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单元格代表。作者手稿；PMC 2018年1月9日发布。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2017年11月14日；21(7): 2005–2016.
数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2017.10.095
预防性维修识别码：项目编号：5759054
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院919657
PMID：29141229

人类神经元分化过程中广泛的平移重构

约翰·布莱尔,1 德克·霍克梅耶,1 詹妮弗·杜德纳,1,2,三，4,5 海伦·S·贝特普,1,6和斯蒂芬·N·弗洛尔1,2,7,8,9
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补充材料

总结

忠实的细胞分化需要在转录和翻译水平上协调基因表达程序的时间精确激活。神经元表达人类组织中最复杂的mRNA，但神经元分化过程中的翻译变化仍不完全清楚。在这里，我们诱导了人类胚胎干细胞（hESCs）的前脑神经元分化，并用转录形式分辨率测量了全基因组RNA和翻译水平。我们发现数千个基因在分化过程中改变翻译状态，而RNA水平没有相应的变化。具体来说，我们确定mTOR信号是hESCs翻译相关基因翻译升高的关键驱动因素。相反，活动神经元中的翻译抑制是由3′UTR中的调节序列介导的。总之，我们的发现确定了人类神经元分化过程中广泛的翻译控制变化，以及3′UTR在驱动细胞类型特异性翻译中的关键作用。

关键词：细胞分化、翻译控制、干细胞、神经元、神经前体细胞、RNA、核糖体分析、多聚体分析、TrIP-seq、神经发生

eTOC简介

许多3′非翻译区在神经发生过程中急剧延伸，有时超过10千碱基。Blair等人使用互补的深度测序方法来确定神经元通过非翻译区域的转录后调控。他们发现，mTORC1促进了hESCs翻译相关基因的翻译，而3′UTR选择性下调了活跃神经元培养中的翻译。

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介绍

分化细胞类型的规范需要基因表达程序的紧密协调执行。必须严格控制增殖和分化的平衡和时机，以促进适当的发展，避免无限制的增长。基因表达的协调在神经元谱系有丝分裂后细胞的发育和维持中尤其重要，因为异常的蛋白质平衡可导致包括自闭症和神经退行性疾病在内的多种病理学(Darnell和Klann，2013年;Freibaum和Taylor，2017年;Gkogkas等人，2013年;Kelleher和Bear，2008年). 为了实现这种协调，细胞系统调节基因表达的每个步骤，包括转录、剪接和转录处理、翻译以及mRNA或蛋白质降解。

大脑含有人类组织中最复杂的mRNA库(Ramskold等人，2009年). 转录物3′非翻译区（UTRs）在大脑和神经元分化过程中显著延长，其中单个3′UTRs可超过20kb(Hilgers等人，2011年;Miura等人，2013年). 3′UTR的延伸是由影响多聚腺苷化位点选择或延长的3′UTRs选择性降解的RNA-结合蛋白表达水平的变化驱动的(Hilgers等人，2012年;2016年5月;田和曼利，2017年). 转录子3′UTR调节翻译水平、RNA降解、RNA定位和蛋白质复合物的形成，因此3′UTRs大小的增加也增加了大脑的转录后调节潜能(2016年5月;田和曼利，2017年). 3′UTR形成缺陷导致神经系统功能障碍(Van Epps等人，2010年)在包括癌症和其他疾病在内的多种情况下，随着增殖的转变，3′UTR普遍缩短(Elkon等人，2013年;Gennarino等人，2015年;Mayr和Bartel，2009年;桑德伯格等人，2008年;Singh等人，2009年).

尽管脑特异性3′UTR具有重要意义，但mRNA 3′UTRs的调节潜能如何在神经元分化过程中影响基因表达尚不完全清楚。转录物3′UTR已被证明影响转录物在神经元中的亚细胞定位(An等人，2008年;Taliaferro等人，2016年). 然而，3′UTR也可以通过招募RNA-结合蛋白和miRNAs来影响蛋白质翻译或mRNA降解(Floor and Doudna，2016年;2016年5月;Mayr和Bartel，2009年;桑德伯格等人，2008年;Shenoy和Blelloch，2014年). 目前尚不清楚大脑特异性3′UTR如何影响这些过程，部分原因是RNA测序分析测量的是稳态转录水平，而不是它们的翻译水平。此外，核糖体分析（使用RNase保护的足迹测量核糖体在mRNA上的位置）无法测量3′UTR在消化时的翻译效应。先前的工作发现转录物5′UTR在小鼠ES细胞（mESCs）和早期NPC中介导异构体特异性翻译(Wong等人，2016年)但尚不清楚6天龄的神经前体细胞中是否存在脑特异性3′UTR延长。因此，脑特异性3′UTR延伸与蛋白质翻译之间的联系以及人类神经元分化过程中转录特异性翻译的动力学尚不清楚。

在这里，我们通过执行平行RNA-seq、核糖体分析和多糖体分析以及转录异构体分辨率（TrIP-seq(Floor and Doudna，2016年). 我们发现雷帕霉素复合物1（mTORC1）信号通路的机制靶点选择性地驱动人类胚胎干细胞（hESCs）中翻译相关基因的高水平翻译，而许多其他基因的转录和翻译变化是相关的。在转录水平上，长5′UTR的存在抑制了多能干细胞和分化细胞的翻译。相比之下，3′UTR在突触激活的神经元培养物中对翻译的影响最强，但对人胚胎干细胞的影响最小。与3′UTR长度相比，3′UTR的细胞型选择性翻译抑制是由调节性RNA结合蛋白和miRNA的结合位点密度的增加驱动的。因此，3′UTR延伸主要下调蛋白质的产生，这可能对严格控制高度专业化、有丝分裂后细胞（如神经元）的蛋白质平衡至关重要。

