经血来源干细胞在子宫内膜损伤修复中的作用

MenSC的培养和鉴定

2016年3月至2017年3月，从10名健康女性志愿者（年龄20-35岁）采集经血。志愿者有规律的月经，月经周期为24-35天（平均28天），没有任何医疗并发症。将从月经血中提取的细胞置于PBS中。简单地说，在室温下用淋巴细胞分层液（英国Little Chalfont，GE Healthcare Life Sciences）以400×g的密度梯度离心法分离月经血单核细胞15分钟(21). 从中间层提取细胞，用PBS洗涤，然后去除上清液。随后，通过在400×g室温下离心5分钟获得细胞，然后将其重新悬浮在添加有10%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）/Ham’s F-12（产品目录号12634；Gibco，Thermo Fisher Screentific公司）中，并将其均匀混合，计算并调整到适当的密度（1×10⁶细胞/ml）用于细胞培养。将细胞接种到DMEM高糖培养基（Hyclone；GE Healthcare Life Sciences，Logan，UT，USA）中，该培养基含有20%胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）、1%两性霉素B和1%mycillin（Gibco；Thermo-Fisher科学，Inc.）进行培养。在37°C下培养72小时后，每3天更换一次培养基。当细胞汇合达到90%时，进行细胞传代。选择第三代细胞，将其重新悬浮在PBS中，并置于2ml Eppendorf管（2×10⁵单元格）。

将细胞置于冰浴中，荧光标记相关抗体（每个2µl）藻红蛋白-氰胺5结合分化簇（CD）90（CD90-PE/Cy5；1:1000；目录号ab25272；美国马萨诸塞州剑桥市Abcam）和异硫氰酸荧光素（FITC）结合CD146（CD146-FITC；1:1000，目录号ab78451；美国马萨州剑桥市阿布cam）添加到每个试管中，并在4°C下培养1 h。随后，将细胞重新悬浮在PBS（20µl）中。使用流式细胞术和FlowJo软件6.1版（Tree Star，Inc.，Ashland，OR，USA）检测表面标记的表达，以鉴定MenSCs。

腺病毒增强绿色荧光蛋白（Ad-eGFP）转染

隔离MenSC（1×10⁷细胞/ml）接种到六孔板中，Ad-eGFP[2×10⁸颗粒形成单元（PFU）；最终浓度，1×10⁸PFU/ml]加入到每个孔中。转染24小时后，在荧光显微镜下观察MenSCs。用胰蛋白酶消化MenSCs，并使用FlowJo软件6.1版（Tree Star，Inc.）通过流式细胞术检测转染率。简言之，用2.5 ml/l胰蛋白酶消化MenSCs，在1000×g室温下离心3 min，然后收集到1.5 ml Eppendorf管中。随后，将DMEM/F12培养基（Gibco；Thermo Fisher Scientific，Inc.）添加到试管中，以达到200µl的体积，并将细胞悬浮密度调整为1×10⁷细胞/ml。将MenSC移植到模型小鼠的子宫腔后，用BX53荧光显微镜（日本东京奥林巴斯公司）测定绿色荧光水平。

BALB/c裸鼠单侧子宫内膜机械损伤模型的建立

本研究共使用109只BALB/c雌性裸鼠（年龄，10-12周；体重，17.5-20.5 g），购自湖南圣佳实验动物有限公司（中国长沙），其中79只小鼠被随机选择并通过腹膜内注射1%戊巴比妥钠（0.75 ml/10 g）麻醉。小鼠被安置在22–24°C的温度、45–70%的湿度、12/12小时的光/暗循环中，并且可以自由获取食物和水。当小鼠没有肢体反应时，将其置于仰卧位，四肢用无菌垫固定在手术台上。手术区用75%酒精消毒，并在腹部中线膀胱顶部做一个1.5厘米的纵向切口。用眼科镊子将皮肤提起，用眼科剪刀纵向分层切开皮肤。在膀胱后部，触摸双侧子宫，用直钳夹住输卵管，露出子宫角（双侧子宫角）。在右子宫角做一个切口，在子宫角和子宫体之间距离的2/3处插入一根4号针，并旋转4次，以刮伤该区域。随后，在切口处使用链霉素（100 mg/ml），并分层缝合肌肉和皮肤。右侧子宫内膜发生机械损伤（模型组），而左侧子宫未接受治疗（正常组）。缝合后，在37°C下进行护理，以确保在2 h内恢复。饲养后，在第1、3和5天通过颈椎脱位处死3只小鼠，暴露双侧子宫角。子宫角在4%多聚甲醛中固定>24小时，包埋在石蜡中，并切片至4µm的厚度。切片用苏木精和伊红（H&E）染色，如下所述，并用光学显微镜观察机械损伤子宫内膜模型的情况。

