国际分子科学杂志。2022年1月；23(1): 497.
MTEP是一种选择性mGluR5拮抗剂，在大鼠锂-皮罗卡平癫痫模型中具有神经保护作用，但不能预防自发性复发性癫痫发作和行为共病的发展
Jaroniew J.Łuszczki，学术编辑
†现住址：瑞士巴塞尔4001巴塞尔大学分子精神病学小组。
2021年12月9日收到；2021年12月30日验收。
摘要
代谢性谷氨酸受体（mGluRs）主要在神经元和胶质细胞上表达，并参与调节广泛的信号转导级联。因此，不同亚型的mGluRs被认为是治疗各种脑疾病的有希望的靶点。先前的研究已经证明癫痫诱导的mGluR5上调；然而，其功能意义尚不明确。在本研究中，我们旨在阐明选择性mGluR5拮抗剂3-[（2-甲基-1,3-噻唑-4-基）乙炔基]-吡啶（MTEP）对使用锂-匹罗卡品模型的大鼠癫痫发生和行为损伤的影响。我们发现，在模型潜伏期给予MTEP并不能提高大鼠的存活率，阻止癫痫的发展，或减轻其表现。然而，MTEP治疗完全防止了神经元丢失，并部分减轻了海马区的星形胶质细胞增生。在治疗组大鼠中检测到兴奋性氨基酸转运体2表达增加，可能会防止兴奋性毒性，并可能是一种潜在的神经保护机制。我们还发现，服用MTEP并不能预防行为共病，例如抑郁样行为、运动过度活跃、探索行为减少以及锂-匹罗卡品模型中典型的认知障碍。因此，尽管具有明显的神经保护作用，但MTEP治疗在预防癫痫方面无效。
关键词：颞叶癫痫，兴奋性氨基酸转运体2，胶质纤维酸性蛋白，开放场测试，新物体识别测试，海马，免疫组织化学，神经元丢失
1.简介
颞叶癫痫（TLE）是一种严重的神经系统疾病，表现为自发性反复发作，在许多情况下，伴有精神病共病，如抑郁、焦虑、精神病和认知障碍[1，2，三]. 通常，很难找到治疗这种癫痫的方法，而且几乎30%的病例对药物治疗有耐药性[4，5]. 然而，由于TLE通常是原发性脑损伤的结果，因此防止损伤后TLE的发展被认为是获得性TLE的最佳治疗策略[6，7].
然而，癫痫的预防性治疗仍然不存在[5]. 癫痫发生是指将正常大脑转化为支持癫痫发作的一系列事件。通常在兴奋和抑制之间建立平衡的机制受到干扰时会发生癫痫[8].
与离子型α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）不同，代谢型谷氨酸受体（mGluRs）不直接参与快速兴奋性突触传递，N个-d-天冬氨酸甲酯（NMDA）和红藻氨酸受体。然而，它们存在于突触前、后神经元和胶质细胞的膜上，可以调节突触传递、膜特性和不同细胞类型的代谢，从而在兴奋和抑制的平衡中发挥关键作用[9]. 此外，mGluRs还参与一些神经和精神疾病的发病机制，如阿尔茨海默病、帕金森病、焦虑、抑郁和精神分裂症[10]. I组和II组mGluR靶向药物在这些条件下表现出有益的效果[11，12].
八种mGluR亚型根据序列同源性、G蛋白结合和配体选择性分为三组[10]. 组I包括与G相连的mGluR1和5q个/G公司11蛋白质。这些受体的激活导致细胞内Ca的增加2+浓度并促进NMDA受体活化[13]. 第二组（mGluR2，mGluR3）和第三组（mGluR4，mGlu R6-8）受体偶联到G我/G公司o（o）蛋白质。激活这些受体的主要作用是降低神经递质释放和NMDA受体活性[9，10].
在癫痫患者和大鼠癫痫模型中，I组mGluR在海马中的表达已被证实增加[14，15，16]表明这组mGluRs可能与癫痫易感性有关。此外，作用于mGluR1或mGluR5的激动剂具有惊厥作用；因此，I组mGluRs的负性调节剂可能是治疗癫痫的有前景的药物[17，18].
选择性mGluR1拮抗剂，{“类型”：“中心核苷酸”，“属性”：{“文本”：“LY456236”，“term_id”：“1257500597”，“term_text”：“RY456263”}}LY456236年，在6-Hz局灶性癫痫模型中对边缘区癫痫具有剂量相关的抗惊厥作用，在阈值电击模型中对强直伸肌癫痫具有抑制作用，表明mGluR1阻断可能是治疗癫痫的一种临床有用的方法[19]. mGluR5拮抗剂2-甲基-6-（苯乙炔基）吡啶（MPEP）对小鼠强直性癫痫发作和6-Hz癫痫发作试验产生剂量依赖性保护作用[20]在脆性X综合征小鼠模型中防止声音诱发的癫痫发作[21]. 然而，在6-Hz电击模型中，高选择性mGluR5拮抗剂3-[（2-甲基-1,3-噻唑-4-基）乙炔基]-吡啶（MTEP）没有观察到显著的抗惊厥活性[22].
Umpierre等人（2019年）利用癫痫的kainite模型表明，星形胶质细胞中mGluR5的表达可以决定癫痫的发展并调节星形胶质细胞和神经元之间的相互作用[23]. MTEP对海马内注射红藻氨酸诱导的大鼠兴奋性毒性具有强大的神经保护作用[24]. 即使在暴露于红藻氨酸后1–6小时施用MTEP，也具有神经保护作用；然而，作者并未调查其抗癫痫作用[24]. 此外，MTEP管理具有抗焦虑作用[25]和抗抑郁作用[26]，这可能适用于癫痫模型中的这些共病[27].
