洗涤剂纯化人mGlu的直接偶联₅异三聚体G蛋白受体Gq和Gs

N-连接糖基化的表征

人类mGlu₅氨基酸序列包含6个潜在的N-糖基化NX（S/T）共有位点，位于预计位于细胞外表面的受体区域。其中五个站点位于大型VFT域中（图2安培)另外一个位点位于7TM的第二胞外环（EL）中。N-糖基化受体的异质性会阻碍其结晶，但N-糖基化对细胞表面功能性受体的表达也很重要。我们探索了这些位点对折叠良好受体的细胞表面表达的贡献。

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图2

SNAP-mGlu的特性₅-∆856 N-糖基化在HEK293细胞中的分布。(一个)五mGlu₅N-连接的糖基化位点在VFT（代码pdb 3LMK）的卡通结构（灰色）上突出显示为表面球体（红色）和糖部分（绿色）。与VFT结合的谷氨酸分子中的原子表示为蓝色球体。(B类)单体SNAP-mGlu的SDS-PAGE凝胶迁移₅-Δ856和不同的N-糖基化突变体。样品用还原剂（DTT）处理。(C类)荧光标记SNAP-mGlu的细胞表面表达₅-Δ856和使用SNAP-Lumi4Tb的不同N-糖基化突变体。凝胶是一个重复至少两次的实验的代表。表达谱是至少三个独立实验的代表。邓内特的测试是其中的一部分-方差分析用于与hmGlu比较的方法₅-Δ856设为参考水平。

SNAP-mGlu的六个突变体₅-生成Δ856，其中每个天然N-糖基化位点从NxS/T突变为DxS/T。然后在HEK293细胞中瞬时表达这些结构，并用细胞免疫荧光标记细胞外SNAP标签。然后使用合适的清洁剂从细胞中提取SNAP标记的受体，并通过SDS-PAGE分析未净化物质。SNAP-mGlu₅-Δ856受体主要以二聚体形式迁移（表观分子量180–200 kDa）在非还原条件下作为单体（表观分子量90–100 kDa）（补充图^三). 虽然单体和二聚体受体都可以在SDS-PAGE凝胶上看到，但我们的分析基于还原条件下形成的单体物种的凝胶迁移率变化（加上DTT），因为分子量的微小变化更为明显。数据显示，当每个N-糖基化位点N1-N5发生突变时，单体受体的分子量略有下降（图2B型)表明它们参与WT受体的糖基化。然而，定位于7TM结构域的N6位点突变似乎没有发生N-糖基化，因为该突变的表观分子量与野生型受体相似。

这些突变对SNAP-mGlu细胞表面表达的影响₅-测定了五个N-糖基化位点突变体N1-N5的Δ856受体。突变N1、N2、N3和N5会显著损害受体的细胞表面表达（图2摄氏度). 只有突变N382D（N4）在细胞表面的表达水平没有降低，尽管表观分子量的降低表明该位点是N-糖基化的。为了进一步减少受体上的N-聚糖数量，构建了一个突变体，其中三个糖基化位点（N1N2N5）发生突变，另一个突变型结合了所有5个突变的N-糖基化部位（N1-N5）。在对SNAP-tag进行荧光标记后，在细胞表面未检测到三重（N1N2N5）或五重突变体（N1-N5）（图2摄氏度). 综上所述，这些结果表明，定位于VFT中的所有5个N-糖基化位点在HEK293和Sf9细胞中均为N-糖基，并且至少四个位点的N-糖基化对确保受体的细胞表面表达起着关键作用。

mGlu的洗涤剂增溶和稳定性₅-Δ856

GPCR的结构表征因其在洗涤剂中缺乏稳定性而变得复杂，因此难以在功能状态下纯化²¹因此，重要的是要确定一种能够保持mGlu的合适清洁剂₅溶解后处于功能和稳定状态。测量洗涤剂固体受体相对数量及其热稳定性的一种方法是使用放射性配体结合分析²²为此，我们使用了“超级+”形式的放射性配体结合分析，该分析包括在进行洗涤剂溶解之前，使受体与放射性标记配体平衡（见材料方法部分）^22,23这允许测定表观熔化温度（表观温度_米)定义为50%的可溶性受体仍能与放射配体结合的温度。表观T_米是洗涤剂溶液中未净化受体稳定性的可靠指标。

