跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
神经炎杂志。2021; 18: 86.
2021年4月3日在线发布。 doi（操作界面）：10.1186/s12974-021-02135-w
预防性维修识别码：PMC8019185
PMID：33812385

B细胞易位基因2（BTG2）缺失改变白质胶质细胞对慢性脑灌注不足的反应

铃木高茹,1 三原信原,1,2 Yoshihiro Uno先生,3 Yoshitaka Tashiro先生,1 Ghupurjan Gheni公司,1 山本美穗,1 福森昭夫,1,2 秋池信道,4 Tomoji Mashimo先生,3 Hidekazu Tomimoto先生,4和佐藤直树通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料
数据可用性声明

摘要

背景

皮质下缺血性血管性痴呆是血管性痴呆的主要亚型之一，其特征是由慢性脑低灌注引起的腔隙性梗死和白质病变。在本研究中，我们使用双侧颈总动脉狭窄（BCAS）小鼠模型来研究B细胞易位基因2（BTG2）（一种抗增殖基因）在白质胶质细胞对慢性脑灌注不足反应中的作用。

方法

Btg2型−/−小鼠和同窝野生型对照小鼠接受BCAS或假手术。行为表型通过野外试验和Morris水迷宫试验进行评估。分析脑组织白质损伤程度和胶质细胞变化。为了进一步确认Btg2型体外胶质细胞增殖缺失，在野生型和非野生型混合胶质细胞中研究BrdU掺入Btg2型−/−老鼠。

结果

相对于有或无BCAS的野生型小鼠，BCAS治疗Btg2型−/−小鼠自发活动增强，空间学习能力较差。虽然白质病变的严重程度在野生型和Btg2型−/−BCAS后小鼠视束白质中星形胶质细胞标志物GFAP和活化小胶质细胞和巨噬细胞标志物Mac2的免疫反应在BCAS组中较高Btg2型−/−与BCAS治疗的野生型小鼠相比。的表达式级别Gfap公司BCAS治疗组也显著升高Btg2型−/−老鼠。体外分析表明，混合胶质细胞对与脑灌注不足相关的炎症刺激的反应中，BrdU的掺入在Btg2型−/−小鼠比野生型小鼠多。

结论

BTG2负调控胶质细胞增殖，以应对脑灌注不足，导致行为改变。

补充信息

在线版本包含补充材料，请访问10.1186/s12974-021-02135-w。

关键词：BCAS、慢性低灌注、白质损伤、星形胶质细胞、Mac2阳性细胞

背景

皮质下缺血性血管性痴呆是血管性痴呆的主要亚型之一，其特征是由慢性脑低灌注引起的腔隙性梗死和白质病变[1–3]. 通过双侧颈总动脉狭窄（BCAS）在啮齿类动物中建立慢性脑灌注不足模型，在该模型中，微线圈位于双侧颈总血管上[4–6]. BCAS模型小鼠除白质损伤外，还表现出明显的胶质细胞激活，为皮层下缺血性血管性痴呆的机制提供了重要的见解[4]. 由胶质细胞激活定义的脑炎症在中风研究中引起了大量关注[7–10]. 值得注意的是，在动物模型中观察到缺血损伤后胶质细胞（包括星形胶质细胞）的增殖[11–13].

B细胞易位基因2（BTG2，也称为PC3/Tis21）是一种受p53激活调节的抗增殖蛋白[14]最初被描述为由生长因子和肿瘤促进剂在PC12和Swiss 3T3细胞中诱导的即刻早期基因[15,16]. BTG2属于BTG/TOB家族，其成员调节细胞周期进展、凋亡和分化[17,18]. 特别是，BTG2参与了包括细胞周期进展在内的几个生物学过程[14]，诱导细胞衰老[19]，包括神经发生在内的细胞分化[20]，造血[21–24]基因毒性应激反应[14,25,26]以及综合应激反应，如对氧化应激的反应[18,27].Btg2型广泛表达于多个器官，包括肾、肺、前列腺、胰腺、胸腺、骨骼肌和中枢神经系统[18,28–30]. 在老鼠的大脑中，Btg2型在星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞中高度表达(https://www.brainrnaseq.org). 值得注意的是，Btg2型mRNA在脑缺氧缺血反应中的诱导作用[31]在患有肥胖相关糖尿病的AD模型小鼠的大脑中，但在AD模型小鼠或肥胖相关糖尿病小鼠的脑中没有[32]. 此外，Btg2型在BCAS治疗小鼠的慢性脑灌注不足期间也上调[33]. 然而，BTG2在慢性脑灌注不足中的作用尚不清楚。为了回答这个问题，在这项研究中，我们生成了Btg2型−/−小鼠进行了BCAS手术，并分析了运动活动、认知行为、白质损伤和白质中的胶质细胞。

实验程序

动物

所有小鼠具有相同的遗传背景（C57BL/6J）。根据我们研究机构的《实验动物护理和使用指南》，将小鼠分组放置在通风笼中，无浓缩结构，置于特定的无致病性环境中。几种菌株Btg2型负极/负极使用CRISPR/Cas9系统通过电穿孔产生小鼠[34]在大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所工作。简单地说，购买了以下试剂：Cas9 mRNA、T7-NLS-hCas9-polyA（RIKEN BRC#第11330页)和引导RNA（gRNA）。设计gRNA序列（5′-ACATGCTCCCGGAGATCGCC-3′）(http://crispr.mit.edu/)用于预测小鼠基因组中的独特靶点。CRISPR/Cas9介导的DNA切割的特异性由靶向染色体小鼠的单导向RNA（sgRNA）的20碱基序列所赋予Btg2型基因组序列。CCG三核苷酸，即被Cas9识别的原间隔区相邻基序（PAM），位于小鼠起始密码子下游16个碱基处Btg2型基因组序列。通过解冻冷冻胚胎制备原核期小鼠胚胎（CLEA Japan Inc.，Japan）。对于电穿孔，在1 解冻后h放入40个 μl无血清培养基（Opti-MEM，Thermo Fisher Scientific，USA），含400 ng/μl Cas9 mRNA和200 ng/μl gRNA，然后用5 mm间隙电极（CUY505P5或CUY520P5 Nepa Gene，日本千叶）在NEPA21超级电泳器中进行电穿孔。在引入Cas9和gRNA后，小鼠胚胎被转移到用七氟醚麻醉的雌性替代物的输卵管中（Mylan Pfizer Japan Inc.）。我们获得了Btg2型−/−11 bp缺失的小鼠Btg2型基因组序列。用以下引物PCR确认基因型：正向：5′-CTCCCCCGAGTGGTTATGAAAG-3′，反向：5′-TCAAGGTTCAGGCG-3′。当用6%丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物时，检测到两种产物：220 bp，表示Btg2型删除，和231 bp，表示野生型。野生型和野生型PCR产物的Sanger测序Btg2型−/−使用相同的一组引物（日本GENEWIZ、日本斋玉）对小鼠进行试验。为了排除非目标效应，杂合Btg2型+/−将小鼠回交六代至野生型C57BL/6J小鼠。

