实验-治疗-医学。2016年1月；11(1): 247–250.
局部应用钙泊三醇对寻常型银屑病皮损锌指蛋白A20和核因子-κB表达的影响
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雅娟堂
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
张汝之
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
刘晓明
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
CHUN XING XU（中新）
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
赛诚
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
齐柳
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
中国江苏省常州市苏州大学第三附属医院皮肤科，邮编：213003
收到日期：2014年6月26日；2015年3月16日验收。
摘要
本研究旨在探讨局部应用钙泊三醇对寻常型银屑病患者皮损锌指蛋白A20和核因子-κB（NF-κB）表达水平的影响。在首次使用钙泊三醇软膏后的第2、4和6周末，将临床疗效和银屑病面积及严重程度指数（PASI）评分与治疗前进行比较。采用免疫组织化学染色和免疫印迹法检测钙泊三醇治疗前后皮损中锌指蛋白A20和NF-κB的表达。第6周末，钙泊三醇的临床有效率高于第2周和第4周末（χ2分别=8.12和9.06；P<0.05）。PASI评分在第2、4和6周结束时显著下降（t=9.37、10.54和12.43；分别P<0.05、0.05和0.001）。第6周末，锌指蛋白A20和NF-κB的表达水平与治疗前相比显著降低（χ2分别为3.65和4.17；P<0.01）。开始治疗前，寻常型银屑病患者皮损中这两种蛋白的表达水平高于正常对照组。用钙泊三醇治疗6周后，银屑病皮损中这两种蛋白的表达水平显著低于治疗前（P<0.01）。因此，本研究发现，除了NF-κB在钙泊三醇治疗银屑病中的典型靶向途径外，锌指蛋白A20也可能调节银屑病的炎症反应。
关键词：银屑病、钙泊三醇、锌指蛋白A20、核因子-κB
介绍
银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，是一种以异常皮肤斑块为特征的长期自身免疫性疾病，其特征是皮肤损伤，包括红色、鳞状斑块、丘疹和斑块，通常会瘙痒。银屑病的确切病因和作用机制尚不清楚。它不完全是一种皮肤病，可能对许多器官系统产生负面影响。它们的严重程度可能会有所不同，从小到局部到全身覆盖。银屑病有五种主要类型：斑块型、点状型、反相型、脓疱型和红皮病型。先前的研究表明，银屑病患者皮损淋巴细胞和外周血中典型炎症信号核因子-κB（NF-κB）水平升高(1). 这表明NF-κB在银屑病的病理机制中起着重要的调节作用(1). 锌指蛋白A20，也称为肿瘤坏死因子（TNF）-α诱导蛋白-3（TNFAIP3），是NF-κB信号通路的负调控蛋白，抑制NF-κ的活性；TNFAIP3 mRNA的表达与银屑病的严重程度呈负相关(2). 已经证实，维生素D3衍生物钙泊三醇通过抑制NF-κB信号通路，可以有效治疗银屑病(三). 然而，银屑病中钙泊三醇和锌指蛋白A20之间的联系以及其具体机制尚不清楚。因此，本研究的目的是分析局部应用钙泊三醇治疗银屑病患者皮损后锌指蛋白A20和NF-κB表达水平的变化，以探讨锌指蛋白A2在银屑病中的可能机制以及用钙泊三醇。
材料和方法
材料
