生酮饮食加速前脑线粒体DNA毒性小鼠的神经退行性变

2.2. 光学显微镜和生物化学

将整个大脑固定在10%（v/v）中性缓冲福尔马林（Richard-Allan Scientific）中至少48小时，并将石蜡包埋。使用旋转切片机（Microm 355 S）将大脑切割成4µm厚的冠状切片，切片在37°C的玻片上干燥过夜。

对于苏木精和伊红（HE）染色，用苏木精-伊红处理切片（HE；Richard-Allan Scientific）。使用蔡司Axioplan 2显微镜对HE染色切片进行研究，并使用AxioCamHRc和AxioVision Rel.4.6软件拍摄照片并进行分析。为了进行细胞计数，使用一个20倍物镜，使用自动幻灯片扫描仪系统（Axio Scan Z1，德国慕尼黑卡尔蔡司显微镜）获取组织切片的高分辨率图像。使用Zen Lite Blue软件（卡尔蔡司显微镜）检查图像，并通过Navigator数据管理界面进行分析(http://cmbn-navigator.uio.no/navigator). 计算齿状回颗粒细胞层锥体下部分100µm长范围内的细胞数量(图2A)背海马高倍扫描图像。海马结构的“大小”被量化为放射层（r）和腔隙分子层（lm）的总厚度(图2A，中间面板)。

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图2

生酮饮食会加速mutUNG1表达小鼠海马体的萎缩、神经变性和反应性星形胶质细胞增生。（A） 典型的HE染色海马冠状石蜡切片显示，与野生型（顶面板）和标准饮食（中面板）的mutUNG1表达小鼠相比，喂食生酮饮食（KD，底部面板）的mutUNG1表现小鼠的萎缩和神经元变性增加。在高倍扫描照片上，对颗粒细胞层锥体下部分（dg，标记在左中面板上）100µm长范围内的细胞数量进行计数。样品图片和结果（平均值±标准偏差，n只小鼠，第页=0.05表示较低2）之间的差异。（B） 定量海马层r+lm的厚度（冠状切片中，A标记在中间框架中）表明，与分别喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠相比，喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠的海马体积显著减小（n=3只/组，第页=0.02和第页= 0.03). （C） 在喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠和喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠中，海马冠状石蜡包埋切片免疫标记神经元标记物MAP2，后者显示标记的锥体和颗粒细胞树突丢失。（D） 免疫染色的定量显示，与喂食标准饮食的野生型和表达mutUNG1的小鼠相比，喂食生酮饮食的表达mutUNG1的小鼠中MAP2的显著降低（每组n=3只小鼠，第页<0.0001和第页< 0.0001); 喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠也与野生型小鼠不同(第页= 0.01). （E） 对喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠以及喂食生酮饮食的mutUNG2表达小鼠的海马冠状石蜡包埋切片进行星形胶质细胞标记GFAP免疫染色。（F） 免疫荧光定量显示，与标准饮食喂养的野生型和mutUNG1表达小鼠（每组3只，第页= 0.003,第页< 0.0001). （C）和（E）中带点的矩形表示用于量化免疫反应的感兴趣区域。比例尺=100µm（C和E）和20µm（A中的右侧面板）。星号系列标志着lm和m之间的海马裂。在本图和后续图中，统计显著性水平用星号表示(*第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01; ***第页≤ 0.001). 缩写：dg，齿状回颗粒细胞层；h、 齿状回门；HE、苏木精和曙红；lm，海马CA1的腔隙分子层；m、 齿状回分子层；o、 地层定向；p、 锥体细胞层；r、 放射状地层。

