脊髓刺激调节单侧脊神经损伤大鼠下行抗伤害系统的脊髓上中枢

SCS激活DRN中的5-羟色胺能神经元

脊髓神经封闭本身并不影响DRN中TPH阳性和pCREB阳性5-羟色胺能神经元的数量。然而，与幼稚大鼠和SNL大鼠相比，3h刺激后的大鼠其数量显著增加[（TPH阳性5-羟色胺能神经元：幼稚，196.1±20.4；SNL，146.6±17.6；SNL+SCS，317.9±28.1；如果[2, 31] = 17.1;对<0.0001）和（pCREB阳性5-羟色胺能神经元：幼稚，503.7±79.7；SNL，451.5±63.2；SNL+SCS，702.3±51.2；如果[2, 31] = 4.21;对 < 0.05; 图2j） ]。此外，与阳性对照组相比，受刺激大鼠pCREB阳性5-羟色胺能神经元的百分比显著增加（幼稚，77.9±2.7%；SNL，71.2±4.1%；SNL+SCS，88.9±2.4%；如果[2, 24] = 8.71;对SNL vs.SNL+SCS<0.001；图2k） ●●●●。

SCS没有激活LC中的去甲肾上腺素能神经元，但逆转了同侧上调的DβH表达

pCREB阳性细胞核的数量（每10000µm²)在LC的同侧和对侧，各组之间没有显著差异（初始：对侧，19.8±2.0；同侧，17.0±2.0；SNL：对侧（19.1±2.0）；同侧（20.3±1.4）；SNL+SCS：对侧、19.9±1.4；同侧、19.0±1.5；如果[1, 41] = 1.43;对 = 0.25; 图三s） ●●●●。然而，在SNL大鼠的LC中，DβH的同侧对侧免疫反应性比率增加。SCS 3 h后恢复到幼年大鼠的比率（幼年，0.89±0.03；SNL，1.29±0.09；SNL+SCS，0.99±0.06；对 < 0.01; 图三t） ●●●●。

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图3

具有代表性的双侧LC组织中DβH和pCREB的双重免疫染色。一–c（c）幼鼠，对侧；j个–我幼稚大鼠，同侧；d日–（f）SNL大鼠，对侧；米–o（o）SNL大鼠，同侧；克–我SNL+SCS大鼠，对侧；对–第页SNL+SCS大鼠，同侧。秒双侧LC区pCREB阳性神经元的定量总结。各组间pCREB阳性神经元数量无显著差异。t吨定量总结双侧LC区pCREB阳性神经元的同侧对侧比率和DβH免疫反应性。定量数据来自每组四只动物的三个连续切片。数据为平均值±SEM*对<0.05和**对经Tukey–Kramer检验<0.01。

脊髓上5-羟色胺能对SCS诱导的镇痛作用的贡献

先前的一项研究表明，周围神经损伤降低了反应性大鼠同侧脊髓背角的5-HT含量，SCS增加了这种含量[30]. 鞘内给药亚镇痛剂量的5-HT在对SCS无反应的动物中引发抗伤害感受反应[5]. 此外，SCS的抗伤害作用被5-HT减弱_2安培和5-HT₄受体拮抗剂[31]. 因此，我们的行为研究清楚地表明，五羟色胺与SCS的抗伤害作用有关。

电刺激脑干细胞核通过激活DAS的5-羟色胺能通路抑制脊髓伤害性反射并减弱伤害性传递[6]. 在本研究中，我们发现3-h SCS增加了TPH表达的5-羟色胺能神经元和pCREB阳性（激活）神经元的数量，以及损伤大鼠DRN中pCREB-阳性5-羟色酮能神经元的百分比。DRN位于PAG附近，由密集的5-羟色胺能神经元簇组成，在RVM投射到NRM[32，33]. 众所周知，NRM在DAS的5-羟色胺能通路中起着关键作用，因为电刺激RVM（NRM）会增强脊髓背角抑制性突触传递[10]并诱导镇痛作用[12]. 此外，周围神经损伤减弱吗啡的抗伤害作用和诱发的神经病理性疼痛行为，并降低NRM中的5-HT浓度[34]. 最近的一项研究表明，神经病理性疼痛模型大鼠RVM中的“细胞外”样神经元受到抑制，但SCS仅在反应性大鼠中激活它们和5-HT样神经元[35]. 通过本研究，我们首次发现DRN中的5-羟色胺能神经元（投射到RVM中的神经元）被SCS激活。DRN被认为是CNS中主要的5-HT来源[36]并直接连接到LC，提供强大的负输入[37]. 因此，神经病理性疼痛状态下的DRN活动可能影响DAS的5-羟色胺能和去甲肾上腺素能通路。