微克葡萄糖₅-Δ856在昆虫细胞中表达，高亲和力放射性标记NAM[^三H] -结合7TM结构域的MPEP用于监测洗涤剂溶解后功能受体的百分比。我们首先测试了两种温和的非离子洗涤剂，它们已成功用于许多GPCR的分离和纯化，即n个-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和麦芽糖-新戊二醇-3²⁴（MNG3）。此外，我们还测试了较短的烷基链同系物癸基-β-D-麦芽糖苷（DM）。通过用胆固醇半琥珀酸酯（CHS）（一种用于进一步稳定GPCR的胆固醇衍生物）补充选定的洗涤剂，进一步优化了洗涤剂的溶解条件。首先评估了洗涤剂对mGlu的溶解能力₅以仍然可以绑定的功能形式[^三H] -MPEP为4 °C（图3A级). 我们的结果清楚地表明，可溶性功能性mGlu的最高含量₅-Δ856受体与MNG3结合，而DDM的效率低两倍。然后用CHS补充洗涤剂，使最终浓度在0.04%至0.08%之间。当MNG3补充CHS时，溶解受体的数量略有增加，并在0.08%的CHS时达到最大产量。添加CHS还显著提高了DDM中可溶性受体的数量。我们发现0.08%的CHS浓度最适合溶解mGlu₅受体二聚体。微克葡萄糖₅即使存在CHS，在DM中溶解后，受体也不稳定。

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图3

mGlu的洗涤剂增溶和热稳定性₅-Δ856 [^三H] -昆虫细胞中的MPEP结合受体。(一个)未净化mGlu的定量₅-Δ856受体在4时溶解 °C使用[^三H] -在一系列麦芽糖苷基洗涤剂中测定MPEP结合分析，这些洗涤剂包括月桂基麦芽糖新戊二醇-3（MNG3）、n-十二烷基-β-D-麦芽糖甙（DDM）和添加不同比例胆固醇半琥珀酸盐（CHS）的n-癸基-β-D麦芽糖肽（DM）。(B类)mGlu的热稳定性₅-Δ856[^三H] -MPEP结合受体在四种不同条件下溶解；DDM（0.83%）、DDM-CHS（0.83–0.083%）、MNG3（0.83%。两种分析的数据点(A、 B类)代表平均值 ± 三个独立实验的SEM。邓内特的测试是其中的一部分-用方差分析法与MNG3-CHS（0.83-0）和DDM-CHS（083-0）分别作为MNG3和补充CHS的DDM的参考水平进行比较。

为了确定溶解和纯化的最佳洗涤剂，mGlu的热稳定性₅绑定到[^三H] -在存在或不存在0.08%CHS的情况下，在0.8%MNG3和0.8%DDM中测定MPEP（图3B公司). 表观T_米mGlu的₅MNG3中溶解的受体为18 ± 0.3 °C（n = 3） ，但DDM中的受体对于明显的T来说太不稳定_米待测量。添加CHS显著提高了mGlu的稳定性₅在两种洗涤剂中都有明显的T_米第页，共21页 ± 1.5 °C（n = 3） DDM/CHS和表观T_米第页，共25页 ± 0.1 °C（n = 3） 在MNG3/CHS中。由于MNG3/CHS为[^三H] -MPEP结合mGlu₅-Δ856，我们使用这些条件进行溶解和纯化。