对于免疫组织化学研究，切片在57°C下加热10分钟以脱蜡，并在Clear Rite 3溶液（Richard-Allan Scientific）中培养两次，每次培养5分钟。此后，通过在一系列下降浓度的乙醇（100%、96%和70%）中各培养1分钟，使切片重新水化，最终得到蒸馏H₂O.然后将切片置于Tris-EDTA缓冲液（10-mM Tris碱，3.8-mM EDTA，pH调节至9.0）中，在95°C下加热15分钟进行抗原回收，在室温下冷却10分钟，在蒸馏H中培养5分钟₂O、 然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）/0.1%吐温-20中放置5分钟。然后用0.1%Triton X-100（Sigma）在PBS中渗透切片15分钟，用0.1%吐温-20在PBS内洗涤两次，并用含有5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma。将切片在4°C下与一级抗体在0.5%BSA/0.5%山羊血清/0.1%吐温-20 PBS中稀释培养过夜。清洗后，用Alexa Fluor 594-结合的山羊抗鼠IgG（H+L）（Invitrogen，A11005）或Alexa Fuor 488-结合的羊抗兔IgG，视情况而定。通过与1µg/mL 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（Sigma）孵育，对切片中的细胞核进行染色。使用Mowiol 4–88试剂（Merck Biosciences Ltd）盖玻片安装切片，并使用蔡司Axiover 200 M显微镜进行检查。使用AxioCamMRm和AxioVision Rel.4.6软件采集并分析图像。所有显微镜和软件的设置对于所比较的图像都是相同的。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色法观察细胞核。免疫反应性的定量是通过使用ImageJ软件测量绿色和红色荧光强度来进行的(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)使用分析：测量RGB插件。绿色或红色像素的数量是相对于测量区域（“感兴趣区域”）表示的，该区域是一个矩形，包含CA1中金字塔层和齿状区域门之间的所有层(图2C、E和​和3A3A级)。

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图3

喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠上调了线粒体抗氧化防御。（A） SOD2（绿色）免疫标记石蜡包埋海马的冠状切片表明，在喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠中，线粒体抗氧化防御受到诱导，而喂食生酮饮食（KD）的mutUNG1表达鼠的线粒体抗氧化防御能力进一步增强。核DNA编码的电子传递复合物II（红色，中间行）在所有3种条件下的分布与SOD2相似。在合并的框架中（底行），黄色或橙色表示免疫反应在相同结构中的共定位。在有生酮饮食和无生酮饮食的mutUNG1小鼠中，周核（箭头）的线粒体标记较强，但在野生型小鼠中没有。mutUNG1+KD的红色和绿色比仅mutUN1的更亮。带斑点的矩形表示用于量化免疫反应的感兴趣区域（B），带斑点的正方形表示特写图片的大致位置（C）。比例尺=100µm（物镜10×）。（B） SOD2和线粒体复合物II免疫荧光定量（如A（顶部）所示，矩形区域的平均面积。与野生型相比，mutUNG1小鼠SOD2增加(第页=0.003）和喂食生酮饮食的mutUNG1小鼠(第页< 0.0001). 当喂食生酮饮食时，mutUNG1小鼠的复合物II增加(第页= 0.001). （C） 高倍放大相当于A中点状正方形的区域，显示SOD2和复合物II在神经元胞周（dg细胞，大箭头）和神经膜（小箭头）的线粒体样结构中的共定位。在表达mutUNG1的小鼠中，尤其是在生酮饮食时（右下框），这种结构簇积聚在神经元胞体周围。比例尺=10µm（物镜63×油浸）。缩写：dg，颗粒细胞层；h、 齿状回门；lm，海马CA1的腔隙分子层；m、 齿状回分子层；o、 地层定向；p、 锥体细胞层；r、 辐射层；SOD2、超氧化物歧化酶2；星号系列标记着lm和m之间的fissura hippocampi

针对以下蛋白质的抗体在指定浓度下用于免疫细胞化学：线粒体复合物II，70 kDA亚单位（Invitrogen，Cat-number:459200；稀释度1:1000），电压依赖性阴离子通道1（VDAC1；Abcam，ab15895；稀释度1:100）；微管相关蛋白2（MAP2；Chemicon，AB5622；稀释1:500）；胶质纤维酸性蛋白（GFAP；Sigma，G3893[单克隆]；稀释度1:1000）；超氧化物歧化酶2（SOD2；Abcam，ab13533；稀释度1:1000）；细胞色素c（Cyt c；Invitrogen，456100[单克隆]；稀释度1:500）。