钙泊三醇软膏（0.05mg/g）购自Bright Future Pharmaceutical Laboratories Ltd.（中国香港）。兔抗人A20和NF-κB p65多克隆一级抗体来自Abcam（分类号ab16502，Cambridge，MA，USA），辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二级抗体来自Pierce Biotechnology，Inc.（分类号G-21234，Rockford，IL，USA，）。定量BCA蛋白试剂盒和电化学发光（EasyBlot ECL）显影系统也购自Pierce Biotechnology，Inc.。蛋白酶抑制剂鸡尾酒片购自Roche Diagnostics（美国印第安纳波利斯）。MaxVision公司™免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色液购自中国福州麦欣生物技术开发有限公司。立式奥林巴斯BX53显微镜来自奥林巴斯公司（日本东京）。
患者
本研究共招募了26名寻常型银屑病患者，其中男性15名，女性11名，年龄范围20-58岁（平均30.56±9.78岁），病史3-42个月（平均10.32±4.61个月）。所有患者的皮肤损伤面积均小于总体表面积的30%，并且在过去4周内未接受过系统或局部应用钙泊三醇或任何其他抗银屑病药物的治疗。在苏州大学第三附属医院（中国常州）门诊部接受色素痣切除术的18例患者（男11例，女7例）中，从距色素痣边缘0.5 cm的正常皮肤上采集对照样本。由临床医生测量红斑、鳞屑、浸润性肥大和瘙痒。患者和对照组的年龄、性别和皮损位置相匹配。本研究得到苏州大学第三附属医院伦理委员会的批准，并获得患者的知情同意。
钙三醇给药程序
患者每天两次局部服用钙三醇软膏，持续6周。银屑病面积和严重程度指数（PASI）用于评估皮肤病变的严重程度(4)在钙泊三醇治疗之前、期间和之后，用皮肤环钻取皮肤样本。
免疫组织化学染色
定期脱蜡后，用MaxVision对切片进行染色™免疫组织化学染色试剂盒，符合制造商的说明。使用的主要抗体是稀释1:200的兔抗人A20和NF-κB p65多克隆抗体，样品在37°C下培养12小时。用磷酸盐缓冲盐水清洗切片，然后在DAB染色溶液中显影切片，然后用苏木精在37°C水浴中复染2小时，用0.1%盐酸进行分化，定期脱水和玻璃化，并用中性香脂固定。在Olympus BX53显微镜下观察染色细胞的细胞质和细胞核，并结合阳性细胞百分比和染色强度的分数进行半定量分析。染色强度定义如下：0，阴性；1、淡黄色；2、棕褐色；3，深棕色。阳性细胞百分比定义如下：0，无阳性细胞；1, ≤25%; 2, ~26–50%; 3，~51-75%和；4, >75%. 染色强度与阳性细胞百分比的乘积用于评估整体染色结果：阴性（−），≤1；弱阳性（+），2或3；中间阳性（++），4或5；强阳性（+++），≥6，+到+++的结果被视为阳性表达(5,6).
蛋白质印迹分析
A20和NF-κB蛋白的表达水平通过蛋白质印迹分析进行测量，使用先前使用的技术的改进版本和甘油醛3-磷酸脱氢酶作为对照(7). 将组织样品置于含有0.1 M pH 7.5 Tris-HCl、1%NP-40和0.01%SDS的200µl裂解缓冲液中，并在添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒片后在玻璃匀浆器中充分研磨。根据制造商的说明，使用定量BCA蛋白试剂盒测量蛋白质。将提取的蛋白质在95°C下加热5分钟使其变性，在冰上冷却并装载（10µg/孔）以在10%SDS-PAGE凝胶上进行电泳。随后将它们转移到浸泡在5%脱脂牛奶中的PVDF膜（25 V，1小时）上，并在0.1%Tris缓冲盐水和Tween 20（TBS-T）阻断缓冲液（Pierce Biotechnology，Inc.）中于4°C孵育过夜。将膜在含有抗A20和NF-κB p65初级抗体的缓冲液中培养1小时（稀释度为1:1000），并用TBS-T缓冲液冲洗5次，每次冲洗3-5分钟。随后添加含有HRP标记的山羊抗兔IgG的缓冲液（1:5000稀释），并在室温下培养溶液1小时。使用TBS-T缓冲液冲洗并干燥后，根据制造商的说明，使用ECL显影系统测量蛋白质。
简单地说，将膜与ECL显影液孵育10–15分钟，然后在暗室中将膜放置在PVDF膜上。然后使用显影机（Bio-RAD ChemiBox XRS，Bio-RAD，Hercules，CA，USA）对胶片进行显影，并记录形成良好显影胶片的曝光时间，以便进一步进行该程序。在计算机上扫描显影胶片，并使用BandScan5.0分析条带(http://soft.bio1000.com/show-149.html) (8).