mGlu的表达与纯化₅-来自Sf9细胞的Δ856

大规模生产mGlu₅-使用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中执行Δ856。该系统用于表达迄今为止大多数结晶的GPCR，因为它通常具有良好的产率，并且可以进行翻译后修饰，如N-糖基化²⁵.我们首先优化了mGlu的纯化₅-Δ856在C端与eGFP熔断（图4A级). 微克葡萄糖₅-Δ856-eGFP显示出与野生型受体类似的药理学，使用[^三H] -MPEP结合分析（图4B类). 对于HEK293细胞，糖基化对受体表达很重要。我们已经测试了mGlu的表达₅Sf9昆虫细胞中的ΔN1-N5突变体。突变所有糖基化位点可消除受体表达（图4B类). mGlu的纯化₅-Δ856-eGFP在镍上实现²⁺-亲和柱后在MNG3/CHS中进行尺寸排除色谱（SEC）（图4摄氏度). 纯化受体的凝胶过滤曲线（Superose 6增加，GE Healthcare）是对称的，这表明纯化受体是单分散的。非还原性SDS-PAGE鉴定出一条表观分子量（MW）约为250的主带 kDa和一个125的小乐队 kDa，与mGlu的理论MW很好地对应₅-eGFP二聚体（249568 Da）和单体（124784 Da）（图4D（四维）). SDS-PAGE上蛋白质带的一致性通过质谱法确认（补充图⁴). 这两条带都产生了15个与mGlu序列相匹配的肽段₅-eGFP序列覆盖率为60%。尽管SEC图谱没有显示出任何单体的存在，但SDS-PAGE观察到与单体相对应的一条小条带，这可能是由于SDS引起的离解所致。用还原试剂处理纯化样品以破坏二聚体，使单体物种迁移的强度增加到125 kDa与非还原样品相比（图4D（四维）).

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图4

二聚体mGlu的纯化₅-在SF9细胞中产生∆856。(一个)人类二聚体mGlu的卡通表示₅受体（浅蓝色），融合蛋白eGFP（绿色）取代856位的c末端结构域。(B类)未净化mGlu的定量₅受体使用[^三H] -MPEP结合分析，测定mGlu₅-Δ856，mGlu₅-Δ856-eGFP和mGlu₅-Δ856 eGFP（N1-N5）。邓内特的测试是其中的一部分-方差分析用于与mGlu比较的方法₅-Δ856设为参考水平。(C类)两种结构物的尺寸排除色谱图，mGlu₅-Δ856（Ve = 14.5 mL）和mGlu₅-Δ856-eGFP（Ve = 14.2 mL），使用叠加6增加。(D类)考马斯蓝染色的mGlu SDS-PAGE凝胶₅-Δ856和mGlu₅-Δ856-eGFP。所示凝胶是三个独立实验的代表。

我们最初仅将一个糖基化位点（N445）突变为该结构中的丙氨酸，因为mGlu的可用PDB结构中的糖部分很明显₅VFT（3LMK）（图2安培). 事实上，正如我们上面所证明的，由于表达水平的严重下降，不可能突变多个糖基化位点（图2摄氏度). 用肽处理纯化的受体-N个-葡萄糖苷酶F（PNGase F）过夜后再进行SEC，导致脱糖基化受体的纯化（补充图^4摄氏度). 最终产量为0.05 mg纯化mGlu₅-获得了每升Sf9昆虫细胞培养物中的eGFP蛋白。我们还纯化了另一个结构体mGlu₅-Δ856，C端无eGFP（补充图^1摄氏度)使用相同的方案，但包括额外的纯化步骤（使用抗FLAG标签抗体树脂的亲和层析）。我们最终获得0.04 mg高纯度mGlu₅-Δ856/升Sf9（图4)，这是进一步的特点在体外使用G蛋白活化分析。

突变与细胞培养

FLAG-SNAP标记的mGlu的所有单点突变₅受体结构（Cisbio Bioassays）是使用快速改变策略（安捷伦技术）生成的，并通过测序（Eurofins Genomics）进行验证。HEK293细胞在37℃时培养于添加10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中 °C，加湿5%CO₂孵化器。然后，根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000将HEK293细胞转染到预先涂有聚-dL-鸟氨酸的96 well板中。DNA混合物包括40个 mGlu的ng₅突变体，50 ng谷氨酸转运体EAAC1 cDNA，以避免细胞释放的分析介质中谷氨酸的任何影响，60 ng pRK6，用于将最终DNA浓度调整为150 英国。