BCAS手术

BCAS的手术程序如前所述[4]. 简单地说，小鼠习惯于在手术室自由进食和饮水3-5次 手术前26天 °C，12小时/12小时光/暗循环。9-11周龄野生型小鼠和Btg2型−/−室友（体重，22–28 g） 接受BCAS或假手术。手术前，小鼠腹腔内注射三种麻醉药的组合：0.3 mg/kg盐酸美托咪定（日本曾耀县，日本福岛），4.0 mg/kg咪达唑仑（Astellas，日本东京）和5.0 mg/kg酒石酸布托啡诺（日本岐阜明治精工制药公司）。对于假手术小鼠，暴露颈总动脉（CAA）并小心地将其从鞘中取出。对于BCAS处理的小鼠，将0.18mm内径的微型线圈（日本静冈Samini）双侧连接到CAA上。手术后3.0 腹腔注射盐酸美托咪定拮抗剂盐酸阿替帕米唑（日本曾亚库Kogyo）mg/kg，以促进安全苏醒。为了在手术后保持体温，37岁时用加热垫加热小鼠 摄氏度。

行为测试

评估Btg2型删除BCAS模型的行为，我们进行了旷野和Morris水迷宫测试。手术后一个月，进行旷野试验：将小鼠置于一个立体塑料盒（30×30×30）中 厘米3，宽×长×高），允许自由漫游15次 术后一个半月，如前所述，进行Morris水迷宫测试以测试空间学习和记忆[35,36]. 试验在一个充满调节至环境温度的水的圆形水池中进行。对于隐藏平台训练，将透明平台浸没1.5 水位以下cm。游泳池位于一个有许多外部线索的测试室中。在第1天，进行了一个准备阶段，给小鼠90只 s为无平台自由泳，随后进行两次有平台训练试验（1次）。从第2天到第5天，每天进行四次训练试验（两次训练）。在每次试验中，将小鼠从四个伪随机指定的起点释放，并允许它们游泳90次 s.试验间隔约为10 分钟，间歇时间为2 h.登上平台后，允许小鼠在那里停留10天 然后将其放置在带有加热灯的保温笼中，直到下一次试验开始。如果一只老鼠找不到平台，它会被引导到平台上，并允许在平台上休息10分钟 s.进行探针测试24 最后一次隐蔽平台训练后h。在探针测试中，移除了隐藏的平台，并从相反的象限释放了老鼠，允许其自由游泳60次 s.在同一天最后一次探针测试后进行的可见平台测试中，平台被提升至水面以上。这些小鼠进行了三次持续90分钟的试验 所有实验都是在每天大约相同的时间进行的。在旷野和莫里斯水迷宫测试中，使用头顶摄像机跟踪小鼠的运动，并使用ANY迷宫软件（日本东京室町Kikai）对视频进行分析。

组织收集和制备

手术后7周，用异氟醚（日本大阪富士华高纯化学公司）麻醉小鼠，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）加完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒经心灌注（瑞士巴塞尔罗氏诊断公司）。灌注后，大脑从颅骨中取出并沿矢状面分割。右半球分为皮层、海马区和其他区域，冷冻在液氮中，储存在−80 °C直到生化分析。左半球用4%多聚甲醛/PBS固定过夜，并包埋在石蜡中进行组织学分析。为了进行生物化学分析，将组织在生物粉碎机（BioSpec Products，Bartlesville，OK，USA）中粉碎，该粉碎机已在干冰上预冷，然后在−80下储存 摄氏度。

定量实时PCR

使用RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒（荷兰芬洛QIAGEN）从粉碎样品中纯化总RNA，在无核酸水中洗脱，并储存在−80 摄氏度。使用ReverTra-Ace qPCR RT Master Mix与gDNA去除剂（日本大阪TOYOBO）进行逆转录。使用Luna Universal qPCR Master Mix（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）在i1000热循环器上进行实时PCR，以检测Btg2型,Btg1型,Btg3型,Btg4型,Tob1（Tob1）,Tob2（Tob2）,Gfap公司,Cd11b号,特雷2,数据12,45加元,抄送68,80层/四层,镉14，以及β-肌动蛋白使用了以下引物：Btg2型，正向CGGGAGAGAACCGACATGC，反向5′-GCCCCTACTGAAAAACCTTGAGTC-3′；Btg1型，正向5′-CACACATAGAGCGAGATCG-3′，反向5′-TGCGATACAACGGTAACCTG-3′；Btg3型，正向5′-AAGAAGAAATTGCGGCTGTT-3′和反向5′-CATCGGGATCACTCTGAAC-3′；Btg4型，正向5′-TTCAAGGGCAGGCTTTTAG-3′，反向5′-ACCTCATAGGATCGACCATA-3′；Tob1（Tob1），正向5′-ATGCAGCTTGAAATCCAAGTAG-3′和反向5′-AGGATACCTGCCCTTCATT-3′；Tob2（Tob2），正向5′-GCTGAGAGCGGCTTTCTGAGAAA-3′，反向5′-ACCACAGGGTCTACCTCC-3′；Gfap公司，正向5′-CGGAGACGCATCACCTCTG-3′和反向5′-AGGGAGTGAGGAGTCATCG-3′；镉11b，正向5′-GCATGTCAAGAAGAGAGAGATA-3′，反向5′-CTAAGCAGGTCATAAG-3′；特雷2，正向5′-TGCTGGCAAAGGAAAGGTG-3′，反向5′-GTGTGGGCTGGGAGAGAGG-3′；数据12，正向5′-GTTGACTCTGCTGATTGCCT-3′和反向5′-CCTTCCGCTGTCCCTTGA-3′；45加元，正向5′-GCCAAAACATATTACAT-3′和反向5′-TTAGGCGTTTCTGGAATC-3′；抄送68正向引物5′-CCATCAGGGTGGAAGA-3′和反向引物5′-TTGCATTCCACAGCAGAAG-3′；80层/四层，正向5′-ATGGACAAACCAACTTTCAAGGC-3′，反向5′-GCAGACTGAGTTAGGACCAA-3′；镉14，正向5′-CTCGTCCTTAAGCGGCTTAC-3′和反向5′-GTGCGGAGGTTCAAGATGTT-3′；和β-肌动蛋白，正向5′-AGTTGACGTTGACATCCGTTA-3′和反向5′-GCCAGAGAGTAATCTCCTTC-3′（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA，USA）。所有引物序列均来自PrimerBank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank网站)除了那些80层/四层和镉14[37],特雷2和数据12[38]、和Cd11b号和45加元[39]. 使用iCycler-iQ软件（Bio-Rad）量化和分析相对表达水平。使用ΔΔCt方法计算相对mRNA水平β-肌动蛋白作为每个特定基因扩增反应的内部控制。

ELISA检测

假手术/BCAS处理野生型和Btg2型−/−如前所述，通过ELISA测定小鼠大脑[38]. 简而言之，使用Polytron均质机（瑞士吕宋Kinematica）在冰镇RIPA裂解缓冲液（10 ml/g湿重；MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿，美国）含有0.1%SDS和完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。10万离心后克对于1 4时为小时 °C，上清液用适当的抗体组进行校准和ELISA分析。与辣根过氧化物酶（HRP）连接的Avidin-D（Vector Laboratories，加利福尼亚州伯林盖姆，美国）或抗兔IgG（H+L）、HRP结合物（美国威斯康星州麦迪逊，普罗米加）和3,3′，5,5′-四甲基联苯胺底物（美国密苏里州圣路易斯，西格玛-奥尔德里奇）孵育后，在iMark平板阅读器（Bio-Rad）上进行比色定量。使用蛋白质测定BCA试剂盒（Fujifilm Wako Pure Chemical）测定每个样品中的蛋白质浓度。