结果

测量人类神经元分化过程中的基因表达

我们使用双-SMAD抑制方案将hESCs区分为前脑命运(图1A和第1部分) (钱伯斯等人，2009年). 我们选择了四个发育阶段进行分析：增殖的人胚胎干细胞、神经前体细胞（NPC）、NPC分化后14天的神经元培养和NPC分化50天后的神经元培养。选择这四个端点来测量多能干细胞、增殖NPC、早期神经元培养物和含有突触活性神经元的成熟培养物中的初始基因表达。我们从每个终点收集了两个生物复制品，并进行了细胞质和核总RNA-seq测量转录组，核糖体分析测量基因水平翻译和核糖体位置，TrIP-seq测量转录特异性翻译(表S1). 我们使用基因水平翻译这个术语来表示基因产生的所有RNA分子的总翻译水平；相反，转录特异性翻译是指由基因产生的单个RNA转录物。

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测量人类神经元分化过程中转录和翻译的整体变化

（A） 实验设计。采用双-SMAD抑制法将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为神经前体细胞，然后进行神经分化。从每个细胞群收集样本，并从每个细胞中制备RNA-seq、核糖体分析和TrIP-seq文库。（B） 分化过程中五种细胞型标记的蛋白质印迹。（C） 细胞质RNA-seq标记基因示例。TPM：转录物中的基因级表达——每百万分之一。*：差异表达于p<0.01。Bar：平均表达式；点：每个复制中的表达。（D） 50天大体外分化人类神经元培养物的代表性图像。绿色：突触素；红色：MAP2；蓝色：DAPI。（E） 左侧，神经元的示例性全细胞电流钳记录，显示由25pA去极化电流注入引起的动作电位。对，例如自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）显示网络连通性。通过用NBQX（右下）阻断AMPA受体，sEPSCs被废除。另请参见图S1.

我们证实在mRNA和蛋白质水平上，hESCs表达多能性标记OCT4(POU5F1) (图1B、C). NPC表达已知标记，如PAX6,SOX1公司,HES1型和NES公司(图1B、C和S1B级)，第14天神经元培养开始表达神经元基因，如地图2(图1B，C和S1B级)和更成熟（第50天）的神经元培养物表达神经元标记物(喀麦隆、GRIA1、STMN2,国民账户体系25,DCX公司βIII-管蛋白和突触素；图1B-D和S1B级)以及胶质细胞标记物(图S1B). 在第50天，我们观察到代表发育中人类神经元的一类基因的强烈诱导(Pollen等人，2014年);图S1C). 因此，为了简单起见，我们将其称为神经元培养物。培养50天的神经元有突触点，电活动，并表现出兴奋性突触连接(图1D、E).

神经元分化过程中广泛的翻译变化

为了确定转录和翻译对神经元诱导过程中基因表达变化的相对贡献，我们将核糖体分析数据与RNA-seq数据中匹配的总mRNA水平进行了比较。由于不可能从第50天的神经元培养物中获得核糖体保护的足迹，因此对hESCs、NPC和第14天的神经元细胞培养物进行了此分析（见方法）。核糖体分析数据显示出对蛋白质编码区的预期偏好，并且在起始密码子附近出现一个峰值，这可能是由捕获期间捕获的翻译起始事件引起的(图S2A; (Lareau等人，2014年)). 核糖体谱和RNA水平的变化在细胞类型之间高度相关(图2A; hESCs和NPC或NPC与第14天神经元培养之间的r=0.89），表明转录变化是分化过程中基因水平表达变化的主要影响因素。

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人类神经元分化过程中的基因水平翻译控制

（A） 绘制了hESCs和NPC（左）或NPC和14天神经元培养（右）之间的RNA-seq与核糖体谱变化。绿色：核糖体分析（RP）中差异表达（DE）基因；橙色：RNA-seq中的DE基因；蓝色：RNA-seq和RP中的DE基因；黑色：不改变表达的基因（p>0.05）。（B） 与分化的细胞类型相比，hESCs中一组基因的5′UTR与ORF核糖体谱读数的对数比显示出高的5′UTR核糖体密度。（C） SOX2基因相对上游翻译减少。紫色：核糖体分析读取到5′UTR的映射。右图：百万分之一读数。插图：不同细胞类型中映射到5′UTR或主ORF的核糖体保护足迹计数；误差是标准偏差。另请参见图S2.

除了许多基因在转录和翻译上都发生了变化外，数千个基因在翻译中表现出显著的细胞类型特异性变化，而RNA水平没有相应的变化(图2A和表S2). 对差异翻译的基因进行分析，确定了46个转录相关基因，这些基因在NPC中相对于hESCs显著上调翻译（例如。YAF2公司,ARID1A公司,CTNNB1公司和RELA公司;图S2B)而与翻译本身相关的基因如EIF4B型、6个eIF3翻译起始因子复合体成员和56个核糖体蛋白在NPC中翻译下调(表S3). 在NPC和第14天的神经元培养中，593个基因仅在翻译水平上发生了改变。神经细胞培养中翻译活性最高的基因包括纤维连接蛋白FSD1L公司，转录抑制因子JAZF1公司和钙调素依赖性蛋白激酶营地4，尽管没有丰富的基因本体术语(图S2B).