测量mGlu的细胞效应₅G蛋白活化

根据制造商的建议（Cisbio Bioassays），分别使用IP-One和cAMP HTRF试剂盒在96个微孔板中测量转染细胞中的磷酸肌醇（IP）积累和环AMP。48岁之后 转染后h，HEK293细胞在DMEM-Glutamax培养基（Life Technologies）中培养2小时，然后进行测量，以降低细胞外谷氨酸浓度。取出介质后，SNAP-mGlu₅-通过在提供的StimB缓冲液中为IP one试剂盒或补充有环核苷酸磷酸二酯酶抑制剂Ro-20–1724（50 μM）用于cAMP试剂盒。然后将细胞培养30 37时最小值 °C，加湿5%CO₂孵化器。随后，通过添加IP1-d2或cAMP-d2结合物，然后分别添加铽隐式标记的抗IP1或抗cAMP抗体，对细胞进行裂解，这两种抗体均在所提供的裂解缓冲液中稀释。在室温下培养一小时后，在337激发后进行HTRF测量 在50微秒延迟的情况下，在620 nm处测量了铽隐式荧光和tr-FRET信号 nm和665 分别使用PHERAstar FS（BMG Labtech）。使用GraphPad Prism 7.0版（加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPat软件）分析图形。功能性浓度响应数据拟合为四参数方程。pEC₅₀值表示为平均值 ± 扫描电镜。

洗涤剂固体化受体结合和热稳定性测量

48岁之后 转染h后，HEK293细胞在室温下与NAM孵育1小时[^三H] 80时的MPEP nM（≈K的五倍_D类)在包含25个 mM HEPES pH值7.4和400 mM氯化钠。然后用0.83%（w/v）MNG3和0.042%（w/v）CHS溶解膜1 4时为小时 °C。可溶性受体（SNAP-mGlu₅-∆856），然后孵育30 在4至40度的不同温度下保持分钟 °C。然后将样品冷却至4 5°C min和之前报道的洗涤剂可溶性配体结合实验²²与液体闪烁溶液混合后，使用MicroBeta液体闪烁计数器（Perkin-Elmer）定量结合放射性配体。对于昆虫细胞表达，1 表达mGlu的mL Sf9细胞培养₅-∆856孵育1 室温下100小时 毫微米（0.5 放射性银的µCi）[^三H] -绑定缓冲区（25）中的MPEP（ARC，inc） mM HEPES（pH 7.4），400 mM氯化钠）。非特异性结合是在200℃的条件下通过竞争结合测定的 nM MPEP（Abcam）。通过添加0.83%（w/v）MNG3/0.083%（w/v）CHS和额外培养1 4时为小时 °C。如前所述，通过凝胶过滤柱在批处理模式下快速过滤分离游离和结合的放射性配体分子²².然后将可溶性受体培养30 在4至31的不同温度下保持分钟 °C。4 然后将mL闪烁溶液添加到洗脱溶液中，并使用液体闪烁计数器（Tri-Carb 2100TR，Packard）测量结合放射性。计数的放射性值以每分钟崩解数（dpm）进行恢复。通过总结合和非特异性结合之间的差异来计算特异性结合。

监测mGlu₅细胞表面表达

使用Lumi4-Tb标记的SNAP标签监测细胞表面SNAP标记蛋白表达的定量。简单地说，细胞用PBS清洗一次，然后培养1 37小时 100°C Taglite缓冲液中SNAP-Lumi4-Tb的nM（Cisbio Bioassays）。在荧光测量之前，细胞在PBS中清洗三次，以消除未结合的游离染料。在337激发后测量Lumi4-Tb荧光 45纳米 μs和620时的发射 nm，50 在PHERAstar FS（BMG Labtech）上施加μs延迟。

N-连接糖基化位点突变

首先预测了N-连接的糖基化位点（NX（S/T））（Protter软件），然后通过N残基对D的单一替换进行突变，形成六种不同的结构：N88D（N1）、N210D（N2）、N378D（N3）、N382D（N4）、N445D（N5）和N734D（N6）。这些突变进一步结合生成N89D/N210D/N445D（N1N2N5）和N89D/N210D/N378D/N382D/N445D的结构体。所有结构均通过测序确认（Eurofins Genomics）。SNAP-mGlu公司₅-∆856突变体在HEK293细胞系中表达，并使用SNAP-Red标记，如前一节所述。然后使用0.83%（w/v）MNG3/0.083%（w/v）CHS从膜中提取蛋白质，轻轻摇晃45 4时最小值 °C。然后将溶液在12000下离心 30克 4时最小值 °C以清除细胞碎片。20 µL上清液补充10 mM二硫苏糖醇（DDT）还原剂在5 37时的最小加热 在4–20%三甘氨酸凝胶上放置°C。扫描凝胶并荧光标记SNAP-mGlu₅-∆856在远红色激发后可视化（奥德赛成像系统）。