组织学准备

用切片机（SM2000R，Leica Microsystems，Wetzlar，德国）将石蜡包埋的脑样品切片至5μm厚。包括海马区在内的四个非相邻切片被安装在MAS（Matsunami粘合载玻片）涂层玻璃载玻片上（日本大阪Matsunamic glass Ind.）。在组织学检查之前，将这些组织样本保存在室温下。

Klüver–Barrera染色

石蜡包埋部分进行脱蜡、水合，并在65℃下浸入Luxol Fast Blue溶液（Muto Chemical，Tokyo，Japan）中 °C过夜。切片在室温下冷却，在95%乙醇中冲洗，用0.1%碳酸锂处理，用70%乙醇冲洗，用含有10%乙酸的0.1%甲酚紫醋酸酯（复合化学）复染，并用Entellan New（Merck Millipore）进行安装。切片在BZ-X810显微镜上进行分析（日本大阪Keyence）。利用白质区（视束和胼胝体）的图像，将白质病变的严重程度分为四个等级，如Wakita等人所述[40]正常（0级），神经纤维排列紊乱（1级），明显空泡形成（2级），有髓纤维消失（3级）。评分由三个人以盲法进行。

免疫组织化学

对于免疫组织化学，脑切片脱蜡，水合，用0.1%Triton-X/PBS处理，用3%H处理2O（运行）2内源性过氧化物酶失活溶液。在使用1%BSA/PBS封闭后，将切片与以下初级抗体在4 °C过夜：兔抗GFAP多克隆（#1 IS524，安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国，1:1稀释），兔抗Iba1多克隆（#019-19741，富士胶片Wako Pure Chemicals，1:100稀释），大鼠抗Mac2单克隆（#CL8942AP，CEDARLANE，加拿大伯灵顿，1:1000稀释）。在PBS中清洗三次后，用辣根过氧化物酶（HRP）结合二级抗体（#W401B，山羊抗兔IgG，美国威斯康星州Promega，或#AP136P，山羊抗鼠IgG；Merck Millipore）处理切片，在1%BSA/PBS中稀释1:2500，2次 室温下h。在PBS中洗涤三次后，用过氧化物酶底物Impact DAB（Vector Laboratories）处理HRP标记的载玻片。染色切片在BZ-X810显微镜上观察。为了进行免疫荧光观察，在室温下用抗兔IgG Alexa Fluor 488（#A11008，Thermo Fisher Scientific，OR，USA）或抗鼠IgG Alexa Fluxo 546（#A11081，Thermo-Fisher科学）在1%BSA/PBS中稀释1:100培养切片。荧光标记的切片用DAPI（Vector Laboratories）安装在VECTASHIELD安装介质中，并在LSM700共焦激光显微镜上观察（德国Oberkochen Zeiss）。

细胞培养和BrdU掺入分析

如前所述进行混合胶质细胞培养[41,42]. 简单地说，从17.5–19.5野生型和Btg2型−/−小鼠胚胎。20–25岁 体外培养第天（DIV），将胶质细胞接种在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12中，密度为0.5×10512孔培养板中圆盖玻璃上的细胞/孔。对于炎症刺激，用100 ng/ml脂多糖（LPS）（Fujifilm Wako Pure Chemical），10 U/mlγ干扰素（IFNγ）（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）或100 纳克/毫升LPS加10 U/ml IFNγ，如前所述[43]. 48岁之后 h、 细胞与10个 μM 5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）（BrdU-免疫组织化学试剂盒，#ab125306，Abcam，Cambridge，UK）24 h，同时暴露于炎症刺激或控制条件下。为了检测BrdU掺入的细胞，用10%H处理固定细胞2O（运行）2/MeOH与胰蛋白酶溶液和变性溶液反应，并与检测抗体（BrdU免疫组织化学试剂盒，Abcam）孵育。用Alexa Fluor 568-共轭抗羊IgG（#ab175713，Abcam）孵育后，用DAPI将细胞安装在VECTASHIELD安装培养基中。在LSM700显微镜上进行细胞学观察。

为了鉴定含有BrdU的混合胶质细胞中的星形胶质细胞和小胶质细胞，我们使用抗BrdU抗体和抗GFAP/抗Iba1抗体进行双重免疫染色。用0.3%Triton-X/PBS处理后，在0.01 M Tris-EDTA（pH 9.0）。用1%BSA/PBS封闭1天后 h、 将固定细胞与抗BrdU单克隆抗体（#66241-1-lg，ProteinTech，稀释1:300）和抗GFAP多克隆抗体（#IS524，Agilent，稀释1:1）或抗Iba1多克隆抗体在4℃孵育过夜 摄氏度。接下来，将样本培养2个 在室温下，用二级抗体、抗鼠IgG Alexa Fluor 546偶联物和抗兔IgG Alexa Flu 488偶联物（分别为#A11003和#A11008，Thermo Fisher Scientific，稀释比例为1:100）在室温下放置h。标本用DAPI安装在VECTASHIELD中，并在BZ-X810显微镜下观察。

统计分析

所有统计分析均使用JMP Pro软件（14.2版，SAS Institute，Cary，USA）进行。在动物实验中，通过（1）根据性别调整的线性回归模型，然后进行Tukey’s HSD检验（当包括两种性别时），或（2）单因素方差分析，然后进行Tukey–Kramer检验或Dunnett多重比较检验（当只包括一种性别时），来分析每种基因型是否患有BCAS的影响。Morris水迷宫测试结果采用重复测量单因素方差分析（ANOVA）和Tukey–Kramer测试进行分析。对于BTG/TOB家族的基因表达分析，Student’st吨-试验用于比较两种基因型。在细胞实验中，通过单向方差分析（ANOVA）和Tukey–Kramer检验分析基因型对治疗前后的影响。我们使用标准平均误差（SEM）作为图中按性别划分的调整值。​图3，3,​,4,4，以及​和5，5和补充数字1,2，以及3和图中非调整值的标准偏差（SD）。​图2，2,​,7,7，以及​和8，8和补充数字4和5.第页-小于0.05的值被认为是显著的。个人效应Btg2型用二元或三元方差分析（补充表1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig2_HTML.jpg

mRNA水平Btg公司/Tob公司家庭成员一 Btg1型,b条 Btg2型,c（c） Btg3型,d日 Btg4型,e（电子） Tob1（Tob1），以及（f） Tob2（Tob2）在女性野生型和Btg2型−/−老鼠(n个=3/组）。平均值±标准差*第页< 0.05，学生的t吨-测试

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig3_HTML.jpg

假手术/BCAS治疗野生型和Btg2型−/−老鼠。一,b条总行驶距离(一)和平均速度(b条)在野外试验中。数据为调整平均值±SEM**第页< 0.01，根据Tukey的HSD测试确定。c（c）在为期5天的Morris水迷宫测试训练试验中，每天的平均逃生潜伏期。数据为调整平均值±SEM**第页< 0.01和***第页< 0.001与第1天和第5天的分数相比，这是通过重复测量的单向方差分析和Tukey的HSD测试确定的。不另作说明，不重要

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig4_HTML.jpg

sham/BCAS处理野生型和Btg2型−/−老鼠。一,b条胼胝体(一)和视路(b条)进行Klüver–Barrera染色。黑色箭头显示髓鞘纤维空泡化。比例尺=20 微米。c（c）,d日胼胝体白质病变的严重程度(c（c）)和视路(d日). 所有小鼠均为雄性。数据为调整平均值±SEM**第页< 0.01和***第页< 0.001，根据Tukey的HSD测试确定

