方式损伤293 T细胞后，两种肽GWN和GW维持（A）细胞活性（B）COX4水平和（C）H3K36me3水平。简而言之，用GWN和GW预处理293 T WT和293 T SIRT1 KO细胞24小时，然后用达沙替尼（1µM）细胞应激6小时。处理后，收集细胞，并按照方法进行细胞活力、免疫印迹和组蛋白标记分析。实验至少进行三次，通过单因素方差分析和Dunnett的事后检验来确定显著差异，以比较肽组和对照组的平均值**p<0.01。

这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）的资助。所有作者感谢Basil P.Hubbard博士提供293T WT细胞和293T SIRT1 KO细胞，感谢Aja Rieger博士帮助流式细胞术实验和分析。