模型小鼠子宫腔内移植MenSC后的绿色荧光检测

在剩下的70只模型小鼠中，使用了10只具有特定无色素条件的小鼠进行本研究。MenSC细胞悬液（1×10⁷细胞/ml；将20µl）注入10只机械损伤模型小鼠的右侧子宫腔，并在左侧子宫腔注射等效PBS作为对照。注射后共5天，处死小鼠，打开腹腔，收集子宫角。随后，将子宫角在室温下与4%多聚甲醛孵育24小时，然后在4°C的20%蔗糖中脱水过夜。随后，将组织在最佳切割温度的复合物中（Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance，CA，USA）在−20°C下嵌入10–15分钟，然后使用冰冻切片制备仪器Cryostat（Leica Microsystems，Inc.，Buffalo Grove，IL，USA，）切片，以建立冰冻切片（10µm）。然后在荧光电子显微镜下检查切片（放大倍数×100）。

动物分组

从剩下的60只模型小鼠中随机选择30只小鼠，并注射20µl MenSC悬浮液（1×10⁷细胞/ml）注入受损的右宫腔（MenSC组），30只模型小鼠右宫腔注射等效PBS（模型组）。此外，将另30只右子宫角未受损的小鼠注射20µl MenSCs混悬液至右子宫腔[阴性对照（NC）组]。所有组未经治疗的左子宫未注射MenSCs或PBS，用作正常组（n=90；n=30/组）。治疗后，在第1天、第3天和第5天处死每组三只小鼠。解剖子宫并切除双侧子宫组织。按如下所述，将组织在逐渐增加的酒精梯度中脱水，在二甲苯中清除，嵌入石蜡中，切片（4µm）并准备用于后续H&E染色。在治疗后第7天，每组随机选择21只小鼠进行生育测试：雌性小鼠（3个发情周期；年龄11-13周；体重18.2-29.5克）与相同品系的雄性小鼠（在上述条件下，每个笼子容纳一只雌性和雄性小鼠）放在笼子里，购自湖南四甲实验动物有限公司（中国长沙），观察各组小鼠的妊娠率。

H&E染色

H&E染色切片观察子宫内膜损伤程度。用二甲苯去除切片中的石蜡，用高浓度到低浓度的乙醇（100乙醇、95乙醇、80乙醇和70%乙醇）和蒸馏水清洗切片3分钟，用苏木精染色3分钟，在自来水中清洗3次，用酒精脱水10分钟，用伊红染色，用二甲苯清洁并用树脂安装（Sigma-Aldrich；默克公司，德国达姆施塔特）。随后，在光学显微镜下观察切片（日本东京奥林巴斯公司），并对每张幻灯片的五个不同视野进行拍照和检查。

免疫组织化学（IHC）和平均子宫内膜厚度测量

分组后五天，根据上述方案选择切片，进行脱蜡和再水化，然后每片切片补充50µl过氧化物酶封闭溶液（Sigma-Aldrich；Merck KGaA），并在室温下培养10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS冲洗后，去除PBS溶液，并将子宫内膜切片与50µl正常非免疫动物血清（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）在室温下孵育10分钟以去除血清。随后，将抗波形蛋白（1:200；cat.no.ab92547；Abcam，Cambridge，UK）、血管内皮生长因子（VEGF；1:100；cat no.ab9546；Abcam）和角蛋白（1:2000；cat.no.ab8068；Abca姆）的一级抗体添加到切片中，并在4°C下培养过夜。切片在室温下放置1小时，用PBS清洗三次，每次10分钟。将羊抗兔IgG抗体（1:1000；cat.no.ab6795；Abcam）添加到切片中，并在室温下孵育2 h。在37°C下用3,3′-二氨基联苯胺处理5 min后，将切片在PBS中清洗，并用5%苏木精溶液进行复染（中国海门贝约泰生物技术研究所）在室温下保持3分钟。在显影后，使用光学显微镜（放大倍数为400倍；奥林巴斯公司）拍摄切片，并分析五种不同的视野。使用Image-Pro Plus 6处理软件（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）分析结果并计算平均光密度（AOD）；AOD=综合外径/测量面积。AOD越高，蛋白质的表达越高。放大倍数为×400也用于测量子宫内膜的平均厚度。