生成mGlu₅优化Sf9细胞表达的构建

使用重叠PCR设计用于Sf9细胞纯化优化的结构，在截短的人类mGlu的C末端具有eGFP融合蛋白₅残基A856之后的受体。将该受体序列亚克隆到一个修饰的pFastBac1载体（Invitrogen）中，该载体被命名为pFastBac1，其中包含一个表达盒，该表达盒中含有一个GP64肽信号序列，该序列来自苜蓿银纹夜蛾N末端的核型多角体病毒（AcNPV杆状病毒）和TEV蛋白酶识别位点，以及受体C末端的eGFP序列和10×His标签。使用相同的结构通过片段基因合成（Eurofins Genomics）生成突变的N-连接糖基化位点（NX（S/T））到Q（N89Q/N210Q/N378Q/N382Q/N445Q）。设计用于大规模纯化的构建物包含GP64肽信号序列、FLAG（DYKDDDDK）和10 × His标签，分别位于N-末端的精确蛋白酶识别位点（LEVLFQGP），然后是人mGlu₅基因在A856处截断。使用PCR将所有构建物亚克隆到pFastBac1中，引物对编码5′端的限制性位点BamH1和3′端的EcoR1，随后连接到载体中发现的相应限制性位点。

mGlu的纯化₅Sf9细胞产生

所有设计的结构均使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统（Invitrogen）在EX-CELL 420培养基（Sigma-Aldrich）中生长的Sf9细胞中表达。细胞感染密度为3-4 × 10⁶每毫升含P2杆状病毒的细胞数。培养物生长于27岁 °C，收集48 感染后h储存在−80 °C直到使用。昆虫细胞膜来自4 在含有25 mM HEPES（pH 7.4），10 mM氯化镁₂, 20 mM KCl和完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）。在45000℃下进行两轮洗涤-离心后，清除上清液 使用相同的裂解缓冲液进行rpm，并使用含25的高盐缓冲液进行额外清洗 mM HEPES（pH 7.4），10 mM氯化镁₂, 20 mM KCl和1 M氯化钠。用添加了40%甘油的裂解缓冲液重新悬浮膜，然后将其储存在−80 °C。将冲洗过的膜重新悬浮到含有10 μM 2-甲基-6-（苯乙炔基）吡啶（MPEP，Abcam），10 mM碘乙酰胺（Sigma）、完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒片和额外蛋白酶抑制剂；bestatin、leupeptin、pefabloc和pepstatin（罗氏）。然后将混合物在室温下培养1 溶解前1小时。然后将膜溶解在含有25 mM HEPES缓冲液（pH 7.4），0.4 M NaCl、10%甘油、0.5%（w/v）十二烷基麦芽糖新戊二醇（MNG3，Anatrace）和0.05%（w/v）胆甾醇半琥珀酸酯（CHS，Sigma）1.5 4小时 °C，摇晃。然后通过45000离心分离上清液 1转/分 小时并补充10 mM咪唑（Sigma）。对于mGlu₅-∆856-eGFP构建，上清液加载到Ni上²⁺第0.3列（HisTrap HP、GE Healthcare） ml/min，4℃过夜 °C。装订后，用20-30柱体积的洗涤缓冲液（25 mM HEPES（pH 7.4），400 mM氯化钠，10 μM MPEP、10%（v/v）甘油、0.05（w/v）MNG3、0.005%（w/v）CHS和60 mM咪唑）。然而，对于mGlu₅-∆856，上清液加载到钴上²⁺树脂（Talon超流，GE Healthcare），0.3 ml/min，4℃过夜 °C。然后用25洗脱蛋白质 mM HEPES（pH 7.4），400 mM氯化钠，10 μM MPEP、10%（v/v）甘油、0.05%（w/v）MNG3、0.005%（w/v）CHS和250 mM咪唑。洗脱的mGlu₅-∆856蛋白与抗FLAG亲和树脂孵育1 4小时 °C，然后用10柱体积的洗涤缓冲液（25 mM HEPES（pH 7.4），150 mM氯化钠，10 μM MPEP、0.01（w/v）MNG3、0.001%（w/v）CHS和2 mM钙）。用含有0.01%MNG3、0.001%CHS、25的缓冲液洗脱蛋白质 mM HEPES pH值7.4，0.15 M氯化钠，10 μM MPEP，0.2 mg/ml FLAG肽和2 mM乙二胺四乙酸。然后使用Vivaspin 20离心浓缩器100浓缩两种结构的洗脱部分 kDa截止值（Sartorius），离心10 80000时的最小值 rpm以消除骨料，然后加载到尺寸排除色谱柱上（Superose 6增加，GE Healthcare）。使用Vivaspin 6离心浓缩器100进一步浓缩洗脱的级分 kDa截止值（Sartorius）和蛋白质浓度，采用双钦酸（BCA）测定。