脊髓上去甲肾上腺素能对SCS诱导的镇痛作用的贡献

DAS的去甲肾上腺素能通路被认为对神经病理性疼痛状态下的内在镇痛作用很重要，其促进作用可能导致抗痛觉过敏，因为在外周神经损伤的大鼠中，LC中的去甲肾上腺能神经元被激活[13]. 此外，α₂-肾上腺素能激动剂增强SCS的抗伤害作用[24]. 通过这项研究，我们发现鞘内注射α₂-肾上腺素能受体拮抗剂完全消除了SCS的镇痛作用。此外，我们发现，尽管SNL大鼠的LC神经元未被SCS激活，但损伤大鼠同侧LC中DβH的免疫反应性显著增加，但被3-H SCS恢复。类似地，如果没有应用无害的机械刺激，单侧神经损伤不会影响LC中Fos阳性神经元的数量[38]. 神经病动物模型中LC区的免疫组织化学变化存在争议。以往的研究表明，单侧神经损伤可引起LC神经元的双侧激活或兴奋性[13，38，39]; 然而，另一项研究表明，坐骨神经损伤同侧LC中DβH阳性神经元增多[14]. 尽管LC中的去甲肾上腺素能神经元投射到中枢神经系统的几乎所有区域，但LC仅从DRN的纤维接收很少的输入[37]. LC中去甲肾上腺素能神经元的双侧激活可以通过DRN向LC两侧的投射来解释[37，40]. 我们无法确定为什么DβH免疫反应性的增加是同侧的。然而，三组间LC中DβH表达比率的差异相对较小，鞘内注射不含SCS的idazoxan不会改变同侧PWT。行为实验的结果与慢性疼痛不会引起LC神经元的紧张活动和脊髓中去甲肾上腺素的分泌的证据一致[38，40，41]. 因此，DβH在同侧LC中的表达变化可能只对DAS的去甲肾上腺素能途径有轻微影响。然而，还需要进一步研究来阐明LC激活在调节去甲肾上腺素能抗伤害通路中的作用。

最近，Song等人[29]已明确表明，尽管SCS反应性神经病理性疼痛模型大鼠的LC神经元兴奋，但LC激活在SCS的抗伤害作用中仅起到次要作用。我们的研究结果同样表明，去甲肾上腺素能通路可能起次要作用。

SNL和植入程序

如前所述，结扎左侧L5脊神经[47]经过一些修改。简而言之，用异氟醚（1.5-2%）在氧气中麻醉动物，并去除左侧L6横突。左侧L5脊神经被确认，并使用4-0丝线紧密结扎。伤口随后闭合。

一周后，如前所述，植入SCS电极和鞘内导管[48]. 简而言之，用异氟醚麻醉的动物被置于仰卧位。剪掉背部毛发后，在腰部（L2–5）做一个2–3 cm的中线皮肤切口，并直截了当地解剖椎肌。在双目放大下，切除L3椎体突起，将L4椎体缩回，露出L2-3和L3-4椎间隙，并小心切割相关的椎间韧带。将银电极从L2–3椎间隙插入头部2–2.5 cm的硬膜外间隙，使其尖端位于T11–13区域。另一个银电极从L3-4椎间隙尾侧1厘米处插入。这些硬膜外电极（直径0.2 mm）被制成球形尖端，并由管状聚乙烯管（外径0.61 mm；PE-10，Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes.NJ）绝缘。