核糖体可以启动mRNA 5′UTR（uORF）上游起始密码子的翻译，从而影响主要开放阅读框（ORF）的翻译(Brar等人，2012年;Hinnebusch等人，2016年). 我们假设人胚胎干细胞分化为神经前体将导致核糖体从mRNA 5′UTR中重新分布，正如在小鼠胚胎体形成中观察到的那样(Ingolia等人，2011年). 事实上，148个基因的相对5′UTR核糖体占有率在hESCs和NPC之间的变化超过了2倍(图2B). 变化的分布是不对称的，NPC中101个基因的5′UTR核糖体密度降低，只有47个基因增加。作为这一趋势的一个例子SOX2标准编码参与新皮质发育的SRY-box转录因子的基因(Bani-Yaghoub等人，2006年)，其5′UTR中的核糖体比分化细胞中的主要ORF多(图2C). 将神经干细胞分化为神经细胞培养物后，5′UTR内的翻译变化较少，与从人胚胎干细胞到神经干细胞的翻译变化相反（82个基因：5′UTR54个基因向上，28个基因向下；图2B). uORF的翻译会对下游ORF的转换产生积极或消极的影响(Brar等人，2012年;Hinnebusch等人，2016年). 我们发现，在分化过程中经历5′UTR核糖体增加的基因通常会降低主要ORF中的核糖体分析信号，反之亦然(图S2C). 这表明5′UTR中翻译核糖体的组装主要下调该系统中的翻译。总之，我们的研究结果表明，转录是神经元分化过程中大多数基因表达变化的原因，而翻译控制优先影响一部分基因，部分原因是核糖体从hESCs中的5′UTR重新定位到分化细胞中的开放阅读框。

胚胎干细胞中翻译相关基因的翻译水平升高

我们鉴定了172个与翻译相关的基因，这些基因在hESCs和NPC之间有差异翻译(图3A). mTORC1和MYC是蛋白质合成的两个主要调节因子，因此我们测试了它们是否有助于增强hESCs翻译因子的翻译(Bhat等人，2015年;Pourdehnad等人，2013年). 与分化细胞类型相比，人胚胎干细胞中MYC水平升高(图3B). 然而，MYC影响核糖体蛋白基因和核糖体RNA的转录(van Riggelen等人，2010年)核糖体蛋白基因在这些数据中表现出相对较小的转录变化(图3A). 相反，mTORC1在转录后调节富含翻译因子的基因子集的翻译(Thoreen等人，2012年). 因此，我们通过参与翻译控制的主要靶点p70S6激酶和4E-BP1的磷酸化来评估mTORC1的活性。我们还评估了p70S6K靶点核糖体蛋白S6（一种常用的mTORC1活性读数）的磷酸化状态。hESCs分化为NPC强烈降低了mTORC1活性，表明mTORCl信号的抑制可能是神经诱导过程中翻译机制下调的基础(图3C). 为了支持这一点，172个基因中有72个基因专门经历了hESCs和NPC之间的翻译变化，与先前确定的mTORC1靶点重叠(Thoreen等人，2012年)p=1.6e-31，超几何检验）。为了实验测试mTORC1信号的作用，我们测量了翻译水平升高的基因在图3A用雷帕霉素抑制hESCs中的mTOR后(图3D). mTOR抑制后，EIF4B、EIF3D、RPL10A和RPLP1的蛋白水平大量降低，但肌动蛋白没有受到影响。分化过程中mTORC1抑制剂TSC2水平升高，这可能是mTORC2活性降低的机制(图3C). 我们得出结论，mTORC1信号传导驱动了人胚胎干细胞翻译相关基因的高水平翻译。

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通过hESCs中的mTORC1提升翻译

（A） RP或RNA-seq中显示的细胞类型之间对数2倍变化的热图。青色：早期细胞型较高；黄色：晚期细胞型较高。上图：RP和RNA-seq折叠变化的皮尔逊相关性。（B） MYC、RPL38、UBA52和HOXA9在分化过程中的核糖体分析和RNAseq表达谱。Bar：平均表达式；点：每个复制中的表达。（C） 磷酸化p70S6K、磷酸化S6和磷酸化4EBP1作为分化神经元细胞中mTOR活性的读数，以及mTOR阻遏物TSC2的蛋白质印迹。（D） （A）中四个hESCs翻译升高的基因在20 nM雷帕霉素处理指定时间（以小时为单位）后的hESCs蛋白质水平。（E） 80种核糖体蛋白在不同细胞类型之间RNA与核糖体谱水平的对数2倍变化。

我们观察到mTORC1活性在早期神经元分化过程中增加（从NPC状态到第14天神经元培养，图3C). 为了测试早期神经元培养中mTORC1信号的再激活是否与翻译机制的变化相关，我们比较了hESCs、NPC和早期神经元培养中核糖体蛋白的翻译调节。与mTORC1信号的重新激活一致，与NPC相比，早期神经元细胞中许多核糖体蛋白的翻译增加(图3B、E). hESCs、NPC和早期神经元细胞之间这类基因的转录变化小于翻译变化(图3E)强调了翻译监管在这一背景下的相对重要性。

活性核糖体可以在没有一些核糖体蛋白质的情况下进行组装，这导致了核糖体特化的概念(Komili等人，2007年;Shi和Barna，2015年). 与这一观点一致，我们发现并非所有核糖体蛋白在不同细胞类型之间的翻译水平变化都相同(图3E). 例如，RPL38型在hESCs与NPC中强烈上调翻译，并在早期神经元培养中重新激活(图3B，E).RPL38型选择性地控制基因子集的翻译，包括HOX公司基因(薛等，2015). 有趣的是RPL38型-敏感基因HOXA9型在早期神经元培养中，当其转录增加时上调(图3B). 此外，融合基因UBA52型与NPC相比，表达泛素和RPL40的人胚胎干细胞中的翻译上调，并且RPL40也被证明可以调节转录特异性翻译(图3B; (Lee等人，2013年). 总之，我们的结果表明，mTORC1信号在神经元分化过程中驱动动态核糖体蛋白表达，这反过来可能在不同的细胞环境中产生mRNA的选择性翻译。