在含有0.5%Igepal CA-630（NP-40）、2-mM二硫苏糖醇、1%蛋白酶抑制剂混合物和0.5%Triton X-100的PBS裂解缓冲液中对野生型、mutUNG1和mutUNG-keto小鼠的海马进行均质，并使用Direct DetectTM（Millipore）测量总蛋白浓度。根据我们之前发表的文章进行蛋白质印迹(Lauritzen等人，2010年). 简而言之，将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并与抗SOD2的一级抗体（Abcam ab13533；1:5000）、VDAC1（Abam ab15895；1:1000）、sirtuin 1（SIRT1；Sigma AV32386；1:2500）、线粒体分裂1蛋白（FIS1；Sigma-HPA017430；1:1000，）和β-肌动蛋白（ActB；Milipore MAB1501R；1:5000，）孵育。将硝化纤维素膜与与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二级抗体（BIO-RAD 170–6515山羊抗兔IgG[H+L]HRP偶联物1:2000或Sigma–Aldrich A9044兔抗鼠IgG[全分子]HRP交联物1:2000）孵育1小时。值得注意的是，所有蛋白质靶点均在同一膜上形成，然后使用剥离缓冲液连续剥离膜30分钟（Thermo Scientific）。

蛋白质裂解物也用于Oxyblot（Oxyblot蛋白质氧化检测试剂盒，Millipore）和OxiSelect（OxiSelect蛋白质羰基荧光测定，Cell Biolabs）。根据制造商的说明，使用15µg蛋白质进行氧化包。简单地说，将每个样品中的30µg蛋白裂解物加入二硫苏糖醇至50 mM，在SDS中以6%的最终浓度变性，然后将样品分成2个试管，每个试管中含有15µg蛋白质。接下来，将2,4-二硝基苯肼添加到1个试管中，以衍生羰基。将衍生化对照溶液添加到每个样品的另一管中，作为阴性对照。衍生化和中和后，用SDS-PAGE分离蛋白质，转移到硝化纤维素膜（0.45µm）上，用1%BSA在PBS-T中封闭1小时，在室温下用一级抗体兔抗DNP在封闭缓冲液中以1:150的稀释度孵育1至2小时，用PBS-T洗涤，在1:300的封闭缓冲液中与山羊抗兔IgG HRP二级抗体孵育，在添加ECL（Super Signal West Dura Extended Dura Substrate，Thermo Scientific）之前在PBS-T中洗涤，并在LAS 3000图像分析仪中扫描Oxyblot，以可视化样品的氧化蛋白羰基。在oxyblot anti-ActB中，使用抗体-HRP（ab20272，Abcam）作为负荷控制。将氧印迹在PBS-T中清洗并剥离（在剥离溶液中30分钟，Thermo Scientific），在PBS-T中的5%BSA中封闭1小时，并在室温下用1:2000稀释的抗ActB-HRP培养1.5小时。

对于OxiSelect蛋白质羰基荧光测定（Cell Biolabs Inc），使用75µg来自野生型、mutUNG1和mutUNG1+KD小鼠的指示蛋白质裂解物，并根据试剂盒的产品手册进行处理。简言之，蛋白质样品中的蛋白质羰基首先与蛋白质羰基荧光酮衍生。然后，蛋白质被TCA沉淀，并通过用丙酮洗涤蛋白质颗粒来去除游离荧光团。将蛋白颗粒溶解在盐酸胍中，用Wallac平板读取器中设置的485/535-nm滤光片用荧光法测量蛋白-荧光产物的吸光度，并计算蛋白质羰基。