因此，我们假设mGluR5阻断剂可以显著改变癫痫发生，产生神经保护作用，并减少自发复发性癫痫（SRS）和共病行为损害。本研究的具体目的是阐明MTEP治疗对锂-匹罗卡品大鼠模型癫痫发生的影响。我们选择这个模型是因为它被认为是最合适的癫痫发生和TLE模型[28，29]. 此外，它再现了病理状况的主要特征：（i）癫痫发作灶位于颞叶[30]; （ii）通常发生TLE之前的“初始诱发损伤”[31]; （iii）无癫痫发作的潜伏期[32].
2.结果
2.1. 实验设计概述
在这项研究中，我们每30分钟给大鼠注射10毫克/公斤的毛果芸香碱，直到大鼠表现出饲养状态（详见方法）。给药40 mg/kg毛果芸香碱后未饲养的大鼠被排除在实验之外。饲养开始75分钟后，我们通过注射地西泮（5 mg/kg）来阻止癫痫发作。实验组在饲养后90 min给予MTEP（1 mg/kg），然后每24 h给药一次，共5天。在模型潜伏期癫痫持续状态（SE）后7天，我们对大鼠海马中的一些靶基因/蛋白进行了RT-qPCR和Western blot分析。在模型的慢性期进行行为测试、SRS记录、组织学分析和Western blot分析。本研究的整个实验设计如所示.
实验设计。Pilo：给予匹罗卡品的大鼠，MTEP：给予匹罗卡品，然后给予MTEP，LiCl：氯化锂，SMB:（−）-甲基溴化东莨菪碱，DZ:地西泮，OF:开放场试验，NOR：新物体识别，SPT：蔗糖偏好试验，SRS：自发性反复发作，qPCR：逆转录后进行定量聚合酶链反应，WB：Western blotting。
2.2。MTEP给药对癫痫持续状态和自发性复发性癫痫大鼠的病情无影响
为了评估MTEP给药是否改变了模型的急性期和潜伏期，我们分析了诱导SE后一周大鼠的存活率和体重。我们观察到Pilo组和MTEP组之间没有差异(a、 b）。
锂-匹罗卡品诱导癫痫持续状态（SE）后大鼠的存活率和体重动力学。(一)Kaplan–Meier生存曲线显示MTEP治疗对生存率没有影响（Gehan–Breslow–Wilcoxon试验ꭓ2= 1.3,第页= 0.72). (b条)体重动力学表现为体重相对于SE前平均体重的变化。只有潜伏期存活的大鼠才用于体重动力学分析（Pilo：n个= 10; MTEP公司：n个= 14). 数据以平均值表示，并带有平均值的标准误差。混合方差分析表明，MTEP对体重动态没有影响（温室-盖瑟F2.2,53.9= 0.5,第页= 0.7, η第页2= 0.02). (c（c）)自发性反复发作（SRS）特征。Pilo组和MTEP组SRS大鼠的百分比没有差异；数据包括行为测试期间记录的视频记录的癫痫发作和发作（左面板）。视频记录SRS的平均持续时间（中间面板）和总SRS时间（右侧面板）不受MTEP治疗（学生的t吨-测试，第页>0.05）。条形代表平均值，误差条形代表平均的标准误差，圆圈代表每只动物的个体值。
为了检查MTEP治疗是否有抗癫痫作用，我们拍摄了大鼠SE后48小时1个月和2个月的行为。我们分析了SRS发作的次数和持续时间(c） ●●●●。两组中几乎所有的动物都表现出SRS，表明匹罗卡品给药能有效诱导大鼠癫痫。两组动物中的一些只在处理或行为测试期间发作，但在录像期间没有发作。因此，我们没有使用这些数据来估计SRS的持续时间。Pilo组和MTEP组SRS大鼠的百分比相同。我们还注意到，两组表现出相同的SRS持续时间和频率(c） ●●●●。因此，服用MTEP并不能预防锂-匹罗卡品模型中的癫痫或减轻其表现。
2.3. MTEP对大鼠海马的神经保护作用
锂-匹罗卡品模型中经常观察到背海马的神经变性[33，34]. MTEP在红藻氨酸癫痫模型中显示出显著的神经保护作用[24]. 因此，我们假设在锂-毛果芸香碱模型中也会观察到MTEP的神经保护作用。我们检查了诱导SE两个月后获得的Nissl染色海马切片，并在Pilo大鼠的海马中检测到明显的神经元丢失，特别是在CA1–CA2区域的边界附近，我们在那里观察到细胞层的间隙(a） ●●●●。
SE后2个月大鼠海马尼塞尔染色显示MTEP治疗的神经保护作用。(一)选择背海马的三个部位来分析金字塔街（第页）。CA1_1是CA1区最常见的细胞计数位点；CA1_2是CA1区神经变性最明显的部位。在CA3区，我们计算了该区域中部的神经元数量。下图显示了细胞层每100µm长度的神经元数量的统计数据。圆圈显示每只老鼠的个体值。列表示平均值，误差条表示标准偏差。进行单因素方差分析以确定MTEP治疗的神经保护作用。对于CA1_1区域F2,15= 13.4,第页<0.001，对于CA1_2 F2,15= 19.0,第页<0.001，对于CA3 F2,15= 30.6,第页< 0.001. 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：**第页< 0.01, ***第页< 0.001. (b条)散点图显示癫痫发作次数与海马CA1区神经元密度之间缺乏相关性。圆圈显示各个值。
与对照组相比，Pilo大鼠的CA3区更稀薄。在MTEP组中，海马神经元的丢失不太明显。与对照组相比，我们没有观察到癫痫动物的神经元形态发生显著变化。然而，我们注意到CA1锥体层中有大量小核细胞，而对照海马中没有。这些小细胞很可能是星形胶质细胞。
我们计算了CA1和CA3区域三个不同部位的神经元数量(a） ●●●●。在研究区域，Pilo组的神经元数量比对照组和MTEP组低2-3倍(a） ●●●●。因此，在锂-匹罗卡品模型中，潜伏期给予MTEP可防止海马神经元丢失。
接下来，我们分析了SRS频率是否与神经元丢失相关，并使用了CA1位点，因为我们在这些位置观察到了大鼠之间的最高变异性。然而，我们发现神经元密度和SRS频率之间没有相关性(b） ●●●●。这一结果表明，海马神经元的丢失不是致痫灶形成的主要机制。
2.4. MTEP治疗减少癫痫脑内星形胶质细胞增生
由于癫痫组织中的星形胶质细胞可能参与癫痫诱导机制[35，36]星形细胞mGluR5s的激活可能增加基础突触传递和神经元同步性[37]，我们研究了MTEP给药对星形胶质细胞的影响。
首先，我们用Western blotting分析了背海马中两种星形细胞蛋白的表达水平，如兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。单因素方差分析显示癫痫动物海马EAAT2表达无明显变化()与实验和临床数据一致[38，39]. 此外，MTEP处理不影响EAAT2的表达水平。相反，GFAP的表达在各组之间存在差异(). 我们发现Pilo组的GFAP产量显著增加，但MTEP组没有增加().