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig5_HTML.jpg

假手术/BCAS处理的野生型和Btg2型−/−老鼠。一GFAP（上部）、Iba1（中部）和Mac2（下部）染色。比例尺=20μm。OT位于白色虚线内。b条调整性别后，比较各组间的免疫反应（IR）面积。数据为调整平均值±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01，以及***第页< 0.001，由Tukey的HSD测试确定

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig7_HTML.jpg

sham/BCAS处理野生型和Btg2型−/−老鼠。mRNA水平一 Gfap公司，星形胶质细胞标记物；b条 Cd11b号小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞标记物；c（c） 特雷2和d日 数据包12疾病相关小胶质细胞（DAM）标记物；e（电子） 45加元，一种泛造血标记物；（f） 抄送68巨噬细胞标志物；克 80层/四层成熟巨噬细胞标志物；和小时 镉14，单核细胞和巨噬细胞标记物，在组间进行比较。所有小鼠均为雄性。数据为平均值±SD*第页< 0.05，由Dunnett的多重比较试验确定。不另作说明，不重要

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig8_HTML.jpg

5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）在野生型和非野生型混合胶质细胞中的细胞增殖分析Btg2型−/−老鼠。一载体对照处理的BrdU阳性细胞（红色）和DAPI阳性总细胞（蓝色）的图像，100 纳克/毫升LPS，10 U/ml干扰素γ或100 纳克/毫升LPS+10 U/ml干扰素γ。比例尺=100 微米。b条比较各组间BrdU阳性细胞占DAPI阳性细胞总数的百分比。平均值±SD*第页< 0.05, **第页< 0.01，以及***第页< 0.001，由Tukey–Kramer测试确定

结果

开发Btg2型−/−老鼠

评估Btg2型在慢性脑灌注不足中，我们产生英国热量2−/−小鼠基因组编辑（图。​（图1a-c）。1a–c）。RT-PCR显示Btg2型mRNA缺失Btg2型−/−鼠标（图。​（图1d）。1d） ●●●●。由于BTG2属于BTG/TOB家族，我们询问BTG/TOB家族其他成员的表达是否通过补偿机制上调Btg2型−/−老鼠。然而，BTG/TOB家族其他成员的表达水平在英国热量2−/−鼠标（图。​（图2），2)，建议删除Btg2型不会因其他家庭成员的上调而得到补偿。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig1_HTML.jpg

开发Btg2型−/−小鼠基因组编辑。一显示目标序列。黑色箭头表示用于基因分型的引物对，白色箭头表示用于实时PCR的引物组。PAM，原间隔-相邻基序。b条野生型小鼠（上部）和Btg2型−/−老鼠（底部）。从小鼠外显子I中删除了11个碱基Btg2型基因。c（c）野生型（+/+）、杂合缺失（+/-）和纯合缺失的基因分型模式(负极/负极)第页，共页Btg2型在6%丙烯酰胺凝胶上分离。d日野生型（+/+）和纯合子缺失的全脑RNA的RT-PCR产物Btg2型(负极/负极)，在2%琼脂糖凝胶上分离。β-actin被用作负荷控制

BCAS治疗的行为特征Btg2型−/−老鼠

我们治疗了Btg2型−/−有或无BCAS的小鼠和同窝野生型小鼠。手术后一个月，通过开放式现场测试对行为变化进行初步评估。总行驶距离（图。​（图3a）3a） 和平均速度（图。​（图3b）3b） BCAS治疗组显著升高Btg2型−/−老鼠(第页< 0.01). 开放场外部或内部的旅行距离与总场的比率（分别是焦虑或探索行为的指标）在各组之间没有显著差异（补充图。1).

然后，我们使用Morris水迷宫测试检测空间学习能力；实验包括5天的训练试验和一次探索性测试。我们在可见平台测试的结果中没有观察到显著差异（数据未显示）。假手术野生型、BCAS治疗野生型和假手术Btg2型−/−与第一天相比，各组在第五天的逃生潜伏期显著降低(第页< 0.01,第页< 0.01，以及第页< 分别为0.001，图。​图3c）。3c） ●●●●。相比之下，在BCAS治疗的Btg2型−/−组，我们没有观察到逃逸潜伏期的减少(第页=0.3306，图。​图3c），3c） 表明BCAS的空间学习能力Btg2型−/−与其他小鼠相比，小鼠受损。在探针测试中，我们观察到各组在目标象限的时间没有显著差异（补充图。2).

BCAS治疗后白质的组织学观察Btg2型−/−老鼠

评估Btg2型BCAS治疗后白质病变缺失，我们在行为评估后通过Klüver–Barrera染色对白质进行组织学检查。白质（胼胝体和视束）中髓鞘纤维的外观根据Wakita等人所述的病变严重程度进行分级[40]. 尽管BCAS治疗后胼胝体和视束病变的严重程度显著增加，但我们观察到野生型和Btg2型−/−有或没有BCAS的小鼠（图。​（图44).

BCAS治疗中胶质细胞标志物的评估Btg2型−/−老鼠

评估Btg2型胶质细胞对BCAS的反应缺失，我们使用抗GFAP、抗Iba1和抗Mac2抗体进行免疫组织化学分析（图。​（图5）。5). BCAS可显著增加视束GFAP免疫活性区。此外，BCAS治疗还增加了小鼠的GFAP-和Mac2免疫反应区Btg2型−/−小鼠相对于野生型小鼠（图。​（图5b）。5b） ●●●●。BCAS治疗组的Iba1免疫活性区更大Btg2型−/−小鼠比假手术野生型小鼠。在胼胝体中，BCAS治疗后，我们观察到视束中GFAP和Iba1免疫反应的类似趋势，但在含有GFAP和Mac2免疫反应区的小鼠中没有显著差异Btg2型删除（补充图。3). 为了研究Mac2和GFAP或Iba1阳性细胞之间的关系，我们进行了双重染色（图。​（图6）。6). 虽然大多数Mac2阳性细胞不含GFAP或Iba1免疫反应，但在一些细胞中观察到Mac2和GFAP或伊巴1免疫反应的共同定位（图。​（图6a6a和b）（白色箭头）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为12974_2021_2135_Fig6_HTML.jpg

Mac2和GFAP免疫反应的共定标(一)Mac2和Iba1免疫反应(b条)BCAS治疗的视路（OT）Btg2型−/−老鼠。GFAP和Iba1阳性细胞显示为绿色荧光，Mac2阳性细胞显示红色荧光。白色箭头显示Mac2和GFAP的共同本地化(一)或Iba1免疫反应(b条). 蓝色荧光显示DAPI染色的细胞核。OT在虚线的右侧。比例尺=20 微米

为了通过其他方法分析这些胶质细胞的变化，我们进行了实时PCR，以量化以下代表性标记物的mRNA水平：Gfap公司（星形胶质细胞），Cd11b号（小胶质细胞、单核细胞和巨噬细胞），特雷2和数据12（疾病相关小胶质细胞[DAM]），45加元（泛造血），抄送68和80层/四层（巨噬细胞），以及镉14（单核细胞和巨噬细胞）。我们分析了大脑皮层和海马区。虽然我们分析的小鼠比组织化学分析中的少，但我们仍然可以看到Gfap公司在Btg2型−/−老鼠(第页=0.0484，与假处理野生型小鼠相比；第页=0.0362，与BCAS治疗的野生型小鼠相比；第页=0.0406，vs.假-处理过的Btg2−/−小鼠；Dunnett的多重比较测试）。45加元BCAS治疗组的信使核糖核酸水平也显著升高Btg2型−/−与sham处理的野生型小鼠相比(第页=0.0490）。另一方面Cd11b号,特雷2,数据12,抄送68,80层/四层，以及镉14(第页= 0.1606,第页= 0.340,第页= 0.307,第页= 0.1634,第页=0.7505，以及第页分别=0.0923；单因素方差分析）显示无显著差异，尽管BCAS治疗Btg2型−/−小鼠通常表达的这些mRNA水平高于其他组（图。​（图77).