人类神经元分化过程中的转录特异性翻译

基因翻译水平的改变可以由mRNA翻译的改变或转录处理的改变驱动，产生新的mRNA转录亚型，赋予不同的翻译水平。然而，由于受保护足迹的长度较短，并且替代的3′UTR对该技术是不可见的，因此使用核糖体分析很难解决转录特异性翻译(Ingolia，2014年). 为了确定包括3′UTR在内的差异转录亚型表达在人类神经元分化过程中的影响，我们使用TrIP-seq测定了转录亚型特异性翻译(Floor and Doudna，2016年)在与核糖体分析所用样品相同的样品中。TrIP-seq使用多糖体分析和高通量测序来识别高度翻译的转录亚型（多糖体-高部分）和翻译频率较低的转录亚型别（多糖体-低或单糖体部分；图4A). 单体被分离是因为与多体结合mRNA相比，单体结合mRNAs富含保留内含子和无义介导的衰变（NMD）靶点(Floor and Doudna，2016年;Heyer和Moore，2016年)代表转录后控制的关键层(Raj和Blencowe，2015年). 先前的工作表明，多聚体样品分为三组，分别对应于此处使用的单体、低聚体和高聚体组分(Floor and Doudna，2016年). RNA-seq文库是从这些片段中提取出来并进行深度测序的，产生了超过20亿个映射读取(表S1和S4系列).

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人类神经元分化过程中的转录水平翻译控制

（A） hESCs、NPC、第14天神经元培养和第50天神经元培养的多糖体谱。从TrIP-seq的指定部分收集RNA。（B） 两份不同翻译的MECP2型基因在50天的神经元培养物中表达，其UTR长度和翻译水平不同。Bar：平均表达式；点：每个复制中的表达。（C） 从MECP2型轨迹。（D） 在不同亚细胞组分中，每个基因表达的转录亚型数量超过总基因表达的5%。

替代转录处理对蛋白质生产的显著影响对于诸如MECP2型它编码一种甲基-CpG DNA结合蛋白，该蛋白在大多数Rett综合征患者中发生改变(Lombardi等人，2015年). 一些亚型（例如MECP2-001）包括一个替代外显子，该外显子改变了MECP2-002中第一个起始密码子的阅读框架。因此，该外显子内含物将uORF引入mRNA，从而下调蛋白质的产生(图4B, (Kriaucionis和Bird，2004年). MECP2的3′UTR也被交替处理，导致各种短（~100 nt）或长（~8 kb）形式，这些形式在神经元分化过程中被差异翻译和表达(Rodrigues等人，2016年). 我们在50天龄的人类神经元培养物中观察到这两种转录处理事件的影响。具体来说，在单体和多体低组分中，与多体高组分相比，到第二、备选外显子和3′UTR的reads映射更高(图4C)这表明这些转录亚型的蛋白质产量较低。

上述示例重点关注由MECP2型，但该基因有26个带注释的亚型。在我们的数据中，其他转录亚型要么没有表达，要么没有在多聚体中发现，这表明只有一部分转录亚型被翻译。因此，我们测试了转录异构体的翻译是普遍的还是选择性的。我们计算了在核RNA、细胞质RNA和三个多聚体衍生部分中表达超过总基因表达水平5%的转录亚型的数量。我们发现核输出和翻译都是瓶颈，选择所有表达的转录亚型的子集。在所有四个细胞阶段，我们发现细胞核具有最高的转录亚型多样性(图4D). 一部分输出转录物与核糖体相关，导致细胞质RNA、单体相关RNA中每个基因的转录物减少，多体RNA中转录物多样性进一步降低(图4D). 总之，我们发现单个转录亚型在翻译潜力方面差异很大，从富含细胞核到高度多聚体相关，这种差异影响与人类神经发育障碍相关的基因的蛋白质生产。

转录RNA处理的改变推动基因水平翻译的改变

如上文所述，确定转录特定翻译的流行程度MECP2型例如，我们在分化过程中识别出差异翻译的转录本。分层聚类用于根据转录物的多聚体分布对转录物进行分组(图5A,图S3B和表S5). 在人胚胎干细胞和分化细胞类型中，存在主要与单体、多体低或多体高组分相关的成簇转录物。对不同多体簇中转录亚型的类型进行分类，发现在所有四种细胞类型的单体部分中保留的内含子转录物富集(图5B) (Floor and Doudna，2016年;Heyer和Moore，2016年). 我们注意到，当我们观察到数百个未记录的事件时，内含子保留的真实比率更高，例如DNA甲基转移酶中的细胞型特异性内含子保留DNMT3B公司(图S3A). 这些保留在多聚体上的内含子转录物也可能通过NMD降解，这被认为是下调神经元中各类基因的机制(Raj和Blencowe，2015年).

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人类神经元分化过程中转录水平翻译的趋势

（A） 转录物同种型表达的层次聚类的热图。请参阅图S3B用于树状图和平均图。（B） 显示了主要存在于单体部分的成簇转录物的选择转录类型。大多数其他转录本注释为蛋白质编码。（C） 对比细胞类型之间的低翻译和高翻译簇，确定转录物，如SKP1-004，它们在细胞类型之间有差异翻译。Bar：平均表达式；点：每个复制中的表达。（D） 绘制了细胞类型之间多聚体低簇和多聚体高簇的归一化Jaccard相似性。另请参见图S3.