慢性期背海马蛋白质生成的Western blotting数据。对于插入物，上部显示化学发光信号，下部显示蓬索S。对于带，c（c）是校准样品，1是Ctrl，2是Pilo，并且三是MTEP组样本。每个点代表一只动物；列表示平均值，误差条表示标准偏差。采用单因素方差分析确定MTEP治疗的效果（兴奋性氨基酸转运蛋白2（EAAT2）：F2, 17= 0,66,第页= 0.53; 胶质纤维酸性蛋白（GFAP）：F2,16= 8.1,第页< 0.01). 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：**第页< 0.01.
为了阐明GFAP的产生如何定位于背海马，我们对海马组织进行了GFAP免疫荧光分析(). 我们发现癫痫患者大脑海马层星形胶质细胞的分布发生了改变。与对照组的差异在CA1区最为显著，在该区观察到最显著的神经元丢失。星形胶质细胞迁移到金字塔层，并且它们的过程重叠。在CA3区，对照组和癫痫组动物之间的差异不太明显。
海马组织的GFAP免疫荧光分析。(一)GFAP阳性细胞海马切片的代表性图像。毛果芸香碱诱导SE两个月后对脑组织进行分析。以胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为靶点的免疫组织化学方法检测星形胶质细胞。MTEP治疗可减少大鼠海马区的星形胶质细胞增生。(b条)不同海马部位的平均GFAP阳性区域：CA1_1、CA1_2和CA3。圆圈显示每个大脑的个体值。列表示平均值，误差栏显示平均值的标准误差。进行单因素方差分析以确定MTEP治疗星形胶质细胞增生症的效果：CA1（F2,15= 5.9;第页< 0.05); CA2-CA1（F2,15= 8.4;第页< 0.05); CA3（F2,15= 4.95;第页= 0.07). 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：*第页< 0.05.
接下来，我们量化了对照组、Pilo组和MTEP组的GFAP阳性区域(b） ●●●●。单向方差分析显示，癫痫对CA1区两个部位的这一参数有显著影响（CA1_1:F2,15= 5.9;第页< 0.05; CA1_2:F类2,15= 8.4;第页<0.05），但对于CA3区域（F2,15= 4.95;第页= 0.07). Tukey的事后测试显示，仅在对照组和Pilo组之间，CA1中GFAP阳性区域存在显著差异。对照组和MTEP组之间没有发现差异，尽管Pilo和MTEP两组之间也没有发现差异。因此，服用MTEP可部分预防癫痫脑中的星形胶质细胞增生症。
2.5. MTEP治疗可防止EAAT2生成减少，但不影响模型潜伏期GFAP表达的增加
为了了解为什么MTEP给药具有神经保护作用而非抗癫痫作用，我们在SE后7天对大鼠海马中的一些靶基因/蛋白进行了RT-qPCR和Western blot分析。由于SE后神经元死亡的主要原因是兴奋性毒性[40]我们重点研究了谷氨酸再摄取和离子型谷氨酸受体的表达水平。
虽然谷氨酸转运体的分子多样性，但在海马体中，约80-90%的谷氨酸再摄取由EAAT2提供[41]. 大多数先前的研究表明，在不同药物诱导癫痫模型的潜伏期，EAAT2表达降低[42，43]，可导致谷氨酸过量和兴奋性毒性。相反，EAAT2过度表达是有效的神经保护机制之一[41，44]. 因此，我们分析了EAAT2和胶质标记GFAP在mRNA上的表达(Slc1a2公司和Gfap公司基因，)和蛋白质水平(). 我们发现Pilo大鼠的EAAT2表达在蛋白质水平上显著降低，但在mRNA水平上没有显著降低。MTEP治疗阻止了EAAT2蛋白表达的下降。
胶质标记物的相对表达(Slc1a2公司和Gfap公司)毛果芸香碱诱导SE后7天，在背海马。每个点代表一只动物；条形图表示平均值，误差条形图表示标准偏差。单向方差分析：Slc1a2：如果2,21= 1.4,第页= 0.3;Gfap公司：如果2,20= 21.5,第页< 0.001. 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：***第页< 0.001.
毛果芸香碱诱导SE后7天背侧海马蛋白质产生的蛋白质印迹数据。对于插入物，上部显示化学发光信号，下部显示胭脂红S。对于条带c（c）是样品校准器，1是Ctrl，2是Pilo，并且三是MTEP组。每个点代表一只动物；列表示平均值，误差条表示标准偏差。单向方差分析，GFAP:F2,17= 29,第页< 0.001; EAAT2:F区域2,17= 4,第页< 0.05. 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：*第页< 0.05, ***第页< 0.001.