我们还分析了同一地区这些胶质细胞标记物的蛋白质水平，使用ELISA来确认实时PCR结果。虽然没有观察到显著差异，但可能是由于受检小鼠数量较少，但在BCAS治疗的小鼠中，GFAP的水平往往较高Btg2型−/−与其他组小鼠相比，实时PCR结果一致。各组间小胶质细胞标记物CD11b的水平没有显著差异（补充图。4).

胶质细胞增殖Btg2型−/−小鼠对炎症刺激的反应

BCAS模型得出的结果表明Btg2型缺失可增加脑灌注不足时胶质细胞的增殖。为了进一步确认英国热量2在体外对胶质细胞增殖的缺失，我们对来自野生型和Btg2型−/−老鼠。据报道，为了模拟脑灌注不足期间的促炎状态，混合胶质细胞在有或无炎症刺激（LPS和IFNγ）的情况下进行处理[43]（图。​（图8）。8). 细胞增殖率计算为加入BrdU的细胞与DAPI染色的总细胞的比率。LPS、IFNγ和LPS+IFNγ组的BrdU阳性细胞与总细胞的比率显著低于对照组。这一结果与先前的观察一致，即LPS和IFNγ等炎症刺激诱导增殖的原代胶质细胞分化为活化的胶质细胞[44]. 重要的是，BrdU阳性细胞与总细胞的比例在Btg2型−/−LPS和LPS+IFNγ处理后的胶质细胞比野生型胶质细胞中的胶质细胞多，但单独使用IFNγ治疗后没有观察到显著差异（图。​（图8a，8a、 b）。用抗BrdU和抗GFAP或抗Iba1抗体对混合胶质细胞进行共免疫，结果显示Btg2型缺失改变了星形胶质细胞对炎症刺激的反应，但小胶质细胞没有改变（补充图。5).

讨论

虽然BTG2是一种抗增殖蛋白，在缺血应激后其表达增加，但尚不清楚该蛋白的缺失是否会影响脑灌注不足后胶质细胞数量的增加。在这项研究中，我们发现Btg2型BCAS后增加了视束白质中星形胶质细胞和Mac2阳性细胞的丰度，尽管野生型和野生型白质病变的严重程度没有显著差异Btg2型−/−老鼠。

先前的研究发现，假手术和BCAS治疗的野生型小鼠在运动活动（由旷野试验确定）或空间学习能力（由Morris水迷宫确定）方面没有差异[5,20]. 我们的发现与这些研究一致。此外，我们观察到BCAS治疗后的行为改变Btg2型−/−与BCAS处理的野生型小鼠相比，小鼠的运动活性在旷野试验中增加，在Morris水迷宫试验中，其空间学习能力较弱。野生型和野生型之间，开阔田地外部或内部的行进距离与总田地之间的比率没有显著差异Btg2型−/−BCAS治疗后，表明BCAS治疗组的运动活性增加Btg2型−/−小鼠与焦虑或探索行为无关。由于BTG2是一种在胶质细胞中高度表达的抗增殖蛋白，这些行为差异可能是由于以下因素引起的这些细胞的改变Btg2型删除。

BCAS治疗加重了白质病变，增加了GFAP免疫反应，而与Btg2型删除，与以前的报告一致[4]. 此外，BCAS处理组GFAP和Mac2的免疫反应性显著升高Btg2型−/−与BCAS处理的野生型小鼠相比（图。​（图5），5)，尽管白质病变没有差异（图。​（图4）。4). 与此一致，Gfap公司BCAS处理的mRNA水平较高Btg2型−/−小鼠比假处理小鼠Btg2型−/−小鼠，而我们在有或没有BCAS的野生型小鼠之间没有观察到差异（图。​（图7）。7). 脑缺血诱导Gfap公司缺血应激后几周的mRNA水平[45,46]. 尽管Gfap公司经sham处理和BCAS处理的野生型小鼠的mRNA水平具有可比性7 手术后数周Gfap公司BCAS处理的mRNA水平Btg2型−/−此时小鼠可能仍处于升高状态。这些结果表明BTG2负调控星形胶质细胞增殖。

Mac2，也称为半乳糖凝集素-3，首次被报道为由单克隆抗体定义的巨噬细胞特异性抗原[47]. 它不仅在活化的小胶质细胞和巨噬细胞/单核细胞中表达，也在星形胶质细胞中表达[48]. 我们检测了经BCAS治疗的白质中Mac2和GFAP或Iba1的共同定位Btg2型−/−并观察到大多数Mac2阳性细胞不是GFAP或Iba1阳性。因此，我们认为在BCAS治疗后变得更丰富的Mac2阳性细胞可能是单核细胞/巨噬细胞。尽管Gfap公司mRNA水平显著升高，小胶质细胞和巨噬细胞/单核细胞标记物mRNA水平无显著差异45加元，泛造血标记。BCAS处理后Mac2-阳性细胞丰度增加的进一步表征Btg2型−/−老鼠是必要的。

为了确定BTG2是否在炎症刺激下负性调节胶质细胞增殖，我们使用来自野生型和Btg2型−/−老鼠。在混合胶质细胞中，BrdU对与脑缺血条件相关的炎症刺激的反应更大Btg2型−/−与野生型小鼠相比[49–51]. 这一结果与多项研究报告一致，即BTG2在乳腺癌中发挥抗增殖作用[52,53]，胰腺癌[54]和通过调节骨形态发生的脊椎模式[55]，轴向骨架的同源变换[56,57]和压力响应[18]. 此外，我们的研究首次表明，BTG2在慢性脑低灌注模型中调节星形胶质细胞增殖。

这项研究有几个局限性。首先，我们使用混合胶质细胞在体外检测BrdU掺入，但不在分离的星形胶质细胞或小胶质细胞中。通过使用抗BrdU和抗GFAP或抗Iba1抗体对混合胶质细胞进行联合免疫染色，我们观察到炎症刺激的反应被Btg2型星形胶质细胞缺失，小胶质细胞无缺失。然而，尚不清楚这些作用是否对星形胶质细胞具有Btg2型缺失是细胞自主的或非细胞自主的。这种体外培养系统也不包括巨噬细胞/单核细胞，尽管我们观察到的Mac2阳性细胞可能是巨噬细胞/单核细胞。在未来的研究中，我们将使用条件细胞类型特异性缺失来检测BTG2对每种细胞类型增殖的影响Btg2型其次，我们无法确定为什么BCAS中星形胶质细胞和Mac2阳性细胞的丰度增加Btg2型−/−小鼠与BCAS治疗的野生型小鼠在视束中观察到，但在胼胝体中没有观察到。这一观察结果可能与缺血性应激易感性的区域差异或Btg2型事实上，以前的研究报告了神经肽分布的地区差异[58]和一氧化氮合酶[59]在脑血管中。最后，尽管我们已经尝试了几种抗BTG2抗体，包括商业抗体和实验室开发的抗体，但在野生型和Btg2型−/−老鼠。需要使用BTG2特异性抗体进行进一步研究，以充分确定BTG2在慢性脑灌注不足期间何时何地发挥调节胶质细胞增殖的功能。