我们通过核糖体分析观察到的细胞状态转换过程中数千个翻译变化可能是由新转录亚型的产生和翻译效力的改变或相同转录亚型翻译的改变所驱动的。为了测试这两种调节机制的相对贡献，我们比较了细胞类型之间低翻译和高翻译转录物的集群。数千个转录亚型在细胞类型之间从低到高（或从高到低）的多体簇移动，可能是由于它们的翻译水平发生了变化。例如SKP1系列神经元分化后SCF泛素连接酶与多聚体高比例相关(图5C). 我们通过计算细胞类型之间的低和高多染色体簇之间的Jaccard相似性（由并集划分的交集）系统地分析了这一点。在成对的细胞类型中检测到60-76%的转录亚型，其中第14天和第50天的神经元培养具有最高的相似性。我们发现，在多种细胞类型中表达的转录亚型经常保持其翻译水平，即使在hESCs和第50天神经元细胞之间也是如此(图5D). 因此，相对于单个转录物翻译水平的改变，稳态基因水平翻译的改变往往是由替代转录物亚型的产生驱动的。

神经元培养中3′非翻译区选择性抑制翻译

接下来，我们确定了与神经元分化过程中差异翻译相关的mRNA的特征。即使基因的两个交替处理的转录物之间的编码序列相同，由于5′端和3′端未翻译区域的调控成分发生变化，蛋白质输出水平也可能不同(Arribere和Gilbert，2013年;Floor and Doudna，2016年;Hinnebusch等人，2016年;2016年5月;Mayr和Bartel，2009年;Sandberg等人，2008年;Sterne-Weiler等人，2013年). 因此，我们比较了可能影响翻译的低聚体簇和高聚体簇中的转录亚型特性，例如3′UTR或密码子使用中各种调节元件的密度(图S4A). 我们比较了来自同一基因的亚型之间的特征（方法）。在测试的21个特征中，5个影响所有细胞类型的翻译，11个影响细胞类型相关的翻译，5个没有影响或影响很小。长5′UTR与所有细胞类型的低水平翻译一致相关(图6A). 相比之下，另一种转录特性ORF长度与所有细胞类型中较高的核糖体占有率有关，尽管在较老的神经元培养物中这种作用减弱(图6A).

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3′非翻译区驱动细胞类型之间的差异翻译

（A） 同一基因的低翻译和高翻译转录物之间的3′UTR相对长度在分化过程中增加。误差条：95%置信区间，也在（B，C）中。（B） 细胞类型之间表达的相同基因转录物的相对3′UTR长度增加。（C） 在50天龄的神经元培养物中，3′UTR结构、含有富含AU元素的3′UTRs的比例以及脑特异性miRNA结合位点的影响增加，表明这些特征可能驱动3′UTR-的翻译抑制。（D） 影响3′末端选择或转录后控制的选择性RNA结合蛋白的表达变化。另请参见图S4.

在50天的神经元培养中，转录子3′UTR长度对翻译的影响比其他任何特征都大(图6A). 相比之下，转录物3′UTR对人胚胎干细胞的影响可以忽略不计(图6A). 当细胞分化为神经元培养物时，长转录物3′UTR与较低水平的翻译相关。分化过程中3′UTR长度对翻译的影响增加，最简单的解释是3′UTR-长度的变化。或者，这种影响可能是由3′UTR调节内容或细胞转录后控制因子的变化引起的。在第14天的神经元培养中，基因转录物之间3′UTR的相对长度增加，与第50天的增加程度相似(图6B)然而，在第50天的神经元培养中，3′UTR长度比在第14天的培养中更强烈地抑制翻译(图6A). 这表明3′UTR或细胞转录后控制因子调控内容的改变是翻译抑制增加的原因。事实上，预测的3′UTR二级结构、由富含AU的元素组成的3′UTR的分数以及脑特异性miRNAs结合位点的数量和密度（miR-9、−26、−124、−137，−195、−）、−219-、−338和let-7(Shenoy和Blelloch，2014年)在神经元分化过程中均增加(图6C). 此外，在分化过程中，与转录物3′UTR相互作用的几种RNA结合蛋白的表达水平增加，例如SMAUG1(SAMD4A公司)，施陶芬1(STAU1号机组)，施陶芬2(车站2)，WIG1(ZMAT3公司)和细胞质多腺苷化元件结合蛋白CPEB1公司和CPEB4公司我们还看到了调节选择性多腺苷酸化的蛋白质的基因表达变化的证据，例如CSTF2型，多个ELAV飞机基因，以及11月1日和NOVA2公司(图6D). 综上所述，这些数据表明，在神经元分化过程中，3′UTR的延伸会诱导强烈的翻译抑制，而翻译抑制是由调控元件驱动的。

讨论

在这项工作中，我们分析了人类前脑神经元分化过程中转录和翻译变化之间的关系。我们的工作为大脑发育过程中观察到的3′UTR延伸指定了功能后果，揭示了人类神经元分化过程中转录后控制的变化，并提供了丰富的非翻译区资源，这些非翻译区提供了全局或细胞型特异性蛋白表达(图7).