基于这些结果，我们可以假设MTEP给药可能会刺激短期胶质细胞活化，并防止EAAT2蛋白生成的下降。因此，用MTEP维持EAAT2表达可能是神经保护机制之一。
2.6. 离子型谷氨酸受体基因表达和蛋白质生产的变化
接下来，我们分析了海马NMDA和AMPA受体基因表达的变化(). 我们发现Grin1、Grin2a、，和格里亚2在Pilo大鼠中（GluN1、GluN2a和GluA2亚单位）减少。然而，MTEP给药恢复了离子性受体亚单位的表达水平。因此，MTEP治疗使毛果芸香碱诱导SE后谷氨酸受体基因表达的变化降至最低。
毛果芸香碱诱导SE后7天，背海马NMDA和AMPA受体亚单位基因的相对表达。亚单位基因：格林1–GluN1，格林2a–GluN2a，格林2b–谷氨酸2b，格里亚1–GluA1，格里亚2–GluA2。每个点代表一只动物；条形图表示平均值，误差条形图表示标准偏差。单向方差分析，格林1：如果2,19= 11.8,第页< 0.001;格林2a：如果2,20= 3.7,第页< 0.05; 如果2,20= 1.7,第页=0.2；格里亚1：如果2,20= 1.8,第页=0.2；格里亚2：如果2,20=9.1时，第页< 0.01. 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：*第页< 0.05; **第页< 0.01.
我们进行了Western blot分析，以检查基因表达特征是否通过蛋白质生产再现。与基因表达结果一致，我们发现Pilo大鼠体内GluN2a亚基的产生减少(). 然而，MTEP处理对Glu2a的产生没有有益的影响。我们发现Pilo和MTEP大鼠中GluA1亚单位的产生显著减少，而基因表达未检测到。有趣的是，MTEP组的GluA2产量低于Pilo组，并且MTEP组GluA2的产量下降持续到慢性期().
毛果芸香碱诱导SE后7天，背海马蛋白质生成的Western blotting数据。对于插入物，每行的上部显示化学发光信号，下部显示Ponceau S。对于条带c（c）是校准样品，1是Ctrl，2是Pilo，并且三是MTEP组。在图表上，每个点代表一只动物；列表示平均值，误差条表示标准偏差。单向方差分析，GluN2A:F2,17= 16,第页< 0.001; GluN2B:F型2,8.62= 3.04,第页= 0.10; GluA1:F型2,16= 25.4,第页<0.001，GluA2:F2,13= 5.1,第页< 0.05. 根据Tukey的事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：*第页< 0.05; **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
2.7. 模型慢性期的行为改变
锂-匹罗卡品模型伴随着动物认知和情绪行为的深刻改变[27，45]. 我们认为，由于mGluR5s参与情绪障碍调节，MTEP治疗可能会预防一些行为共病[46]. 因此，我们在模型的慢性阶段进行了一系列行为测试。
2.7.1. MTEP治疗不能预防癫痫大鼠的抑郁样行为
首先，我们测试了MTEP治疗是否具有长期抗抑郁样作用。为了检测SE后两个月大鼠抑郁行为的迹象，我们在蔗糖偏好试验中测量了无享乐水平。我们发现，与对照组相比，Pilo组和MTEP组的蔗糖溶液消耗量都有所减少(). 有趣的是，在MTEP组中，在测试的第一天就已经观察到明显的快感丧失，这表明类似抑郁的行为在该组中更为突出。
蔗糖偏好测试中的蔗糖溶液消耗量。Welch ANOVA用于统计分析–第1天：F2,14.4= 12.3,第页< 0.001; 第二天：F2,16.6= 7.4,第页< 0.01. 圆圈显示各个值。列表示平均值，误差栏显示平均值的标准误差。星号表示根据Games–Howell事后测试得出的组间差异：*第页< 0.05.
2.7.2. MTEP治疗改变了野外测试中对区域的偏好，但不影响运动过度
对旷野特定区域的偏好可以表征啮齿动物的焦虑[47，48]. 我们分析了在中枢和触轴区所花费的时间，以揭示焦虑样行为。对照组大鼠几乎所有的时间都在触觉传导区，而Pilo组大鼠只有一半的时间在那里(a） ●●●●。在MTEP组中，该参数接近对照组的水平，但仍较低。Pilo大鼠比对照组和MTEP组的大鼠更频繁地穿越开放场中心。
露天测试。(一)在开阔场地的中心和触针区域所花费的时间分布。(b条)露天场地试验中的运动特性*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页Tukey事后检验的单因素方差分析<0.01。
这些结果意味着Pilo大鼠在旷野中的焦虑模式受到了干扰，MTEP给药部分恢复了大鼠的行为。
检查之前在模型中发现的MTEP治疗对运动多动的影响[27]，我们分析了运动活动参数。我们发现，Pilo大鼠在运动中花费的时间比对照大鼠多，同时运动速度也快(b） ●●●●。此外，MTEP大鼠表现出与Pilo大鼠相同的活动参数，表明MTEP不会改变过度活动行为。
2.7.3. 探索行为和认知障碍的减少
我们运行了一个新的对象交互范式，在认知测试之前评估探索行为[49]. 首先，我们把老鼠放在一个熟悉的有机玻璃盒子里，里面有两个相同的新奇物体。我们发现，与对照动物相比，Pilo和MTEP大鼠探索新物体的时间更少(a） ●●●●。这一事实表明癫痫大鼠的探索行为减少。
新物体识别测试中的探索行为和记忆特征。(一)新的对象交互范例：图表显示了与相同对象交互所花费的时间*第页< 0.05, **第页Tukey事后检验的单因素方差分析中<0.01，F2,27= 6.4,第页= 0.005. (b条)新对象识别：左表显示了与新对象和熟悉对象交互所花费的时间差异，右表显示了区分指数（DI），其中+1表示对新对象的偏好，-1表示对熟悉对象的偏好。0表示没有偏好*第页Tukey事后检验的单因素方差分析中<0.05，F2,21= 4.8,第页= 0.02. 在所有图表上，圆圈显示各个值。列表示平均值，误差条表示标准偏差。
接下来，我们在一个熟悉的环境中应用一个新的物体识别任务来测试短时记忆。在第一次尝试使用相同对象时，我们计算了与其中一个相同对象（对象A）进行交互所花费的总时间，之后会在该对象所在的位置出现一个新对象。各组之间没有显著差异。在第二次尝试中，将对象A替换为新对象，并计算与新对象的总交互时间。对照组与新物体互动的时间比其他组长（单向Welch方差分析，F2, 14.9= 5.7,第页<0.001与Games–Howell事后测试第页< 0.05). 对照组大鼠研究新对象的时间长于与对象A的交互时间（重复测量ANOVA F第4页，第44页=3.6，第页对照组T连续两次尝试之间<0.059= 2.53,第页=0.032（成对样本）t吨-试验），这在其他两组中没有观察到。
通过在新物体上花费的时间与熟悉物体上花费时间的差异对新物体的偏好进行分析，结果表明，在MTEP组中，与新物体的交互作用明显不足(b） ●●●●。歧视指数也表明MTEP组没有偏好。这些结果表明识别新物体或工作记忆功能的能力受到干扰。
3.讨论
在本研究中，我们研究了服用MTEP对锂-匹罗卡品癫痫模型潜伏期癫痫发生的影响。我们测量了潜伏期和慢性期的神经状况，发现MTEP不影响体重动力学、存活率和SRS形成，这表明MTEP治疗缺乏抗癫痫作用。然而，我们后来发现MTEP治疗对大鼠海马具有长期的神经保护作用。以前的一项研究表明，在红藻氨酸癫痫模型中，MTEP给药仅具有急性神经保护作用[24].