2.3。超微结构和包埋后免疫金电镜

该程序改编自Bergersen等人(Bergersen等人，2008年)取自9只小鼠的组织。每组三只小鼠用于免疫金后埋程序。通过腹腔注射戊巴比妥（100 mg/mL）（0.2 mL/100 g体重）麻醉小鼠，并用4%多聚甲醛和0.1%戊二醛在0.1-M磷酸钠缓冲液（PB；pH 7.4，4°C）中以5 mL/min的速度经心灌注10分钟，以进行电子显微镜检查。将大脑取出并保存在4°C的固定液中，直到进一步处理。将海马CA1区的小矩形截面（约0.5 mm×0.5 mm×1 mm）从固定的大脑中取出，并通过在0.1-M PB中以10%（30分钟）、20%（30分钟”）和30%（过夜）甘油逐渐渗透组织进行冷冻保护。然后将组织切片浸没在通用冷冻系统KF80（奥地利Reichert-Jung）中的液氮冷却至−170°C的液态丙烷中。使用预冷镊子将组织切片转移到流通室中的Reichert胶囊中。通过在−90°C的温度下将组织浸泡在无水甲醇和1.5%乙酸铀酰溶液中30小时来进行冷冻替换。30小时后，温度以每小时4°C的增量从−90°C升高到−45°C，并在以下步骤中保持在−45℃。然后将组织在无水甲醇中清洗3次，然后浸入甲醇和Lowicryl HM20（德国洛维）的混合物中，以允许树脂渗透。甲醇和Lowicryl的混合物从2:1（1小时）、1:1（一小时）和1:2（一个小时）逐步减少，直到溶液为纯Lowicrill（过夜）。然后将组织转移到充满乙醇的预冷室中，并在−45°C的紫外线（360-nm波长）下聚合24小时。通过将温度从−45°C增加到0°C，每小时增加5°C，然后在0°C下增加35小时，完成聚合。使用Reichert-Jung超薄切片机和金刚石刀切割超薄切片（90 nm），并将其安装在镍网格上（美国电子显微镜科学公司）。

格栅在室温下的湿度室中，在含有TBS和0.1%Triton X-100（TBST）的溶液中进行处理，并按规定添加添加剂。格栅在含有H的TBS中蚀刻₂哦₂（10分钟），并在0.1-M PB中冲洗。然后将网格在硼氢化钠和甘氨酸溶液（10mg硼氢化钠和37.5mg甘氨酸在10mlTBST中；10分钟）、TBST（10分钟）、封闭溶液（2%人血清白蛋白在TBST中；10分钟）中孵育，然后与抗NR2AB（1:100）、GluR1（1:100）、GluR2/3（1:50）、GABA的一级抗体一起孵育过夜_A类α₁（1:100）和GABA_A类γ₂（1:150）。格栅在TBST中冲洗，然后在TBST内孵育10分钟两次，然后在封闭溶液中孵育（10分钟）。将网格与山羊F（ab′）抗兔免疫球蛋白与10-nm胶体金（1:20）结合在封闭溶液中培养（2小时），以观察结合抗体。封闭溶液中的第二抗体在使用前以1000rpm（10分钟）旋转以沉淀任何聚集的金颗粒。然后在纯净水中冲洗格栅并干燥，然后在5%醋酸铀酰和30%柠檬酸铅中进行对比。为了进行超微结构分析，在未经免疫金处理的情况下对超薄切片进行对比。

使用Tecnai 12电子显微镜对切片进行研究，并在放大倍数为×26000和×43000时记录电子显微照片。在海马结构的选定分区随机记录清晰可见的突触的电子显微照片。兴奋性突触被鉴定为在CA1区放射层树突棘上形成不对称突触的轴突末端，而抑制性突触则被鉴定为轴突末端在CA1锥体细胞胞体上形成对称突触。对兴奋性突触记录了30到55张电子显微照片，对抑制性突触则记录了15到25张显微照片，产生了30到80个兴奋性突触子和15到30个抑制性突触头。

测量兴奋性突触后膜（确定为覆盖突触后密度）和抑制性突触后膜（确定是与抑制型神经终末膜紧密相连的核周膜部分）的长度（nm），并计算了与突触后膜相关的金粒子的密度(Bergersen等人，2008年). 金颗粒的密度是通过计算位于突触后膜中线±25 nm处的金颗粒数量来计算的，即在免疫金方法的横向分辨率范围内（约±30 nm）(Bergersen等人，2003年,2008)面积近似于突触后膜长、宽50nm的矩形。

用于免疫金标记的抗体：使用的主要抗体为兔抗NR2A/B（Chemicon，USA，AB1548）、抗GluR1（Chemcon，USB，AB1504）、抗GluR2/3（Millipore，USA）、抗GABA_A类α₁（以色列Alomone实验室，AGA-001）和抗GABA_A类γ₂（美国阿尔法诊断国际公司，GAG21-A）。使用的二级抗体是山羊F（ab′）抗兔免疫球蛋白与10-nm胶体金结合（英国生物细胞国际，英国，EM.GFAR10）。