同时，在将银电极插入硬膜外腔的同一椎间隙中插入鞘内导管（PE-10）。将导尿管头伸入腰蛛网膜下腔15 mm，使其尖端位于腰膨大附近[49]. 然后，将电极和鞘内导管皮下穿通，并在颈部外穿。鞘内导管的死腔容积为15μL。

肌肉、筋膜和皮肤用3-0层丝线缝合。试验前，动物通常可以恢复至少5天。麻醉恢复后出现运动无力或麻痹症状的患者被安乐死。通过对采集脊髓的组织病理学分析，我们确认电极尖端位于T10–11水平的脊髓背表面和L4–5水平的相同表面左侧。

行为分析

行为评估在标准化条件下在单独的安静房间进行。在每个测试日，在测试开始前1小时，将大鼠带到安静的房间，让它们适应环境。使用动态足底美学仪（Ugo Basile，Comerio，意大利）评估机械超敏反应，这是一种自动von Frey设备[50–52].

为了测量后爪的机械阈值，将动物放在带有金属丝网地板的塑料笼中，并在每次测试之前让其适应15分钟。用塑料丝（直径0.5 mm）在两只后爪的足底表面中心施加越来越大的力，从而引发爪子舔的反应。施加的力最初低于检测阈值，然后在20 s内以1 g的增量从1 g增加到50 g，最后在50 g下保持10 s。增加速度为2.5 g/s。PWT被定义为施加的力，以引起后爪的反射去除。每隔1分钟计算五次测量的平均值，以确定每侧的PWT。

脊髓刺激（SCS）

基线PWT测量后，通过带导线的隔离器（SS-201J，Nihon Kohden）将植入的电极连接到电刺激器（SEN-3301，日本东京Nihon Kohden）上，使动物在笼子内自由移动。采用频率为50 Hz、脉冲宽度为0.2 ms的单极电刺激。振幅被单独确定为产生下躯干肌肉轻微抽搐或腿部伸展（即运动阈值）所需强度的70-80%，如之前的研究所报告的那样[24，48]. 我们将反应定义为1h SCS后同侧PWT增加（>130%初始值）。

鞘内给药

我们使用在1h SCS后表现出机械性超敏反应减弱的大鼠进行后续实验。在获得1h PWT测量结果后，我们给药30μg马来酸甲酯（5-HT₁-和5-HT₂-受体拮抗剂），盐酸依达唑嗪（α₂-肾上腺素能受体拮抗剂），或使用Hamilton注射器通过鞘内导管（总体积=10μL）注入生理盐水，然后用10μL生理盐水冲洗导管。在给药后1小时和2小时重新测量PWT（图1). 未经刺激的SNL动物作为阳性对照。药物在使用前溶解在盐水中并保持在−80°C。他们的剂量是根据之前的报告确定的[53].

免疫组织化学

用戊巴比妥钠（50 mg/kg）深度麻醉SCS后3小时表现出PWT增加的动物、未刺激SNL动物和幼年大鼠（阴性对照）（每组4只），并用肝素化磷酸盐缓冲盐水（PBS）心内灌注，然后是4%的冷缓冲多聚甲醛和2%的饱和苦味酸溶液。快速取出大脑，将其固定在4°C的相同固定液中过夜，并在4°C的30%蔗糖溶液中冷冻，直至其完全下沉。髓，包含DRN（前角7.30–7.80 mm[54])和LC（bregma 9.68–10.04 mm[54])，被切成20微米的切片，并安装在Frontier涂层玻璃载玻片上（日本大阪松下玻璃）。然后，在含有DRN的切片或小鼠抗DβH（1:400；EMD Millipore）和抗pCREB（1:1000；Upstate，EMD Milliepore，Billerica，MA）的一级抗体（羊抗TPH（1:40；西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）和兔抗133 pCREP（1:1000）的混合物中培养切片过夜用于含有LC-的切片。使用了以下二级抗体：TPH用驴抗羊免疫球蛋白G偶联异硫氰酸荧光素（FITC）（1:400），DβH用驴抗体偶联DyLight 488（1:400。