这项研究的另一个发现是，MTEP给药可以部分预防大鼠海马区的星形胶质细胞增生。海马硬化是模型的特征性损伤[50，51].
在这项研究中，我们测试了小剂量MTEP（1 mg/kg）的效果，此前已经证明，MTEP在kainate诱导的兴奋性毒性模型中具有神经保护作用[24]. 大剂量MTEP（20–40 mg/kg）在幼年大鼠中显示出抗惊厥作用[52]. 然而，高剂量的MTEP有明显的副作用[53，54]. 据我们所知，没有研究调查任何剂量的MTEP的抗癫痫作用，因此我们在研究中只使用了少量的MTEP。
我们试图确定MTEP的神经保护作用机制。众所周知，mGluRs主要在神经元和胶质细胞上表达，并参与调节广泛的信号转导级联[55，56]. 我们假设MTEP的使用可能会影响星形胶质细胞蛋白的表达以及模型潜伏期和慢性期NMDA和AMPA受体的不同亚单位。与之前在锂-匹罗卡品模型中的研究一致，Pilo大鼠海马中GFAP的生成增加[34，57]. 然而，MTEP治疗对这种变化几乎没有影响。
相反，MTEP治疗阻止了另一种星形胶质细胞蛋白EAAT2的表达降低。EAAT2生成减少可能导致兴奋性毒性和神经元死亡，因为留在突触间隙中的谷氨酸将导致其受体过度激活[40]. 在这方面，我们已经确定的EAAT2蛋白水平的变化可能是癫痫发生的机制之一[58]与之前的研究结果一致[59]. 此外，在我们的研究中，MTEP给药有助于在模型潜伏期维持EAAT2在控制水平的表达，这可能是神经保护机制之一。
众所周知，癫痫的特征是离子型谷氨酸NMDA和AMPA受体亚基组成的重排[60，61，62，63，64]，这可能是癫痫发生和神经异常发展的一个因素[27，65，66，67]. 我们发现Pilo组NMDA（Grin1，Grin2a）和AMPA（Gria2）受体亚单位的基因表达降低，这与之前发表的结果一致[61，68，69]. MTEP给药主要维持海马中嗜离子受体亚单位的基因表达在对照水平。然而，MTEP降低了潜伏期和慢性期GluA2蛋白水平的表达，而Pilo组未观察到该亚单位的减少。Pilo和MTEP组仅在潜伏期检测到GluN2a和GluA1的生成减少。因此，MTEP处理使离子型谷氨酸受体基因的表达中断最小化，但在蛋白质水平上没有显著影响。
潜伏期给予MTEP可减少慢性期海马区的星形胶质细胞增生。这可能表明癫痫过程减弱。例如，人类颞叶癫痫中星形胶质细胞的激活与难治性疾病形式有关[70].
mGluR5在癫痫发生过程中具有特殊意义，并促进星形胶质细胞-神经元相互作用模式的复制，这是发育中大脑的特征，允许更有效的突触谷氨酸清除[23]. 此外，mGluR5调节神经胶质对谷氨酸的生理敏感性和病理状态下的活性[37，71]. 然而，激活或抑制mGluR5对胶质细胞和神经变性的影响可能相当复杂，并且取决于所使用的模型。在创伤性脑损伤模型的延迟阶段积极调节mGluR5可以预防神经炎症和神经变性[72]在该模型中，给予（RS）-2-氯-5-羟基苯甘氨酸（CHPG）（mGluR5的激动剂）可降低表达NADPH氧化酶亚基的反应性小胶质细胞的表达，并减少海马神经元的丢失。我们的研究没有发现MTEP治疗会降低星形胶质细胞的活化。然而，我们观察到星形胶质细胞增生减少是一种延迟效应，这在以前没有显示过。
代谢型谷氨酸受体参与情绪调节和障碍[46]因此，潜伏期MTEP治疗可能会影响模型中的行为共病。由于MTEP的抗抑郁作用，我们预计MTEP可以纠正模型中的抑郁行为[73，74]，但这并没有发生。这可能是由于NMDA受体参与实现急性MTEP效应[75].