为了进行超微结构的形态学分析，在CA1的锥体细胞层和层方向随机拍摄电子显微照片，大约每只小鼠20张。记录辐射层锥体细胞细胞质和兴奋型神经末梢细胞质中线粒体的面积（即在树突棘对面形成突触束）以及观察到线粒体的细胞质面积，计算线粒体面积的百分比（根据Delesse原理，截面面积的百分比等于组织体积的百分比）。分析中包括了电子显微照片中所有可识别的锥体细胞和兴奋型终末。对每只动物的数据进行汇总，并表示为每组3只小鼠的平均值±标准偏差（SD）或平均值±平均标准误差（SEM）。

3.2. 生酮饮食加速mutUNG1表达小鼠海马的萎缩、神经变性和反应性星形胶质细胞增生

HE染色的冠状脑切片显示，在用mtDNA损伤酶诱导2个月后，mutUNG1表达小鼠的海马萎缩(图2A). 海马萎缩是神经退行性疾病的特征，如阿尔茨海默病和衰老(Dhikav和Anand，2007年). 海马皮质神经膜的厚度，量化为从海马裂齿状回表面到CA1锥体细胞瘤层的距离（即放射层和腔隙分子层的总厚度，图2A)，显示与野生型和表达mutUNG1的小鼠相比，喂食生酮饮食的表达mutUNG1的老鼠显著减少(图2B). 门，一个特别容易受到神经病理损伤的区域(谢，1999)在生酮饮食中表达mutUNG1的小鼠中(图2A，底部框架). 此外，我们通过计算颗粒层下肢100µm范围内颗粒细胞的数量，观察到喂食生酮饮食的mutUNG1小鼠的神经元数量减少(图2A，右侧). 因此，组织体积的减少可能代表神经元数量和每个神经元体积的联合减少。

接下来，我们在诱导mutUNG1表达4个月的小鼠中，用针对神经元标记物MAP2的抗体对海马的冠状切片进行免疫标记。这表明mutUNG1表达小鼠的MAP2染色减少，而生酮饮食进一步加剧了这种情况(图2C). 量化显示，与野生型对照组相比，喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠的MAP2染色显著降低。生酮饮食进一步降低mutUNG1表达小鼠的MAP2染色(图2D). 这些数据表明，mutUNG1表达小鼠的海马出现严重的神经退行性变，在喂食生酮饮食的小鼠中加剧。星形胶质细胞在各种神经退行性疾病中起着重要作用，包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病和各种形式的痴呆症。通过反应性星形胶质细胞增生，星形胶质细胞参与了神经变性的神经炎症成分(Verkhratsky等人，2010年). 因此，我们使用星形胶质细胞标记物GFAP的免疫标记来研究不同组小鼠中星形胶质细胞的状态，已知GFAP在反应性星形胶质细胞中上调(Pekny等人，2014年). 与标准饮食的小鼠相比，在2个月的生酮饮食中表达mutUNG1的小鼠中，星形胶质细胞的训练大大增加(图2E). GFAP免疫抑制的量化显示，与标准饮食喂养的小鼠相比，生酮饮食中表达mutUNG1的小鼠显著增加(图2F). 这表明喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠出现反应性星形胶质细胞增生症。

尽管大脑出现了这些明显的变化迹象，但在17周内，mutUNG1小鼠的体重没有下降：生酮饮食下体重稳定，标准饮食下体重适度增加(补充图S1). 这表明mutUNG1表达小鼠的状况没有明显恶化，而且它们从生酮饮食中提取的能量不足以维持正常体重增加。与此处显示的表达mutUNG1的C57BL/6小鼠的体重发展（从8周龄开始）相反(补充图S1)，正常C57BL/6J小鼠（从17周龄开始）通过生酮饮食而非标准饮食增加体重(Meidenbauer等人，2014年). 这些观察结果与假设一致，即mutUNG1生成的线粒体损伤阻碍脂质代谢的程度大于阻碍碳水化合物代谢的程度。它还要求检查生酮饮食的高脂负荷是否会导致mutUNG1表达小鼠的线粒体退化。