在配备四甲基罗丹明（TRITC）和FITC荧光波长激发滤光片的一体式表观荧光显微镜（Biorevo BZ-9000，Keyence Corporation，Osaka，Japan）下观察免疫荧光反应。分别由TPH-和DβH-阳性神经元簇识别的含DRN-和LC-的切片的图像，使用包含电荷耦合装置的数码相机拍摄，并连接到外荧光显微镜系统。在二值化后，从每只大鼠的DRN和LC的嘴到尾80µm范围内选择两到三个切片，用ImageJ软件（马萨诸塞州贝塞斯达国立卫生研究院）进行分析。TRITC染色的卵圆形颗粒被认为是pCREB阳性核。所有FITC-染色的细胞体，无论是否有染色的细胞核，都被认为是TPH阳性神经元。pCREB阳性5-羟色胺能神经元的百分比是根据目测计数的TPH阳性神经元总数计算出来的。此外，在所选的LC切片中，对DβH阳性神经元的平均荧光强度（每像素0到255个单位）和pCREB阳性细胞核的数量进行了量化。然后计算同侧与对侧DβH的免疫反应比率。两名研究人员（KS和AY）以盲法进行免疫组化分析。

蛋白质印迹分析

SCS 3小时后表现出PWT增加的动物（n=6），未刺激SNL动物（n=6）用戊巴比妥钠（50 mg/kg）深度麻醉，并用肝素化冷PBS心内灌注。脊髓L4-5段被迅速切除并分成四部分（左背侧、左腹侧、右背侧和右腹侧）。立即将背部分别冷冻在液氮中，并在使用前储存在−80°C下。用冰镇溶解缓冲液（10-mM羟乙基哌嗪乙烷磺酸、1.0-mM乙二胺四乙酸、2.0-mM乙二醇四乙酸、0.5-mM二硫苏糖醇、0.1-mM苯甲烷磺酰基氟化物、10-mg/L亮氨酸蛋白酶和100-nM微囊藻毒素）均质冷冻样品，并在97°C下超声和煮沸5分钟。

使用BCA试剂盒（皮尔斯，赛默飞世尔科学公司，伊利诺伊州罗克福德）测定蛋白质浓度。蛋白质样品（背部10μg/孔，每个大脑5μg/井）在十二烷基硫酸钠存在下进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电泳转移至聚偏二氟乙烯膜。在室温下，将膜在封闭溶液中孵育，5%脱脂牛奶溶解在含有0.1%吐温-20（pH 7.4）的Tris缓冲盐水中，孵育1h。然后将其与抗TPH抗体（1:2000；Sigma-Aldrich）、抗DβH抗体（1:1000；Cell Signaling Technology，Danvers，MA）和抗β-肌动蛋白单克隆抗体（1:20000，Sigma-Aldrich）在4°C的封闭溶液中孵育过夜。随后，用含有0.1%吐温-20的Tris-buffered生理盐水清洗，并在室温下用封闭溶液在驴抗兔和羊抗鼠辣根过氧化物酶（均为1:20000；GE Healthcare，Piscataway，NJ）中培养1小时。根据制造商的说明，使用ECL Advance试剂（GE Healthcare）进行免疫检测，并使用LAS3000和Multi-Gauge软件（日本东京富士胶片公司）通过密度测定进行量化。对于每个波段，首先减去空白值。凝胶之间的差异通过将结果表示为与膜间对照的比率来控制。数据计算为每种强度与膜间对照平均值的比值。

TT和YK设计了实验；HS协助实验设计；TT、YK和AK进行了行为实验；KS、MT和KF进行组织学和免疫组织化学分析；KS和YN进行western blot分析；YK进行了统计分析；TT和YK撰写了手稿；TG负责协调研究并为撰写手稿做出贡献。所有作者阅读并批准了最终手稿。