结论

删除Btg2型导致与胶质细胞，尤其是星形胶质细胞和Mac2阳性细胞的反应改变相关的行为改变。此外，我们的体外实验支持BTG2负调控胶质细胞增殖的观点。这些结果表明，BTG2可能在脑灌注不足时作为胶质细胞中的一种抗增殖蛋白，从而保护血管性痴呆。

补充信息

附加文件1：补充图1。野外测试中的焦虑/探索性参数。通过Tukey的HSD测试比较各组在内区（a）或外区（b）内行驶的距离与总行驶距离的比率。数据为调整后的平均值±SEM.n.s.，不显著。补充图2。莫里斯水迷宫测试的探针测试结果。NE：东北象限区；NW：西北；东南：东南；西南：西南。平台位于东北象限区域（目标象限）。比较各组在每个非目标象限花费的时间和在目标象限花的时间。数据调整平均值±SEM***第页< 0001; Tukey–Kramer测试。使用的小鼠数量如下：野生型+Sham，n=13；野生型+BCAS，n=15；Btg2型-/-+Sham，n=11；Btg2型-/-+BCAS，n=16。补充图3。sham/BCAS处理野生型和非野生型胼胝体（CC）胶质细胞的免疫组织化学观察英国热量2-/-老鼠。（a） GFAP（上部）、Iba1（中部）和Mac2（下部）染色。比例尺=20μm。CC位于白色虚线内。（b） 调整性别后，比较各组间的免疫反应（IR）面积。调整后的平均值±SEM**第页<0.01和***第页<0.001，根据Tukey的HSD测试确定。不另作说明，不重要。补充图4。假手术/BCAS治疗野生型和Btg2型-/-老鼠。所有小鼠均为雄性。数据为平均值±标准偏差。差异通过Dunnett的多重比较试验进行评估。不另作说明，不重要。补充图5。使用5-溴-2’-脱氧尿苷（BrdU）在野生型和非野生型混合胶质细胞中进行细胞增殖分析Btg2型-/-老鼠。样本与抗GFAP（a和c）或抗Iba1抗体（b和d）联合免疫染色。图像显示经溶媒对照、100 ng/ml LPS、10 U/ml IFNγ或100 ng/ml LPS+10 U/ml IFNγ处理的BrdU阳性细胞（红色）、DAPI阳性细胞（蓝色）和GFAP阳性细胞（绿色，a）或Iba1阳性细胞（绿，b）。比较各组间BrdU和GFAP（c）或Iba1（d）双阳性细胞的比例，即总GFAP（c）或Iba（d）阳性细胞的百分比。平均值±SD*第页<0.05，以及***第页<0.001，由学生确定t吨-测试。比例尺=100μm。补充表1。二元或三元方差分析结果（773K，docx）

致谢

我们感谢国家老年医学和老年病学中心（NCGG）衰老神经生物学系的实验室成员和森田龙之博士参与了有益的讨论。此外，我们感谢NCGG的Noboru Ogiso博士和Tetsuya Kimura博士对动物设施的管理。

缩写

基站2B细胞易位基因-2
BCAS公司双侧颈总动脉狭窄
GFAP公司胶质纤维酸性蛋白
伊巴1电离钙结合适配器分子-1

作者的贡献

佐藤构思并设计了这项研究，并撰写了手稿。铃木设计并执行了实验，分析了数据，并撰写了手稿。Y.Tashiro、G.Gheni和A.Fukumori分析了数据。山本先生提供了技术支持。A.Shindo和H.Tomimoto支持BCAS手术。T.Mashimo和Y.Uno生成英国热量2−/−老鼠。M.Shinohara分析了数据并撰写了手稿。作者阅读并批准了最后的手稿。

资金

这项工作得到了NCGG长寿科学研究基金的部分支持（28-45，19-9至NS，19-45至KS）；日本科学促进会的资助；日本教育、文化、体育、科学技术部（MEXT2629316、MEXT15K15272和MEXT17H04154至NS）；武田科学基金会研究鼓励拨款（给NS）；SENSHIN医学研究基金会研究拨款（给NS）；诺华老年研究基金会奖（授予NS）；日本抗衰老医学会授予NS的年度研究奖；和武田医学研究基金会研究拨款（给NS）。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均可根据合理要求提供。