3.3. 喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体抗氧化防御能力上调，线粒体动力学和功能受损

超氧化物阴离子是线粒体中电子传输链产生的反应性氧化物质的主要形式，SOD2（也称为Mn超氧化物歧化酶）对线粒体中这种形式的ROS的解毒很重要(Jung等人，2009年). SOD2可能被认为是防御来自电子传输链的潜在破坏性自由基的关键成员(弗林和梅洛夫，2013年). 通过免疫染色，我们研究了海马冠状切片中SOD2的存在，并检测到与野生型对照组相比，表达mutUNG1的小鼠中出现了上调，而在喂食生酮饮食的表达mutUNG1的鼠中上调最强(图3A和B). 双重免疫标记显示SOD2存在于线粒体中，因为它与神经元细胞体和神经膜中的线粒体复合物II共定位(图3C). 在mutUNG1小鼠中，尤其是在生酮饮食中，但在野生型小鼠中，线粒体样结构在主要神经元胞周堆积(图3C). 定量Western blotting也证实SOD2上调(图4A). 线粒体抗氧化防御的这种上调与喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠海马线粒体中ROS的增加相一致。有趣的是，线粒体裂变蛋白FIS1也被上调(图4B). 这种蛋白质将线粒体的健康部分与缺陷部分分离，并将应激引起的线粒体分裂与修复性线粒体降解过程结合起来(沈等，2014); 在轻度认知障碍和阿尔茨海默病中增加(Wang等人，2012年)。

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图4

生酮饮食上调mutUNG1表达小鼠的抗氧化防御（SOD2）、线粒体裂变活性（FIS1）和长寿相关脱乙酰酶（SIRT1）。（A） SOD2和线粒体标记物VDAC1在Western印迹中定量，标准化为ActB作为负载对照。在mutUNG1小鼠中，SOD2与野生型相比增加了几倍(第页<0.001），在mutUNG1小鼠中，生酮饮食使其加倍(第页= 0.03). VDAC1仅显示相同条件下的微小变化。（B） 同样，与标准饮食（SIRT1）的mutUNG1小鼠相比，mutUNG2小鼠的生酮饮食显著上调了FIS1和SIRT1第页=0.006，FIS1第页=0.007），以及与野生型小鼠（SIRT1第页=0.005，FIS1第页= 0.03); *第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01. 缩写：SOD2，超氧化物歧化酶2；VDAC1，电压依赖性阴离子通道1。

为了评估活性氧对组织的影响程度，通过定性蛋白质氧化检测试剂盒（Oxyblot，Millipore）记录蛋白质羰基化(补充图S4)以及定量（OxiSelect、Cell Biolabs）蛋白质氧化检测试剂盒。后者给出了以下羰基化值（野生型的%，平均值±SD，n=3只小鼠）：野生型100±68，mutUNG1 32±8，生酮饮食mutUNG2 40±35。因此，蛋白质羰基化的程度在样品之间差异很大（尽管每个样品的副本都很一致），生酮饮食没有明显的影响。因此，关于ROS行动，无法得出确切结论。无论是生酮饮食还是正常饮食，表达mutUNG1的小鼠明显缺乏持续增加的蛋白质羰基化，这可能意味着抗氧化防御机制可以补偿mutUN1可能导致的ROS生成增加。

然后在电子显微镜下对线粒体进行更仔细的检查，量化海马神经元细胞不同隔室中的线粒体面积（对应于线粒体体积和组织中的线粒体质量）。与喂食标准饮食的小鼠（mutUNG1或野生型或两者）相比，喂食生酮饮食的表达mutUNG1的小鼠的体细胞中的线粒体面积显著更大(图5A). 然而，在突触前终末，喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体面积明显小于喂食标准饮食的小鼠(图5B). 这些数据表明，这些小鼠受影响神经元中线粒体的分布受到干扰，表明线粒体的细胞内运输受到干扰。由于神经元细胞具有较高的局部能量需求（尤其是在突触区域），线粒体的运输和分布不足会因能量不足而干扰神经功能并导致神经变性。此外，线粒体在阿尔茨海默病的神经细胞体中积聚(卢，2009;Wang等人，2009年)。