统计分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差，并使用SPSS软件13.0版（SPSS公司，美国伊利诺伊州芝加哥）进行分析。将组间平均值、比率和相关性与Student的t检验进行比较，χ2检验和Spearman等级相关分析。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
临床有效率与PASI评分的比较
用钙泊三醇治疗6周后，红斑、鳞屑、浸润性肥大、瘙痒和皮损面积明显改善；有效率（57.69%，15/26）明显高于4周末（38.46%，10/26）和2周末（19.23%，5/26；χ2分别=8.12和9.06；P<0.05）。与治疗前相比（10.92±1.72），钙泊三醇治疗第2周（8.86±2.42）、第4周（6.57±2.25）和第6周（4.92±1.79）末的PASI评分显著降低（t=9.37、10.54和12.43；P<0.05、0.05和0.001）。
钙泊三醇对银屑病患者皮损中A20和NF-κB表达水平的影响
免疫组织化学染色显示A20在基底细胞层和棘细胞层表达()，主要位于角质形成细胞的膜和细胞质中，呈棕褐色或深棕色。与正常皮肤组织相比，钙泊三醇治疗前银屑病皮损中A20的表达水平升高（χ2=8.34; P<0.001）。在治疗第6周结束时，与治疗前的相同皮损相比，银屑病皮损中A20的表达水平显著降低（χ2=3.65; P<0.01）。NF-κB p65在整个上皮层表达，主要在角质形成细胞的细胞质和细胞核中表达，细胞核呈深棕色染色，细胞质呈强棕褐色染色。在正常皮肤组织中，尽管细胞质部分阳性（χ2=9.15; P<0.001）。用钙泊三醇治疗6周后，与治疗前相比，银屑病皮损中NF-κB p65的表达水平显著降低（χ2=4.17; P<0.01）。
银屑病患者（A和B）用钙泊三醇治疗6周前和治疗6周后皮损中A20和核因子（NF）-κB的表达水平；（E和F）降低正常组织中A20和NF-κB的表达水平。（A、C和E）A20在基底细胞和刺细胞层中表达，主要位于角质形成细胞的膜和细胞质中，染色后呈棕褐色或深棕色（放大倍数，×200）。（B、D和F）NF-κB p65在整个上皮层表达，主要在角质形成细胞的细胞质和细胞核中表达，染色后呈深棕色（放大×200）。
钙泊三醇对银屑病患者皮损中A20和NF-κB表达水平的影响
western blot分析结果表明，治疗前银屑病患者皮损中A20和NF-κB的表达水平显著高于正常组织（分别为1:3.2和1:5.4；)，其中1是正常组织中蛋白质条带的强度，3.2和5.4是来自患者的条带的强度。然而，使用钙泊三醇治疗6周后，它们显著降低（分别为1:1.6和1:1.2；P<0.01）。
在钙泊三醇治疗前和治疗结束时，分别通过western blot分析检测3例银屑病患者皮损中A20和核因子（NF）-κB的表达。1、治疗前；钙泊三醇治疗6周末。GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
讨论
银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病。它影响全球1%至3%的人口，在病理上表现为角化过度、角化角化、棘细胞层肥大和炎症细胞侵入皮肤(9). 先前的研究表明，与正常皮肤相比，银屑病皮损中磷酸化NF-κB上调(1). 作为炎症、细胞增殖、分化和凋亡的关键调节因子，NF-κB也被认为是银屑病病理过程中的关键调控因子；银屑病相关的多种细胞、趋化因子和细胞因子依赖于NF-κB信号的激活(10). 例如，先天免疫反应蛋白toll样受体2(11)和半胱天冬酶-5(12)能够识别银屑病中病原体相关分子模式的上调，并通过NF-κB下游信号的激活促进炎症细胞因子的精细调节。
锌指蛋白A20是一种由TNFAIP3基因编码的细胞内锌指蛋白。A20基因的−54和−66 bps处有两个κB基序，其表达由NF-κB介导。A20的基础表达水平在大多数细胞中是低的；NF-κB被多种刺激激活，并转移到细胞核中，与TNFAIP3启动子的κB成分结合，增强TNFAIP2基因的转录。表达的A20诱导κB激酶γ抑制剂（也称为NF-κB必需调节剂）的破坏，通过负反馈泛素化调节NF-κ的B途径，也通过氘化调节TNF信号(13,14). 泛素化和氘化的特点使A20能够特异性调节细胞的功能状态，以确保炎症期间器官的自我保护，从而显示出双重抗炎和抗凋亡作用(15). 值得注意的是，全基因组关联研究发现，A20和ABIN-1（也称为TNFAIP-3相互作用蛋白1，TNIP1）的基因多态性不仅与银屑病的发生密切相关，还与包括英夫利昔单抗、阿达木单抗和依那西普在内的TNF抑制剂在银屑病治疗中的疗效密切相关(16,17).