模型慢性期表现出抑郁样行为[76]其中MTEP不影响NMDA活性。另一方面，MTEP在强迫游泳试验中显示出抗抑郁作用，一些作者声称，该试验反映的静止时间不是抑郁行为，而是被动压力应对策略[77]. 根据这一假设，我们的野外试验结果表明，健康大鼠更喜欢靠近垂直表面（野外的墙壁[78])当皮洛鼠穿过整个竞技场时。MTEP处理大鼠的典型行为模式得到恢复。通常，在中心花费时间的增加被解释为焦虑水平的降低[47，48]. 然而，我们之前的结果[27]建议应根据压力应对策略的变化来解释这些结果。尽管Pilo大鼠表现出较少的焦虑表型，但它们仍然具有高应激反应性。考虑到所有结果，我们倾向于谈论行为策略的变化，但我们无法明确评估大鼠对压力的敏感性和焦虑水平的差异。
在患有颞叶癫痫的大鼠中，海马神经网络中空间信号的低保真度被认为是认知功能障碍的基础[79]. 因此，我们预计由于MTEP的神经保护作用，认知功能会有所改善，但新的物体识别测试反而显示出已经受损的记忆恶化。这种行为可能是癫痫大鼠抑郁样表型的结果[19]可能会伴有认知障碍[80]. 此外，锂-匹罗卡品模型的特点是大脑结构普遍受损[45]因此，海马体的神经保护可能不足以改善认知功能，因为它不能解决网络效率降低的问题[81，82].
本研究表明，MTEP具有显著的长期神经保护作用，并可部分预防星形胶质细胞增生症。然而，单独用作预防性治疗癫痫并不有效。此外，MTEP治疗有助于在模型中更明确地表现焦虑抑郁障碍。
4.材料和方法
4.1. 动物
雄性Wistar大鼠被关在标准的家庭笼子里（每个笼子5-6只），可以自由获取食物和水，12小时黑暗-光明循环（晚上8点黑暗-早上8点光明）。对照组和实验组的大鼠来自不同的窝，以避免任何遗传因素的影响。这些实验是按照RAS的谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所动物护理和使用委员会的规则进行的。这些规则完全符合欧盟动物实验指令2010/63/EU。
4.2. 锂-毛果芸香碱模型与治疗
七周大鼠接受氯化锂（腹腔注射，127 mg/kg；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）在匹罗卡品前一天。在注射毛果芸香碱前1小时，给药（−）-甲基溴东莨菪碱（1 mg/kg，腹腔注射，Sigma-Aldrich）以阻断外周毒蕈碱受体。然后，大鼠接受一次或多次注射毛果芸香碱（i.p.，Sigma-Aldrich），这取决于诱导癫痫发作的强度。根据改良的Racine量表评估癫痫严重程度[27]面部自动症（1）、头低位（2）、前肢肌阵挛（3）、直立（4）、升降（5）、狂奔（6）、全身阵挛性痉挛（7）。第一次注射毛果芸香碱的剂量为10 mg/kg。如果大鼠在30分钟内没有出现4分或以上的惊厥，则每30分钟注射一次额外剂量的毛果芸香碱（10 mg/kg）。第四次注射后没有出现4分或以上惊厥的大鼠被排除在进一步实验之外。4分癫痫发作开始后1小时15分钟，服用地西泮（3-5毫克/千克，静脉注射，西格玛-阿尔德里奇）以停止惊厥。对照组大鼠只接受氯化锂和生理盐水。
地西泮给药后一个半小时，一半大鼠给予MTEP（1mg/kg，i.p.，Sigma-Aldrich，MTEP组），所有其他大鼠接受生理盐水。然后连续五天每天注射一次(). 这种剂量的MTEP已被证明具有神经保护作用[24].
4.3. 癫痫持续状态后大鼠状态评估
SE后7天监测存活率和体重。此时，每天向大鼠皮下注射5%葡萄糖溶液（2mL）以提高存活率。
4.4. 自发性反复发作（SRS）
对SRS的存在进行两次评估：SE后1个月和2个月。将每只大鼠置于单独的透明笼子中，通过连续视频记录进行SRS检测。我们计算了录像期间每一次SRS发作的持续时间和总发作持续时间。此外，如果在处理或行为测试期间观察到SRS，则会在数据库中记录SRS。
一次SRS发作被确定为运动性癫痫。通常，SRS始于面部自动化（在此阶段，大鼠通常会冻僵，这被视为Racine评分的第一阶段）。然后，按顺序完成所有（或仅几个）步骤，大鼠可以进行直立和倒下（拉辛等级的第5阶段），有时会进行狂奔（第6阶段），最后出现全身阵挛性抽搐（第7阶段），然后逐渐消退。无论如何，癫痫发作的结束被认为是大鼠恢复了正常的运动活动。每个SRS的持续时间仅针对录像片段进行测量。
4.5. 行为测试
在模型的慢性期进行行为测试(). 如果大鼠在测试期间出现自发性发作，则将结果排除在分析之外。我们还确保在测试前半小时没有出现癫痫。
4.5.1. 蔗糖偏好测试
我们使用蔗糖偏好测试来评估抑郁样行为（无快感）[76，83]. 试验连续进行了两天。大鼠被放置在单独的笼子里（30×30cm，高=40cm），两个瓶子，第一个装有普通饮用水，第二个装有1%蔗糖溶液。老鼠可以自由接近瓶子。每天测量溶液消耗量。蔗糖偏好是通过蔗糖溶液消耗量与总液体消耗量的比率来计算的。
4.5.2. 开放式现场测试
野外测试用于评估运动活动和焦虑[59]. 露天竞技场直径1米，墙高30厘米，中心照明度为8 Lx。将大鼠置于竞技场中心，然后记录大鼠的运动5分钟。使用Round and Cross软件（俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所）对记录进行离线分析。我们计算了在不同场地区域（竞技场中心（竞技场半径的1/4）和靠近墙壁（距离墙壁不到20厘米，thigmotaxis）花费的时间，以估计焦虑程度。计算总距离、运动时间和速度以确定运动活动。
4.5.3. 新型对象识别测试和新型对象交互范式
新的对象交互范式[49]和新型物体识别测试[84]分别用于探索行为和短时记忆的评估。测试在Plexiglas盒子（60×30 cm和40 cm高）中进行，该盒子位于上摄像头下方。我们用了两对玩具作为新物品(). 选择这些玩具是为了让老鼠一开始没有偏好，不能爬上或坐在上面。
用于新型物体识别测试的物体及其在有机玻璃盒中的相互排列。
测试前一天，将大鼠放在一个没有玩具的有机玻璃盒子里24小时，以减少盒子里的压力水平和探索活动。实验前一天，这些老鼠被放回了家里的笼子里。
测试包括两个5分钟的步骤。在第一步中，将一对相同的玩具放在有机玻璃盒中。将大鼠放在笼子中央，记录其行为5分钟。第一步也被用作与新物体互动的范例。在第二步中，一个玩具换成了一个新的。所有玩具和有机玻璃盒都用0.3%的过氧化氢溶液清洗。
使用Field4W软件（俄罗斯圣彼得堡实验医学研究所）对记录进行离线分析。我们测量了每个物体相互作用的时间：嗅、摸、试着吃玩具。如果总交互时间小于15秒，则将大鼠排除在分析之外。对于新的对象交互范式，分析了第一步与两个玩具交互的总时间。对于新的物体识别测试，我们测量了与每个玩具的交互时间。然后，我们计算小说与熟悉对象的交互时间差异，以及作为差异比率的区分指数，以总结小说与熟悉玩具的交互时间[84].