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图5

mutUNG1表达小鼠喂食生酮饮食。（a）电子显微镜对CA1锥体细胞体线粒体面积的量化显示，喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体质量显著增加(第页=0.02）和喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠(第页=0.01），与喂食标准饮食的野生型小鼠相比。（B） 电子显微镜下CA1放射层突触前终末线粒体面积的定量显示，喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠的线粒体质量显著降低(第页=0.05），在喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠中(第页=0.03），与喂食标准饮食的野生型小鼠相比。数据表示为平均值±标准偏差*第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01. 缩写：KD，生酮饮食。

部分线粒体肿胀，电子密度低于正常值。这一比例在野生型中很小，但在mutUNG1表达中增加，并且在生酮饮食中进一步增加近3倍(图6A和B). 轻线粒体的外观与糖尿病饮食（野生型小鼠喂食20%蔗糖水7个月）和三重转基因阿尔茨海默病小鼠引起的线粒体功能障碍相似(Carvalho等人，2012年)，断言光的外观表明功能退化。当线粒体被归类为“浅色”或“深色”时，结果表明，mutUNG1表达和生酮饮食导致锥体细胞体线粒体质量增加是由于浅色线粒体增加所致(图6C). 相反，兴奋性神经末梢线粒体质量的减少是由于暗线粒体的丢失(图6D). 这些观察结果表明，从细胞体到兴奋性神经末梢的正常线粒体供应不足，胞体中异常肿胀的线粒体堆积。膨胀的线粒体在胞体周围可能非常大(图6A，6398），在某些地方，沿着同一线粒体出现亮区和暗区(图6A，6396和6400），可能是裂变聚变动力学的迹象。在神经末梢，线粒体的外观差异较小(图6B)与功能失调的线粒体逆行运输到细胞体相一致。

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图6

生酮饮食会加剧mutUNG1表达小鼠的核周堆积和线粒体肿胀。（A和B）海马CA1中锥体细胞体（A）和放射状神经层（B）的代表性电子显微照片，显示mutUNG1表达小鼠、对照组和生酮饮食（KD）的线粒体形态异常，表明线粒体功能失常和线粒体动力学崩溃。在针对每种情况分析的3只小鼠中选择了两张电子显微照片（左上角的识别号），以说明典型的形态。线粒体分为正常的暗（D）外观和肿胀的浅（L）外观。（N=细胞核。）比例尺=200 nm。（C和D）CA1锥体细胞体细胞质（C）和兴奋性突触神经末梢细胞质（D）中线粒体质量百分比（确定为组织切片中线粒体剖面的面积百分比）的量化。将每只动物（每组3只小鼠）的每种结构的线粒体和细胞质面积分别汇总，计算百分比，并将其表示为每种情况的平均值±标准误差（SEM）。在mutUNG1小鼠的体细胞中，生酮饮食（KD）与黑暗线粒体相比显著增加了光线粒体的数量(第页= 0.01). 野生型小鼠的轻线粒体明显少于喂食标准饮食的mutUNG1表达小鼠(第页=0.03），与喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠相比(第页= 0.009). 在突触前兴奋性终末，野生型小鼠的暗线粒体明显多于亮线粒体(第页=0.01），与喂食生酮饮食的mutUNG1表达小鼠相比，暗线粒体更多(第页= 0.03). 值得注意的是，生酮饮食显著增加了体细胞中轻线粒体的积累：正常饮食的mutUNG1小鼠的轻线粒体与暗线粒体的比例为2.1±0.6，而生酮饮食的mut UNG1鼠的比例为5.7±0.4（平均值±扫描电镜）(第页= 0.008); *第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01.