声明

道德批准和参与同意

所有程序均符合我们研究机构的《实验动物护理和使用指南》。

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

脚注

出版商备注

Springer Nature在公布的地图和机构关联中的管辖权主张方面保持中立。

工具书类

1Román GC、Erkinjuntti T、Wallin A、Pantoni L、Chui HC。皮层下缺血性血管性痴呆。柳叶刀神经病学。2002;1(7):426–436. doi:10.1016/S1474-4422（02）00190-4。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
2Yoshitake T、Kiyohara Y、Kato I、Ohmura T、Iwamoto H、Nakayama K等。日本老年人群中血管性痴呆和阿尔茨海默病的发病率和风险因素：久山研究。神经病学。1995;45(6):1161–8. 10.1212/WNL456.1161。[公共医学]
三。Shindo A、Liang AC、Maki T、Miyamoto N、Tomimoto H、Lo EH等。皮层下缺血性血管疾病：少突胶质细胞功能在皮层下白质损伤实验模型中的作用。大脑血流代谢杂志。2016;36(1):187–98. 10.1038/jcbfm.2015.80。[PMC免费文章][公共医学]
4Shibata M、Ohtani R、Ihara M、Tomimoto H。新型慢性脑灌注不足小鼠模型中的白质损伤和胶质细胞激活。(打、击等的)一下。2004;35(11):2598–2603. doi:10.1161/01.STR0000143725.19053.60。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
5Shibata M、Yamasaki N、Miyakawa T、Kalaria RN、Fujita Y、Ohtani R等。慢性脑灌注不足小鼠模型中工作记忆的选择性损伤。(打、击等的)一下。2007;38(10):2826–32. 10.1161/STROKEAHA.107.490151。[公共医学]
6Nishio K、Ihara M、Yamasaki N、Kalaria RN、Maki T、Fujita Y等。以血管性痴呆伴海马萎缩为特征的小鼠模型。(打、击等的)一下。2010;41(6):1278–84. 10.1161/平方公里.110.581686。[公共医学]
7Rayasam A、Hsu M、Kijak JA、Kissel L、Hernandez G、Sandor M等。中风的免疫反应：免疫系统如何促进中风后的损伤和愈合，以及如何将这些知识转化为更好的治疗？免疫学。2018;154（3）：363–76。10.1111/imm.12918。[PMC免费文章][公共医学]
8Lambertsen KL、Finsen B、Clausen BH.中风后炎症靶点或治疗工具？神经病理学学报。2019;137(5):693–714. doi:10.1007/s00401-018-1930-z。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
9Shi K、Tian DC、Li ZG、Ducruet AF、Lawton MT、Shi FD。中风中的全球脑炎症。柳叶刀神经病学。2019;18(11):1058–1066. doi:10.1016/S1474-4422（19）30078-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
10Jayaraj RL、Azimullah S、Beiram R、Jalal FY、Rosenberg GA。神经炎症：缺血性中风的朋友和敌人。神经炎杂志。2019;16(1):142. doi:10.1186/s12974-019-1516-2。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
11Petito CK，Babiak T.大鼠脑缺血后星形胶质细胞的早期增殖变化。Ann Neurol公司。1982;11(5):510–518. doi:10.1002/ana.410110511。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
12du Bois M，Bowman PD，Goldstein GW。沙鼠脑缺血损伤后的细胞增殖。免疫细胞化学和放射自显影研究。细胞组织研究。1985;242(1):17–23. doi:10.1007/BF00225558。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
13Nakaji K、Ihara M、Takahashi C、Itohara S、Noda M、Takhashi R等。基质金属蛋白酶-2在啮齿动物慢性脑灌注不足后白质病变的发病机制中起着关键作用。(打、击等的)一下。2006;37(11):2816–23. 10.1161/01.STR.0000244808.17972.55。[公共医学]
14Rouault JP、Falette N、Guehenneux F、Guillot C、Rimokh R、Wang Q等。BTG2的鉴定，BTG2是DNA损伤细胞反应途径中的一种抗增殖p53依赖性成分。自然遗传学。1996;14(4):482–6. 10.1038/ng1296-482。[公共医学]
15Bradbury A，Possenti R，Shooter EM，Tirone F.PC3的分子克隆，PC3是一种推测分泌的蛋白质，其mRNA由神经生长因子和去极化诱导。美国国家科学院院刊。1991;88(8):3353–3357. doi:10.1073/pnas.88.8.3353。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
16Fletcher BS，Lim RW，Varnum BC，Kujubu DA，Koski RA，Herschman HR.由生长因子和肿瘤促进剂诱导的主要应答基因TIS21的结构和表达。生物化学杂志。1991;266(22):14511–14518. doi:10.1016/S0021-9258（18）98716-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
17Duriez C、Moyret-Lale C、Falette N、El-Ghissassi F、Puisieux A.BTG2及其家族和导师。牛癌。2004;91（7-8）：E242–E253。[公共医学][谷歌学者]
18Yuatia L、Scheijen B、van der Meer LT、van Leeuwen FN。肿瘤抑制剂BTG1和BTG2：超出生长控制。细胞生理学杂志。2019;234(5):5379–5389. doi:10.1002/jcp.27407。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
19Wheaton K，Muir J，Ma W，Benchimol S.BTG2在复制衰老过程中对抗Pin1对有丝分裂原和端粒破坏的反应。老化细胞。2010;9(5):747–760. doi:10.1111/j.1474-9726.2010.00601.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
20Farioli-Vecchioli S、Saraulli D、Costanzi M、Leonardi L、CináI、Micheli L等。PC3/Tis21基因敲除小鼠海马颗粒神经元终末分化受损和上下文记忆缺陷。《公共科学图书馆·综合》。2009年；4（12）：e8339。10.1371/journal.pone.0008339。[PMC免费文章][公共医学]
21Konrad MA，Zuniga-Pflucker JC。BTG/TOB家族蛋白TIS21调节发育中胸腺细胞的阶段特异性增殖。欧洲免疫学杂志。2005;35(10):3030–3042. doi:10.1002/eji.200526345。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
22Ryu MS，Woo MY，Kwon D，Hong AE，Song KY，Park S，等。T细胞受体刺激后，B16恶性肿瘤中溶细胞CD8+T细胞的积累和TIS21基因敲除小鼠中成熟T细胞的增殖。实验细胞研究2014；327(2):209–21. 10.1016/j.yexcr.2014.07.028。[公共医学]
23Passeri D、Marcucci A、Rizzo G、Billi M、Panigada M、Leonardi L等。Btg2通过调节组蛋白H4甲基化和乙酰化增强维甲酸诱导的分化。分子细胞生物学。2006;26(13):5023–32. 10.1128/MCB.01360-05。[PMC免费文章][公共医学]
24Kim BC、Ryu MS、Oh SP、Lim IK。TIS21/（BTG2）通过解除Akt磷酸化和抑制mTOR信号转导负调控雌二醇刺激的造血干细胞扩增。干细胞。2008;26(9):2339–2348. doi:10.1634/stemcells.2008-0327。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
25Lim YB、Park TJ、Lim IK。B细胞易位基因2增强了HeLa细胞对阿霉素诱导的氧化损伤的易感性。生物化学杂志。2008;283(48):33110–33118. doi:10.1074/jbc。M804255200。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
26Choi KS、Kim JY、Lim SK、Choi YW、Kim YH、Kang SY等。TIS21（/BTG2/PC3）通过增强Mre11甲基化和阻断损伤信号向Chk2（T68）-p53（S20）通路的传递，加速DNA双链断裂的修复。DNA修复。2012;11(12):965–75. 2016年10月10日/j.dnarep.2012.09.09。[公共医学]
27Imran M，Lim IK。应激条件下通过活性氧蛋白激酶C-NuFkappaBeta途径调节Btg2（/TIS21/PC3）表达。细胞信号。2013;25（12） ：2400–2412。doi:10.1016/j.cellsig.2013.07.015。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
28Slevin M、Sanfeliu C、Turu MM、Grau-Olivares M、Ferrer I、Boluda S等。缺血性卒中后，B细胞易位基因2在近端神经元过度表达。病理生物学。2009年；76(3):129–35. 10.1159/000209390. [公共医学]
29Farioli-Vecchioli S、Ceccarelli M、Saraulli D、Micheli L、Cannas S、D'Alessandro F等。Tis21是脑室下区成人神经发生和嗅觉行为调节细胞周期蛋白、BMP4、Hes1/5和Ids所必需的。前细胞神经科学。2014年；8:98.[PMC免费文章][公共医学]