由于A20具有泛素化和去泛素化功能，本研究探讨了钙泊三醇治疗寻常型银屑病患者皮损过程中A20和NF-κB的表达变化。结果表明，临床有效率为57.69%（15/26），治疗6周后PASI评分、A20和NF-κB染色均显著低于治疗前，相应蛋白表达水平降低。这些结果表明，A20通过负反馈调节NF-κB，在钙泊三醇治疗银屑病中发挥重要作用。A20在银屑病中调节凋亡相关因子或角质形成细胞信号转导的机制需要进一步研究，这可能会揭示新的治疗方案和策略。
致谢
本研究得到了江苏省自然科学研究项目青年基金（编号：BK2012153）和中国皮肤病学会光明未来制药实验室普通银屑病基金的资助。
工具书类
1Lizzul PF、Aphale A、Malaviya R、Sun Y、Masud S、Dombrovskiy V、Gottlieb AB。正常和银屑病表皮中磷酸化NF-κB/RelA的差异表达以及对依那西普治疗的NF-κ的下调。《皮肤病学杂志》。2005;124:1275–1283. doi:10.1111/j.0022-202X.2005.23735.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2蒋X，田H，樊Y，陈J，宋Y，王S，朱F，郭C，张磊，石勇。寻常型银屑病患者外周血单个核细胞中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3 mRNA的表达与疾病严重程度呈负相关。临床疫苗免疫学。2012;19:1938–1942. doi:10.1128/CVI.00500-12。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 三。Peric M、Koglin S、Dombrowski Y、Gross K、Bradac E、Büchau A、Steinmeyer A、Zügel U、Ruzicka T、Schauber J.维生素D类似物差异控制银屑病中抗菌肽/“larmin”的表达。公共科学图书馆一号。2009;4：e6340.doi:10.1371/journal.pone.0006340。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4van de Kerkhof PC。银屑病面积和严重程度指数以及评估严重程度持续混淆区域的替代方法。英国皮肤病杂志。1997年；137：661–662。doi:10.1111/j.1365-2133.1997.tb03819.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5周西德、于JP、刘杰、罗华生、陈海霞、于海刚。胃腺癌中细胞FLICE-抑制蛋白（FLIP）的过度表达。临床科学（伦敦）2004;106:397–405. doi:10.1042/CS20030238。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6Massi D、Tarantini F、Franchi A、Paglierani M、Di Serio C、Pellerito S、Leoncini G、Cirino G、Geppetti P、Santucci M。黑素细胞痣和皮肤恶性黑色素瘤中Notch受体及其配体差异表达的证据。中度病理学。2006;19:246–254. doi:10.1038/modpathol.3800585。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Wan J，Liu XM，Lei TC，Xu SZ。多巴色素互变酶突变对培养黑素细胞中黑素体成熟和抗氧化能力的影响。中华医学杂志。2009;89:1707–1710.（中文）[公共医学][谷歌学者] 9Colombo GL、Di Matteo S、Bruno G、Girolomoni G、Vena GA。钙三醇和二丙酸倍他米松治疗轻中度银屑病：软膏与凝胶制剂的成本-效果分析。临床结果研究。2012;4:261–268. doi:10.2147/CEOR。S35046。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 10Tsuruta D.NF-κB与角质形成细胞和淋巴细胞在银屑病发病机制中的联系。最近的Pat Inflamm过敏药物发现。2009;三:40–48. doi:10.2174/187221309787158399。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Begon E、Michel L、Flageul B、Beaudoin I、Jean-Louis F、Bachelez H、Dubertret L、Musette P。正常人角质形成细胞中Toll样受体（TLR）的表达、亚细胞定位和细胞因子调节：银屑病皮肤中TLR2上调。欧洲皮肤病杂志。2007;17:497–506.[公共医学][谷歌学者] 12Salskov-Iversen ML、Johansen C、Kragballe K、Iversen L.Caspase-5在银屑病皮损中的表达上调。《皮肤病学杂志》。2011;131:670–676. doi:10.1038/jid.2010.370。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Harhaj EW，Dixit VM。去泛素酶在NF-κB信号调节中的作用。细胞研究。2011;21:22–39. doi:10.1038/cr.2010.166。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Vereecke L，Beyaert R，van Loo G。泛素编辑酶A20（TNFAIP3）是免疫病理学的中央调节器。趋势免疫。2009;30:383–391. doi:10.1016/j.it.2009.05.007。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15Wertz IE，O’Rourke KM，Zhou H，Eby M等。A20的去泛素化和泛素连接酶结构域下调NF-κB信号传导。自然。2004;430:694–699. doi:10.1038/nature02794。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Nair RP、Duffin KC、Helms C、Ding J、Stuart PE、Goldgar D、Gudjonson JE、Li Y、Tejasvi T、Feng BJ等。银屑病协作关联研究：基因组扫描揭示银屑病与IL-23和NF-κB通路的关联。自然遗传学。2009;41：199–204。doi:10.1038/ng.311。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Tejasvi T、Stuart PE、Chandran V、Voorhees JJ、Gladman DD、Rahman P、Elder JT、Nair RP。TNFAIP3基因多态性与银屑病患者对TNF阻断的反应相关。《皮肤病学杂志》。2012;132:593–600. doi:10.1038/jid.2011.376。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