电子显微镜显示可能有功能和功能失调的线粒体质量的相反方向变化(图6C和D)与线粒体标记VDAC1的微小变化一致(图4A)，表明功能线粒体数量发生了微小的净变化。

从机制上讲，生酮饮食在早期衰老模型（Cockayne综合征小鼠）中拯救线粒体缺陷的能力可能取决于长寿相关组蛋白脱乙酰酶SIRT1，一种促进线粒体生物发生的中央转录因子(Scheibye-Knudsen等人，2014年). 因此，我们检测了SIRT1蛋白的表达，发现在mutUNG1表达的小鼠中，生酮饮食会强烈上调SIRT1的表达(图4B)。

3.4。生酮饮食加速mutUNG1诱导的兴奋性突触谷氨酸受体分布的变化

此前的研究表明，mutUNG1表达小鼠海马中兴奋性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）和NMDA受体密度发生了变化(Lauritzen等人，2011年a)我们用抗AMPA受体亚单位GluR1和GluR2/3以及抗NMDA受体亚单位NR2AB的抗体对海马CA1区放射层的超薄切片进行免疫金后包埋标记。对突触后膜两侧25nm内的金颗粒密度进行了量化，该密度覆盖了不对称（即兴奋型）突触的突触后密度。辐射层兴奋性突触中NR2A/B标记的典型电子显微照片如所示图7A–C.量化AMPA和NMDA受体密度(图7D–F). 辐射层中的GluR1标记似乎显示出从野生型到突变型UNG1的增加，然后在生酮饮食中突变型UNG1的标记密度降低(图7D)而GluR2/3标记显示，从野生型到mutUNG1表达的小鼠，喂食标准饮食的标记密度有所下降，而标准饮食对生酮饮食的反应没有改变或进一步加剧(图7E)，但这些变化均无统计学意义。然而，NR2A/B标记显示，3组之间的标记密度明显降低，而喂食生酮饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠的标记密度降低(第页=0.01），在野生型和mutUNG1表达小鼠之间喂食标准饮食(第页=0.03）显著不同(图7F). 由于突触之间的结果差异大于动物之间的结果，因此还通过Mann–Whitney U检验评估了统计显著性，将突触总数作为n（含酮饮食和不含酮饮食的mutUNG1分别为n=140和n=152）。这表明生酮饮食显著降低了表达mutUNG1的小鼠中的NR2A/B标记（#，第页= 0.04). 这些数据表明，用生酮饮食治疗mutUNG1表达小鼠会加速mutUNG2表达小鼠海马CA1区放射层NMDA受体的丢失。

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图7

生酮饮食加速兴奋性突触处谷氨酸受体分布的变化。（A–C）显示了（A）喂食标准饮食的野生型（B）mutUNG1-表达小鼠和（C）喂食生酮饮食的mutUNG2-表达小鼠CA1区域放射层中代表性兴奋性突触的显微照片。红色箭头表示金色颗粒（黑点），代表突触后膜内标记的NR2A/B受体亚单位（受黑色箭头限制）。比例尺=100 nm。（D–F）量化海马CA1区放射层中兴奋性AMPA受体亚单位GluR1（D）、GluR2/3（E）和NMDA受体亚单位NR2A/B（F）。计数突触后膜两侧25 nm范围内的金颗粒。GluR1和GluR2/3标记在3组小鼠之间无统计学差异。NR2A/B标记显示，喂食标准饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠之间显著减少(第页=0.03）和在喂食生酮饮食的野生型和mutUNG1表达小鼠之间(第页= 0.01). 曼·惠特尼U型测试（#）显示显著降低(第页与标准饮食（n=152个突触）相比，生酮饮食（n=140个突触，mutUNG1表达小鼠的突触NR2A/B标记值=0.04）。数据显示为每µm的平均亚单位再现粒子数²±标准偏差，n=3只/组*第页≤ 0.05; **第页≤ 0.01. 缩写：KD，生酮饮食；m、 线粒体；s、 突触后棘；t、 突触前终末；v、 突触小泡。（有关此图例中颜色参考的解释，请读者参阅本文的Web版本。）

本研究得到了挪威研究委员会、挪威卫生协会、伦德贝克基金会（丹麦）和挪威东南部地区卫生局的研究资助。细胞计数的图像是在奥斯陆大学基础医学研究所的Norbrain Slidescanning设备上获得的，该设备由挪威研究委员会资助。作者感谢这一帮助以及奥斯陆大学医院线粒体和代谢区域核心设施对蛋白质羰基分析的帮助(http://ous-research.no/mito/)。