质谱学

蛋白质纯度通过Commassie蓝染色SDS-PAGE凝胶进行评估，并通过质谱显示谱带的一致性。SDS-PAGE凝胶显示出与SEC峰对应的两条带，将其切除并去除。蛋白质减少了10 mM TCEP在25 毫摩尔NH₄HCO公司_三56时的溶液 30°C 分钟，然后是45 20分钟孵育 mM碘乙酰胺45 室温下的最小值。然后将凝胶片与20 µl胰蛋白酶（Promega）溶液（19 ng/ul）在37℃下消化过夜 °C。然后用MALDI-TOF TOF质谱仪对所得碎片进行分析。

GTPγS结合

使用荧光Body-FL GTPγS类似物进行GTPγS-结合实验²⁶N末端His-Tagged Gα_秒表示为大肠杆菌并使用镍-硝基三乙酸亲和（Ni-NTA）色谱纯化³⁶.Gα_i2类内部His-tag表达于大肠杆菌并如前所述进行纯化³⁷.溶解他的₆-标记的Gα_q个表示为第9部分细胞并使用Ni-NTA亲和层析纯化³⁸最后，Gβ₁是用他的₆-标记的Gγ₂在里面第9部分Ni-NTA色谱结合离子交换色谱从膜组分中纯化的细胞和Gβγ二聚体³⁸使用配有Peltier控制温度装置的荧光分光光度计（瓦里安Cary Eclipse）监测Body-FL GTPγS与G蛋白的关联，激发波长设置为500 nm，发射波长为511 纳米。反应条件为100 nM Gα_秒β₁γ₂，Gα_q个β₁γ₂或Gα_i1号机组β₁γ₂，100 nM Body-FL GTPγS和20 毫微克葡萄糖₅洗涤剂中的受体或以2.8:1的比例重新配制成12%的DMPC:CHAPSO（双子叶）混合物。荧光监测10 15分钟 添加配体（10）后的°C µM最终浓度）。

作者感谢劳伦特·普雷佐、朱莉·克尼泽夫、菲利普·伦达尔和西里尔·古德特的有益讨论，感谢克里斯·泰特对手稿的批判性阅读。我们感谢Eric Trinquet（法国西斯比奥）为我们提供SNAP标签全长mGlu₅表达质粒，以及IGF的Arpege和FFP平台。Karine Rottier得到了FRM“generieur de Recherche”项目的支持，Chady Nasrallah得到了ATIP赠款（2014-2016年）和蒙彼利埃大学牙后科学项目（2016-2018年）的支持。Joan Font和Amadeu Llebaria承认MINECO（PCIN-2013–017 C03-01和CTQ2014-57020-R）、加泰罗尼亚政府（2014SGR109和2014CTP0002）以及ERANET Neuron项目“LIGHTPAIN”的支持。纪尧姆·勒本（Guillaume Lebon）对ATIP计划（2013-2016）、CNRS、INSERM和蒙彼利埃大学的支持表示感谢。