4.6. 组织制备和Nissl染色
用异氟烷（西班牙巴塞罗那卡里佐实验室）麻醉大鼠，并在SE后70天斩首。然后，快速取出大脑，将一个半球固定在4°C的4%PFA中7天。另一个半球用于Western blot分析。接下来，用30%蔗糖对大脑进行冷冻保护，在冷却的异戊烷（−50°C；78–78-4，异戊烷溶液，Sigma-Aldrich）中冷冻，并在−80°C下储存。
在低温恒温器Bright OTF5000（Bright Instrument Co Ltd.，Huntingdon，UK）上切下20μm厚的额叶连续切片（距前缘−2.6至−3.6 mm），使用硫宁蓝（thionin粉末，T-409，Fisher Chemicals）进行尼塞尔染色[85].
为了进行形态学分析，每五个切片进行一次神经元计数（从一个大鼠海马体中得到8-10个切片）。使用Leica显微镜AF 7000（Leica Microsystems，Wetzlar，德国）在×400倍放大下分析切片。使用ImageJ（美国马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院）计算CA1和CA3细胞层每100μm数字显微照片中的神经元数量。
4.7. 免疫组织化学
将切片在含有0.2%Triton X-100（PBST）的磷酸盐缓冲盐水中培养30分钟，然后在封闭血清（2%正常山羊血清和3%PBST中的牛血清白蛋白）中培养1小时。然后，用小鼠抗GFAP一级抗体（PBST中为1:1000；NBP1-05197；英国阿宾登生物技术有限公司）培养切片在4°C下放置48小时，然后在室温下使用鸡抗鼠IgG交叉吸附二级抗体Alexa Fluor 488（1:500，A-21200；Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）放置2小时。
使用徕卡显微镜AF 7000在400倍放大下分析切片。使用ImageJ评估GFAP阳性物体所占的面积（%）。使用一个海马体的7至10个切片进行分析。
4.8. mRNA表达分析
SE后7天将大鼠斩首。迅速取出大脑并在−80°C下冷冻。根据大鼠大脑图谱，使用OTF5000 Cryostat Microtome（Bright Instruments，Luton，UK）解剖海马背侧区域[65]. 根据制造商的说明，使用ExtractRNA试剂（俄罗斯莫斯科埃夫罗根）提取总RNA。RNA样品用1单位RQ1 DNAse（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）处理15分钟，然后用8 M LiCl（3体积的LiCl比1体积的RNA溶液）沉淀和75%乙醇洗涤。使用NanoDrop™Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific），根据260 nm吸光度和260/280吸光度比，分光光度法评估RNA浓度和纯度。
按照制造商的指示，cDNA由1μg总RNA、寡核苷酸-dT（0.5μg/1μg RNA）和9 mer随机引物（0.25μg/1µg RNA）（DNA合成有限公司，俄罗斯莫斯科）和M-MLV逆转录酶（100单位每1µgRNA；俄罗斯莫斯科埃夫罗根）合成，总体积为20µL。在PCR步骤之前，将所有样品稀释10倍。
使用0.8µL cDNA、0.5单位TaqM-聚合酶（Alkor Bio，俄罗斯圣彼得堡）、3.5 mM Mg进行qPCR，总体积为6µL2+，和特异性正向引物、反向引物和水解（TaqMan）探针（见附录A ). 核苷酸购自DNA合成有限公司（俄罗斯莫斯科）。qPCR反应如下：胶质纤维酸性蛋白(Gfap公司)溶质载体家族1成员2基因(Slc1a2公司编码兴奋性氨基酸转运体2）；NMDAR和AMPAR的亚单位-格林1+格林2a，格林2b+格里亚1+格里亚2; 参考基因的三重qPCR分析Actb公司+Gapdh公司+200万，卢比13a+Ppia公司+斯达、和Hprt1（小时）+第1页+伊瓦兹如前所述[86]. PCR反应在C1000 Touch热循环器和CFX384 Touch™实时PCR检测系统（BioRad，Hercules，CA，USA）中同时进行，无模板和反转录对照样品。根据使用RefFinder在线工具获得的综合排名，选择用于表达数据标准化的参考基因(https://www.heartcure.com.au/reffinder/（于2021年12月29日访问）并入GeNorm[87]、NormFinder[88]，最佳守护者[89]和比较增量CT[90]算法。使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达[91]根据三个最稳定参考基因的几何平均值进行归一化(Ppia公司，伊瓦兹，第1页).