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人类神经元分化过程中的动态翻译调控

左图：人类神经元分化过程中转录后调节过程的近似动力学图。青色：3′UTR介导的翻译抑制，橙色：5′UTR中介的翻译抑制；黑色：翻译相关基因产生的mRNA的优先翻译。右：有助于中央调控过程的机制。单个mRNA可能受到其中一种或多种机制的调控。我们的研究和以前的工作表明，整体翻译随着分化而增加，随着神经元的成熟而减少，如虚线所示。

微调翻译和mTORC1信号对正常神经元发育至关重要(Hartman等人，2013年;Magri等人，2011年). 我们发现，hESCs中mTORC1信号的高表达驱动翻译相关基因的高水平翻译(图3)在神经元分化过程中减少。然而，人胚胎干细胞和其他干细胞类型的总翻译水平较低(Oh等人，2005年;Sampath等人，2008年;桑切斯等人，2016年;Signer等人，2014年). 我们观察到的多聚体图谱也似乎表明，随着人胚胎干细胞分化为NPC，高多聚体（以及翻译）的全球增加(图4A). 人胚胎干细胞如何实现核糖体蛋白和翻译相关基因的选择性翻译(图3)尽管整体翻译水平较低？一种可能性是，一些人胚胎干细胞核糖体维持在非活性状态，并在分化为NPC时被激活。也有可能，人类胚胎干细胞通过核糖体特化优先翻译信息子集(Komili等人，2007年;Shi和Barna，2015年;薛等，2015)，使用eIF3的转录特定翻译路径(Lee等人，2015年)或其他机制。一个有趣的未来方向将是定义hESCs中翻译相关基因优先翻译的分子机制，并确定其对人类神经元分化的影响。

神经元通过将转录物3′UTR组延长数百万个核苷酸来增加其转录后控制潜力(Hilgers等人，2011年;Miura等人，2013年). 我们的数据清楚地表明，延伸的3′UTR有助于对神经元分化的翻译抑制。神经元中RNA和蛋白质表达的失调会产生有害后果，并导致许多神经和精神疾病(Darnell，2013年;Pilaz和Silver，2015年). 例如，TLS变体的表达式/保险丝肌萎缩侧索硬化患者中发现的RNA结合蛋白导致人类细胞中异常基因表达，包括MECP2型(考迪和曼利，2015年). 类似地新数据21神经系统疾病患者中发现的基因增加了MECP2型长3′UTR的mRNA分子(Gennarino等人，2015年). 总计MECP2型患者源性细胞中的mRNA水平升高(Gennarino等人，2015年)或表达TLS/FUS变体的人类细胞(考迪和曼利，2015年)但这两种情况下MeCP2蛋白水平均下降。因此，在研究涉及转录后控制因子基因改变的疾病时，以本文所述的方式测量翻译变化，以检测和量化替代转录物和3′UTR是至关重要的。

神经元经历各种形式的可塑性，使神经系统能够学习和适应，这通常需要在转录和翻译水平上改变基因表达(Costa-Mattioli等人，2009年). 在某些情况下，突触的局部翻译调节突触可塑性(霍尔特和舒曼，2013年)这涉及到停滞多聚体的重新激活(Graber等人，2013年). 大多数测量整体翻译的方法专门测量组装的80S核糖体在mRNA上的占有率。翻译经常在起始阶段受到调节(Hinnebusch等人，2016年)核糖体占有率与蛋白质水平相关(Floor and Doudna，2016年;Ingolia等人，2009年). 然而，调节翻译延伸使核糖体占有率和蛋白质合成解耦，因为停滞的核糖体并不积极合成蛋白质。有趣的是，我们发现在神经元分化过程中，ORF长度对mRNA核糖体占有率的影响降低(图6A)，这可能是伸长期间失速增加的迹象。神经伸长停滞至少部分由FMRP与核糖体结合介导(Chen等人，2014年;Darnell等人，2011年). 我们观察到，长转录物3′UTR在低多糖体部分中富集(图6)这表明，如果这些转录物被结合到在伸长过程中停滞的多聚体中，则很少有核糖体结合。分离翻译起始和延伸对神经元分化和功能的贡献很重要，通过测量单个mRNA上多个核糖体的位置的方法将有助于此。

我们的工作和以前的研究共同表明，5′UTR对细胞类型的依赖性控制和3′UTR的细胞类型特异性控制可能是后生动物翻译的一般特性(Floor and Doudna，2016年;Lianoglou等人，2013年;Merritt等人，2008年). 然而，控制5′和3′UTR翻译的监管特征是复杂的(图6和S4系列). 我们的工作激励了未来对未翻译区域合成库的翻译输出进行测量的实验。对调控元件进行深度采样，可以对不同细胞类型中转录特征对翻译的依赖性进行严格建模或机器学习。这样的模型将实现一个主要目标：能够仅基于序列预测不同细胞类型中mRNA的翻译水平。本研究中确定的细胞类型之间调节机制的复杂性突显了这样一个模型对于理解基础生物学和工程合成基因或mRNA翻译水平的重要性。

总的来说，我们的工作揭示了人类神经元分化过程中多层基因表达程序的广泛变化。我们的发现有助于解释人类神经和发育障碍中发生的转录后过程的改变。总之，翻译控制的多个方面既与转录输出一致，也独立于转录输出，从而在神经元谱系的规范化过程中形成基因表达。

实验程序

人胚胎干细胞培养

如前所述进行人类胚胎干细胞培养(布莱尔等人，2016年)WIBR3 hESCs（NIH干细胞注册号#0079(Lengner等人，2010年). 简言之，所有人胚胎干细胞系都保存在灭活小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）层上，培养基由DMEM/F12组成，补充20%敲除血清替代物、2 mM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 mMβ-巯基乙醇、1000 U/ml青霉素/链霉素和4 ng/ml FGF2。培养物每7天用IV型胶原酶传代一次，并在补充有5%胎牛血清和1000 U/ml青霉素/链霉素的DMEM/F12洗涤液中洗涤3次，进行重力沉降。人类胚胎干细胞定期检测支原体污染。