小鼠子宫内膜机械损伤模型的成功建立

通过机械损伤建立裸鼠单侧损伤模型，造模1、3、5天后，收集子宫并用H&E染色。模型组在1天时间间隔内观察到子宫内膜组织脱落，模型组在3天时间间隔内测到子宫内膜纤维化，模型组在5天的时间间隔内，子宫内膜无正常内膜，但出现纤维化；而正常组未检测到纤维化(图2). 这些结果表明子宫内膜机械损伤模型已经成功建立。

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图2。

模型小鼠子宫内膜的检查。从模型小鼠收集右子宫角，并在子宫内膜损伤后第1、3和5天通过苏木精和伊红染色检查纤维化；左侧子宫角未受损，用作正常对照。黑色箭头表示子宫内膜纤维化。放大倍数，×100。

MenSCs在模型小鼠子宫内膜中生长

转染24 h后，在荧光显微镜下观察到Ad-eGFP-MenSCs，转染率达48.5%(图3A和B). 将Ad-eGFP-MenSCs移植到模型小鼠右侧子宫（MenSC组），并将PBS注射到模型小鼠体内；在MenSC处理的模型小鼠中，在子宫内膜中检测到绿色荧光(图3C)这表明MenSC能够在裸鼠子宫内膜中生长。

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图3。

Ad-eGFP转染的MenSCs能够在裸鼠中生长。（A和B）用Ad-eGFP转染MenSCs，（A）在荧光显微镜下观察，（B）转染后24小时用流式细胞仪定量阳性（绿色）细胞的数量。（C） 将Ad-eGFP转染的MenSCs移植到子宫内膜损伤模型小鼠的右子宫角，在荧光显微镜下观察子宫内膜切片；模型对照小鼠接受子宫内膜损伤并用PBS、Ad-eGFP、腺病毒增强的绿色荧光蛋白治疗；男性干细胞，月经血来源的干细胞。

MenSC治疗增加子宫内膜厚度并促进子宫内膜修复

治疗后5天，IHC结果显示，模型组子宫内膜厚度较正常组薄（P<0.05；图4); MenSC组小鼠子宫内膜厚度较模型组小鼠增加，但差异无显著性（P>0.05）。此外，与正常组相比，MenSC组子宫内膜厚度显著降低（P<0.05；图4). 与NC组相比，模型组和MenSC组子宫内膜厚度显著降低（P<0.05；图4). 正常组与NC组子宫内膜厚度比较无显著性差异（P>0.05；图4). 这些结果表明，子宫内膜损伤后，子宫内膜厚度降低，而在模型小鼠中接受MenSC治疗后，这种作用可能会逆转。

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图4。

MenSCs治疗会影响模型小鼠受损子宫内膜的厚度。（A） 各组小鼠子宫内膜的免疫组织化学染色；放大倍数，×40。（B） 各组小鼠子宫内膜厚度的量化*与正常值相比，P<0.05。^#与NC相比，P＜0.05。MenSCs，经血来源的干细胞；NC，阴性对照。

MenSCs通过促进波形蛋白、VEGF和角蛋白的表达促进子宫内膜修复

角蛋白在上皮细胞中表达，与上皮生长有关(22). 波形蛋白主要表达于与基质细胞再生相关的间充质细胞和内皮细胞(22). VEGF与血管生成相关(23). 因此，角蛋白、波形蛋白和VEGF与子宫内膜修复相关。治疗后5天，IHC结果显示波形蛋白、VEGF和角蛋白的阳性染色为棕色或棕褐色(图5). 波形蛋白、VEGF和角蛋白的AOD在正常组和NC组之间无显著差异（P>0.05）。模型组波形蛋白、VEGF和角蛋白的AOD显著低于正常组和NC组各自的表达水平（P<0.05）。MenSC组波形蛋白、VEGF和角蛋白的AOD显著高于未治疗模型组的相应表达水平（P<0.05）。这些数据表明，MenSCs可能通过促进波形蛋白、VEGF和角蛋白的表达来促进模型小鼠子宫内膜病变的修复。

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图5。

波形蛋白、VEGF和角蛋白在模型小鼠子宫内膜中的表达。（A） 各组小鼠子宫内膜的免疫组织化学染色；放大倍数，×400。（B） 定量分析A部分波形蛋白、VEGF和角蛋白的表达。*P<0.05 vs.正常；^#与模型相比P＜0.05。AOD，平均光密度；月经干细胞；NC，阴性对照；血管内皮生长因子。