4.9. 西方印迹法
大鼠在癫痫诱导7或60天后被斩首。斩首后，大脑被迅速分离、冷冻，并在解剖前储存在−80°C。与qPCR步骤类似，对背侧海马体进行解剖。样品在150µL裂解缓冲液中均匀化[92]含有100 mM Tris–HCl pH 8.0、140 mM NaCl、20 mM EDTA、5%十二烷基硫酸钠、1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒（皮尔斯蛋白酶抑制剂片，Thermo Fisher Scientific）和1×磷酸酶抑制剂鸡尾液（英国剑桥Abcam的磷酸酶抑制剂二号鸡尾酒），然后在室温下持续搅拌培养1小时。离心后（14000×克10分钟），上清液用于蛋白质定量和进一步分析。如前所述测定蛋白质浓度[93]. 将蛋白质上清液与2×加载缓冲液（125 mM Tris–HCl pH 6.8，40%甘油，4%十二烷基硫酸钠，10%β-巯基乙醇，0.02%溴酚蓝）1:1混合，并在7°C下加热15分钟。将等量的6µg蛋白质等分样品加载到7%聚丙烯酰胺凝胶上，并通过电泳分离（125 V）在还原和变性条件下[94]使用Thermo Scientific PageRuler预保存蛋白质阶梯（10–170kDa；Thermo Fisher Scientic），直到阶梯的34kDa带到达凝胶边界。每个凝胶包含一个校准品样品，该校准品样品是通过混合来自每个对照组和实验组的样品而制备的。如前所述，测定负载蛋白质的量[93]. 电泳后，按照制造商的说明，使用1×Power Blotter 1-Step transfer Buffer（Thermo Fisher Scientific）半湿转移将蛋白质从凝胶转移到20µm硝化纤维素膜上。转移后，用0.1%的Ponceau S（溶于5%乙酸）对膜进行染色，并用ChemiDoc MP成像仪（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）进行可视化，以便随后归一化为总蛋白。将膜在5%的干乳溶液中封闭1小时。用PBST清洗三次后，将其在含有0.05%NaN的PBST溶液中培养（4°C下过夜）三以及以下一种主要抗体：兔抗GFAP（1:2000，ab7260，Abcam）、兔抗EAAT2（1:3000，ab205248，Abcam）、兔抗GluN2a（1:1000，ab169873，Abca姆）、兔对抗GluN2b（1:1000、ab65783，Abcam）、兔对GluA1（1:10000，ab109450，Abcan）或鼠抗GluA2（1:7500，MAB397，Sigma-Aldrich）。然后，用PBST清洗细胞膜六次，每次5分钟，并在含有5%干乳的PBST中的二级抗体溶液（1:60000山羊抗兔IgG-HRP，Pierce，31460，Thermo Fisher Scientific或1:80000山羊抗鼠IgG-HRP，皮尔斯，31430，Thermal Fisher科学）中培养（室温下培养1小时）。用PBST清洗三次后，用SuperSignal™West Pico PLUS化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）检测蛋白质，并用ChemiDoc MP成像仪（Bio-Read）进行可视化。使用相同的膜检测GluA1和GluA2信号。显示GluA2后，将膜在65°C的30%过氧化氢溶液中培养10分钟[95]. 通过类似的可视化方法检测到信号缺失。对于GluA1可视化，重复所有步骤，从牛奶培养1小时开始。使用Image Lab 6.0.1软件（Bio-Read）分析图像。将蛋白质表达归一化为Ponceau染色膜的总蛋白质负荷[96]采用总蛋白标准化方法（Bio-Rad）。将特定蛋白带的光密度与总蛋白的比率归一化为校准样品。
4.10. 统计分析
使用SPSS Statistics 23（IBM，Armonk，New York，NY，USA）和StatSoft Statistica 8（TIBCO，Palo Alto，CA，USA，TIBCO）进行统计分析。在生存分析中，我们使用Kaplan–Meier程序和Breslow标准来检验分布均匀性。Iglewicz和Hoaglin对多个离群值的稳健检验用于识别和拒绝离群值。Kolmogorov–Smirnov和Shapiro–Wilk检验用于检验分布的正态性。学生的t吨-正态分布数据采用检验、单向或重复测量方差分析和Tukey的事后检验。如果违反了方差齐性假设，则使用韦尔奇方差分析和奥运会-豪厄尔事后检验。对于所有测试，组间差异在第页<0.05水平。除非另有规定，否则所有直方图均表示平均值±标准偏差。
附录B
图A1
慢性期背侧海马蛋白质产生的蛋白质印迹数据。对于插入物，上部显示化学发光信号，下部显示胭脂红S。对于带，c（c）是校准样品，1是Ctrl，2是Pilo，并且三是MTEP组。在图表上，每个点代表一只动物；列表示平均值，误差条表示标准偏差。单向方差分析，GluN2A:F2,17= 0.3,第页= 0.75; GluN2B:F型2,17= 0.3,第页= 0.99; GluA1:F型2,16= 1.9,第页=0.19，GluA2:F2,7.1= 8.7,第页= 0.012. 根据Games–Howell事后测试，星号表示各组之间存在显著差异：*第页< 0.05.
作者贡献
概念化、A.V.D.和A.V.Z。；形式分析、A.V.D.、A.A.K.、T.Y.P.、A.V.G.和I.V.A。；融资收购，A.V.Z。；调查、A.V.D.、A.A.K.、M.V.Z.、T.Y.P.、A.V.G.、I.V.S.和I.V.A。；方法、A.V.D.、M.V.Z.、I.V.S.、T.Y.P.和A.V.Z。；撰写原始草稿，A.V.D.、A.A.K.、M.V.Z.、T.Y.P.、I.V.S.和A.V.Z。；写作-审查和编辑，A.V.D.和A.V.Z。所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。
基金
这项研究由俄罗斯科学基金会资助，批准号21-15-00430。
机构审查委员会声明
该研究是根据欧盟动物实验指令2010/63/EU进行的，并得到俄罗斯科学院谢谢诺夫进化生理学和生物化学研究所伦理委员会的批准（伦理许可证编号13-k-a，2018年2月15日）。
数据可用性声明
本研究中提供的数据可根据相应作者的要求获得。
脚注
出版商备注：MDPI对公布的地图和机构关联中的管辖权主张保持中立。
工具书类
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