神经元分化与培养

如前所述进行神经诱导(Chambers等人，2011年)，略有改动。单个hESCs最初以50000/cm的密度进行电镀2(1.9×105细胞/12孔板孔），并保持在完全调节的hESC培养基中，直至>90%融合。将hESCs转移到添加100 ng/µl Noggin和10µM SB431542的诱导培养基中，每天更换培养基10天。诱导培养基的组成在整个诱导过程中发生变化，从第1-4天开始使用100%诱导培养基A（A），第5-6天使用75%诱导培养基B（B），第7-8天使用50%A和50%B，第9-10天使用25%A和75%B。诱导培养基A由含有15%KSR、2 mM l-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1000 U/ml青霉素/链霉素和55µMβ-巯基乙醇的敲除DMEM组成。诱导培养基B由50%DMEM/F12培养基、50%神经基础培养基1x N-2增补剂、1x谷氨酰胺、1000 U/ml青霉素/链霉素、0.2%人胰岛素和0.075%牛血清白蛋白组成，如前所述(Chambers等人，2011年). 神经诱导完成后，用Accutase将细胞分离，以800 rpm转速旋转4分钟，再悬浮在添加25 ng/ml FGF2和40 ng/ml EGF的诱导培养基B中，并以1:2的比例重新放置在基质凝胶上。添加FGF2和EGF的三分之二培养基每隔一天更换一次。细胞每隔5天传代一次，直到第4代，在1:3时分裂。

从NPC向神经元培养物的分化开始于第8代，即神经诱导开始后45天和神经诱导完成后35天。NPC以低密度镀敷–80000个/cm2(8×105细胞/6孔板的孔）。为了成像，将细胞以相同密度镀在24孔板中的12mm玻璃盖玻片上。生长培养基（N2B27培养基）由50%DMEM/F12、50%神经基础培养基、1x N-2增补剂、1x B-27增补剂、1 x谷氨酰胺、1000 U/ml青霉素/链霉素和0.075%BSA w/v组成。在最初的12天，生长培养基中添加20 ng/ml BDNF和20 ng/ml NT-3。对于随后的培养基改变，使用N2B27培养基，没有额外的生长因子。所有神经元介质每4天发生一次变化，其中一半体积变化。在NPC分化后14或50天收集神经细胞培养物(图S1A).

复制

所有实验均使用技术和生物复制品。技术复制品包括在相同的实验处理和条件下同时进行电镀处理的细胞。生物复制是以匹配的细胞数量和实验处理间隔一代接种细胞。技术复制用于评估测序文库制备和其他程序的采集程序的稳健性。所有测序实验都使用了两个生物复制品。

收集细胞

在收获之前，用100µg/ml的环己酰亚胺在37°C的预加热培养基中溶解5分钟，并将100µg/ml的环己酰亚胺添加到所有下游缓冲液中。使用1mg/ml IV型胶原酶将人胚胎干细胞从饲养层中分离出来20分钟，然后在补充有5%胎牛血清和1000U/ml青霉素/链霉素的DMEM/F12洗涤液中进行3次重力沉降。用Accutase分离NPC和神经元培养物，并以800 rpm转速旋转4分钟。用PBS清洗约1000万个细胞的细胞颗粒，将其旋转并重新悬浮在500µl低渗冰溶缓冲液中（10 mM HEPES pH 7.9，1.5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.5 mM DTT，1%Triton X-100，100µg/ml环己酰亚胺）。然后将所有样品在冰上培养10分钟，用26G针头研磨10次，在4°C下1500g旋转5分钟（使细胞核和细胞体颗粒化），将上清液转移到一个新的试管中，该试管用于多聚体或核糖体平行分析。将20–30µl细胞质裂解物添加到300µl Trizol试剂中，将细胞核重新悬浮在300µl Trizol溶剂中，以分别生成细胞质和核RNA样品，并使用制造商的方案纯化RNA。

多聚体剖面

如前所述，使用蔗糖梯度离心分离多聚体(Floor and Doudna，2016年). 将来自2-4个核糖体和5-8+核糖体部分的等体积样品合并。有关更多详细信息，请参阅补充实验程序。

核糖体轮廓数据处理与分析

适配器随Cutadapt 1.13一起拆下(马丁，2011)（--修剪-n-u 3--最小长度15），保留UMI。使用PRINSEQ去除PCR重复读数(施密德和爱德华兹，2011年)（-derep 1-no_qual_header）。然后使用Cutadapt（--trim-n-u−5--最小长度15）移除五个基础UMI。使用Bowtie2 v 2.2.6删除与人类rRNA和RMSK衍生区域对齐的修剪读码(Langmead和Salzberg，2012年)（-L 10-i S，1,0.5）。将hESCs的读数与人类-小鼠组合基因组进行比对，如果比对次数超过一次，则将其丢弃，在大多数情况下，比对次数<1%，在所有情况下，比对次数<2%。剩余读数使用Kallisto 0.43进行量化(Bray等人，2016年)（bias--fr-standed--single-l<avg>-s<stdev>）使用ORF和5′UTR区域的所有Ensemble GRCh38 v84转录本的索引。如果在生成指数之前，ORF和5′UTR的差异小于100 bp，则合并区域。使用tximport将量化的转录区域聚集到基因水平，并使用DESeq2进行分析(Love等人，2014年). 统计上显著的变化称为p<0.01。生物重复样本高度相关(图S1D). 通过将每个基因的5′UTR量化读取计数除以每个基因的ORF量化读取计数，计算出5′UTR/ORF比率。使用HISAT2 v2.0.4将读数与基因组对齐以进行可视化(Kim等人，2015年)并通过IGV进行可视化(Thorvaldsdottir等人，2013年). 床具2.21(昆兰，2014)和Samtools 0.1.19和1.3(Li等人，2009年)也使用了。