30Verheyen GR、Nuijten JM、Van Hummelen P、Schoeters GR。柴油废气颗粒对体外培养巨噬细胞影响的微阵列分析。体外毒物。2004;18(3):377–391. doi:10.1016/j.tiv.2003.10007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
31Gubits RM，Burke RE，Casey-McIntosh G，Bandele A，Munell F.新生儿缺氧缺血后立即早期基因诱导。大脑研究摩尔大脑研究。1993;18(3):228–238. doi:10.1016/0169-328X（93）90194-T。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
32Shinohara M、Kikuchi M、Onishi-Takeya M、Tashiro Y、Suzuki K、Noda Y等。APP中基因子集表达上调；ob/ob小鼠：糖尿病相关性肥胖和阿尔茨海默病之间相互作用的证据。Faseb Bio Adv.2021年。[PMC免费文章][公共医学]
33Ohtom R、Bannai T、Ohtom G、Shindo A、Tomimoto H、Tsuji S等。西洛他唑缓解小鼠慢性脑灌注不足引起的白质变性：基因表达分析对其机制的启示。神经科学快报。2018;662:247–52. 2016年10月10日/j.neulet.2017.10.045。[公共医学]
34Kaneko T，Sakuma T，Yamamoto T，Mashimo T。通过将工程内切酶电穿孔到完整的大鼠胚胎中进行简单敲除。科学代表。2014年；4：6382.doi:10.1038/srep06382。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
35Shinohara M、Kanekiyo T、Yang L、Linthicum D、Shinohara-M、Fu Y等。APOE2缓解衰老过程中的认知衰退：临床和临床前评估。Ann Neurol公司。2016;79(5):758–74. 10.1002/ana.24628。[PMC免费文章][公共医学]
36Takeda S，Sato N，Uchio Yamada K，Sawada K，Kunieda T，Takeuchi D等。糖尿病通过糖尿病阿尔茨海默病小鼠模型中的脑血管炎症和Abeta沉积加速记忆功能障碍。美国国家科学院院刊2010；107(15):7036–41. 10.1073/pnas.1000645107。[PMC免费文章][公共医学]
37Hirsova P、Ibrahim SH、Bronk SF、Yagita H、Gores GJ。Vismodegib抑制非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型中TRAIL介导的肝损伤。公共科学图书馆一号。2013;8（7） ：e70599。doi:10.1371/journal.pone.0070599。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
38Shinohara M、Tashiro Y、Shinohara-M、Hirokawa J、Suzuki K、Onishi-Takeya M等。Abeta42水平升高会降低小胶质细胞和星形胶质细胞失调的ob/ob小鼠的寿命。FASEB J.2020；34(2):2425–35. 10.1096/fj.201901028RR[公共医学]
39Kumar M、Roe K、Neurkar PV、Orillo B、Thompson KS、Verma S等。感染西尼罗河病毒的2型糖尿病小鼠模型大脑中免疫细胞浸润减少，促炎介质增加。神经炎杂志。2014年；11(1):80. 10.1186/1742-2094-11-80.[PMC免费文章][公共医学]
40Wakita H、Tomimoto H、Akiguchi I、Kimura J.慢性脑灌注不足诱导的大鼠脑内胶质细胞激活和白质变化：一项免疫组织化学研究。神经病理学学报。1994;87(5):484–492. doi:10.1007/BF00294175。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
41Lin L，Desai R，Wang X，Lo EH，Xing C。用两种不同方法从混合培养物中分离出的大鼠原代小胶质细胞的特征。神经炎杂志。2017;14(1):101. doi:10.1186/s12974-017-0877-7。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
42Saura J.星形胶质细胞培养中的小胶质细胞：注意事项。神经炎杂志。2007;4(1):26. doi:10.1186/1742-2094-4-26。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
43Lee H，Cha S，Lee MS，Cho GJ，Choi WS，Suk K.抗增殖B细胞易位基因-1在激活诱导的脑小胶质细胞死亡中作为凋亡增敏剂的作用。免疫学杂志。2003;171(11):5802–5811. doi:10.4049/jimmunol.171.11.5802。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
44Chung IY，Benveniste EN公司。星形胶质细胞产生肿瘤坏死因子-α。由脂多糖、IFN-γ和IL-1β诱导。免疫学杂志。1990;144:2999–3007.[公共医学][谷歌学者]
45Burtrum D，Silverstein FS。缺氧缺血性脑损伤刺激新生大鼠胶质纤维酸性蛋白mRNA和蛋白表达。实验神经学。1994;126(1):112–118. doi:10.1006/exnr.1994.1047。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
46Kindy MS、Bhat AN和Bhat NR。短暂缺血刺激沙土鼠新皮质、纹状体和海马中的胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白基因表达。大脑研究摩尔大脑研究。1992;13(3):199–206. doi:10.1016/0169-328X（92）90027-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
47Ho MK，施普林格TA。Mac-2是一种由单克隆抗体定义的新型32000 Mr小鼠巨噬细胞亚群特异性抗原。免疫学杂志。1982;128:1221–1228.[公共医学][谷歌学者]
48Komine O、Yamashita H、Fujimori-Tonou N、Koike M、Jin S、Moriwaki Y等。先天性免疫适配器TRIF缺乏会加速ALS小鼠的疾病进展，导致异常活化的星形胶质细胞积聚。细胞死亡不同。2018;25(12):2130–46. 10.1038/s41418-018-0098-3。[PMC免费文章][公共医学]
49Wang X，Stridh L，Li W，Dean J，Elmgren A，Gan L，等。脂多糖以MyD88依赖性方式致敏新生儿缺氧缺血性脑损伤。免疫学杂志。2009年；183（11）：7471-7。10.4049/jimmunol.0900762。[公共医学]
50Marsh B、Stevens SL、Packard AE、Gopalan B、Hunter B、Leung PY等。系统性脂多糖通过重新编程大脑对中风的反应来保护大脑免受缺血性损伤：IRF3的关键作用。神经科学杂志。2009年；29（31）：9839–49。10.1523/JNEUROSCI.2496-09.2009。[PMC免费文章][公共医学]
51冯毅，廖S，魏C，贾德，伍德K，刘强，等。大脑中动脉闭塞和光血栓中风模型晚期脑缺血时淋巴细胞的浸润和持久性。神经炎杂志。2017;14(1):248. 10.1186/s12974-017-1017-0。[PMC免费文章][公共医学]
52Kawakubo H、Brachtel E、Hayashida T、Yeo G、Kish J、Muzikansky A等。雌激素受体阳性乳腺癌中B细胞移位基因-2的缺失与肿瘤分级和cyclin d1蛋白的过度表达有关。2006年癌症研究；66(14):7075–82. 10.1158/0008-5472.CAN-06-0379。[公共医学]
53Takahashi F、Chiba N、Tajima K、Hayashida T、Shimada T、Takahahi M等。使用ErbB/HER抑制剂拉帕替尼靶向治疗可抑制BTG2表达缺失诱导的乳腺癌进展。致癌物。2011;30(27):3084–95. 10.1038/onc.2011.24。[公共医学]
54尚德，谢C，胡J，谭J，袁Y，刘Z，等。胰腺癌细胞源性外体microRNA-27a通过BTG2促进胰腺癌中人微血管内皮细胞的血管生成。《细胞分子医学杂志》2020；24(1):588–604. 10.1111/jcmm.14766。[PMC免费文章][公共医学]
55Park S，Lee YJ，Lee HJ，Seki T，Hong KH，Park J等。B细胞易位基因2（Btg2）通过调节骨形态发生蛋白/smad信号调节脊椎模式。分子细胞生物学。2004;24(23):10256–62. 10.1128/MCB.24.23.10256-10262.2004。[PMC免费文章][公共医学]
56Tijchon E、van Ingen SD、van Opzeeland F、Tirone F、Hoogerbrugge PM、van Leeuwen FN等。Btg1和Btg2的靶向缺失导致轴向骨骼的同源转化。《公共科学图书馆·综合》。2015;10（7）：e0131481。10.1371/journal.pone.0131481。[PMC免费文章][公共医学]
57Tijchon E、van Emst L、Yuniati L、van Ingen SD、Havinga J、Rouault JP等。肿瘤抑制剂BTG1和BTG2调节小鼠早期B细胞发育。血液学。2016;101（7）：e272-6。10.3324/血液.2015.139675。[PMC免费文章][公共医学]
58Edvinsson L、Ekman R、Jansen I、Ottosson A、Uddman R。人脑动脉中含有肽的神经纤维：免疫细胞化学、放射免疫分析和体外药理学。Ann Neurol公司。1987;21(5):431–437. doi:10.1002/ana.410210503。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
59Tomimoto H、Akiguchi I、Wakita H、Nakamura S、Kimura J.大鼠脑血管中NADPH-二氨基甲酸酶的分布：一项组织化学研究。神经科学快报。1993;156(1-2):105–108. doi:10.1016/0304-3940（93）90450-Y。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自神经炎杂志由以下人员提供BMC公司