TrIP-seq多聚体数据处理与分析

使用Cutadapt 1.13（--minimum-length 50）去除成对end适配器，使用Bowtie2 v 2.2.6去除与人类rRNA或RMSK衍生区域对齐的修剪读取。人胚胎干细胞的读数与人-鼠组合基因组进行比对，如果比对一次以上，则会被丢弃，大多数情况下比对结果小于1%，所有情况下比对值小于2%。其余读数使用Kallisto 0.42（--bias）进行量化，使用所有Ensembl GRCh38 v84转录本的索引。量化的转录区域被聚集（下一节）或使用DESeq2进行分析，或使用tximport聚集到基因水平并使用DESeq进行分析。统计上显著的变化称为p<0.01。生物重复样本高度相关(图S1E). 使用HISAT2 v2.0.4和IGV将读数与基因组对齐以进行可视化。代表不同细胞类型的基因类别(图S1C)已在中确定(Pollen等人，2014年)或(Mallon等人，2013年). 绘制了每个基因类别中的中值表达。此分析中使用的Python程序可以下载在http://github.com/stephenfoor/tripseq-analysis.

层次聚类和分析

聚类基本上按照描述执行(Floor and Doudna，2016年)，使用欧几里德距离。转录物在单体、低多体和高多体样本中聚集，以反映多体图谱中的转录物丰度。对每个转录物的平均减法、正则化对数变换（rlog；DESeq2）进行聚类。簇数是通过合并低于指定树状图高度的簇来确定的，直到合并合并具有不同平均轮廓的簇。在分析之前，将主要映射到单体、低聚体或高聚体组分的簇的转录物汇集在一起。集群间比较使用标准化的Jaccard指数，该指数修正了集合大小差异：

J型规范(A类,B类)=|A类∩B类||B类||A类∪B类||A类|对于|B类|>|A类|

为了表明与翻译相关的转录特征独立于聚类，我们使用DESeq2鉴定了多聚体低和多聚体高组分之间具有统计显著差异的转录亚型。多聚体低或多聚体高富集转录物表现出与比较成簇转录物时观察到的类似趋势(图S4B).

转录特征的计算和比较

转录特征的编译和定义如所述(Floor and Doudna，2016年). 所有的比较都是来自同一基因的转录物同种型与所有表达的转录物同种型之间的比较。使用Cliff’s测量效果大小d日与曼希特尼有关U型统计依据d日=2U型锰−1，其中米和n个是两组样本的大小，并使用R包ordom（CRAN）进行计算。脑特异性microRNA的预测结合位点(Shenoy和Blelloch，2014年)来自TargetScan 7.1(Agarwal等人，2015年).

​

集锦

人类神经元分化过程中基因和转录物的翻译控制

mTOR信号通路促进hESCs中翻译相关基因的选择性翻译

5′UTR影响全球翻译；3′UTR控制细胞类型特定转换

长3′UTR优先下调神经元翻译

补充材料

1

单击此处查看。（948K，pdf）

2

表S1。所有测序库的读取跟踪，与图2和图4相关。

单击此处查看。（44K，xlsx）

三

表S2。DESeq2中RNAseq和核糖体剖面变化的统计测试，与图2相关。

单击此处查看。（7.1M，xlsx）

4

单击此处查看。（97K，pdf）

5

表S4。TrIP-seq多聚体分析样本的量化表达值，与图4相关。

单击此处查看。（73M，xlsx）

6

表S5。TrIP-seq多聚体剖析样本的聚集转录物和表达值，与图5相关。

单击此处查看。（24M，xlsx）

7

单击此处查看。（9.8K，xlsx）

致谢

我们感谢A.Tambe、B.Do、R.A.Flynn、S.Iwasaki、N.Ingolia、A.S.Y.Lee、S.Venkataramanan、A.Bhate和S.McDevitt的有益讨论、共享试剂或为软件开发做出贡献。J.D.B.获得了加拿大卫生研究院的弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金（356733）。D.H.由皮尤慈善信托基金会、亚历山大和玛格丽特·斯图尔特信托基金会（Alexander and Margaret Stewart Trust）、西贝尔干细胞中心（Siebel Stem Cell Center）和NIH R01CA196884的皮尤-斯特瓦特癌症研究学者（Pew-Stewart Scholar for Cancer Research）提供支持。J.A.D.是HHMI研究员和Paul Allen科学前沿研究员。H.S.B.得到了阿尔弗雷德·斯隆基金会（Alfred P.Sloan foundation）、大脑与行为研究基金会（Brain&Behavior Research foundation）、赫尔曼家庭教师基金会（Hellman Family Faculty Fund）和NIH R01NS097823的NARSAD青年研究员资助。S.N.F.是Helen Hay Whitney基金会的HHMI研究员。加州大学伯克利分校文森特·科茨基因组测序实验室由NIH S10 OD018174支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

作者贡献：

概念化、S.N.F.、J.A.D.和D.H。；方法，S.N.F.和J.D.B。；软件，S.N.F。；调查、S.N.F.、J.D.B和H.S.B。；书面——原始草案，S.N.F。；写作——审查与编辑，J.D.B.、D.H.、J.A.D.、H.S.B.和S.N.F。；融资收购、D.H.、J.A.D.、H.S.B.和S.N.F。；监督、D.H.、J.A.D.、H.S.B.和S.N.F。

加入号码：所有测序读数均可通过注册号为GSE100007的NCBI GEO获得。

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