美国国家科学院院刊。2014年7月22日；111(29): 10580–10585.
来自封面
F的c-亚单位环内的解耦通道1F类O（运行）ATP合成酶是线粒体通透性转换孔
，a、，b条 ，c（c） ，一 ，一 ，一 ，一 ，一 ，一 ，c（c） ，d日 ，c、，e中，（f）和a、，1
Kambiz N.Alavian公司
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
b条英国伦敦W12 0NN帝国理工学院医学系脑科学部；
艾玛·拉兹罗夫
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
西尔维奥·萨切蒂
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
汉娜公园
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
帕维尔·利兹涅斯基
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
李红梅
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
帕纳·纳比利
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
凯瑟琳·霍肯史密斯
以下部门c（c）儿科（心脏病学），
莫文·格雷厄姆
d日耶鲁大学细胞生物学系，康涅狄格州纽黑文，06520-8002
小乔治·A·波特。
以下部门c（c）儿科（心脏病学），
e（电子）内科学（Aab心血管研究所），以及
（f）罗切斯特大学医学中心药理学和生理学，罗切斯特，NY，14642；和
伊丽莎白·乔纳斯
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
一耶鲁大学内科内分泌科，康涅狄格州纽黑文，06520-8020；
b条英国伦敦W12 0NN帝国理工学院医学系脑科学部；
以下部门c（c）儿科（心脏病学），
e（电子）内科学（Aab心血管研究所），以及
（f）药理学和生理学，罗切斯特大学医学中心，纽约州罗切斯特，14642；和
d日耶鲁大学细胞生物学系，康涅狄格州纽黑文，06520-8002
中国北京国家生物科学研究所王晓东主编，2014年5月27日批准（2014年1月30日收到审查）
作者贡献：K.N.A.、G.B.、G.A.P.和E.A.J.设计的研究；K.N.A.、G.B.、E.L.、S.S.、H.-A.P.、P.L.、H.L.、P.N.、K.H.、M.G.、G.A.P.和E.A.J.进行了研究；K.N.A.、G.B.、S.S.、H.-A.P.、H.L.、G.A.P.和E.A.J.分析数据；K.N.A.、G.A.P.和E.A.J.撰写了这篇论文。
- 补充资料
支持信息
GUID:BC763BE1-2501-4761-AE30-216A037D3EF8
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重要性
应激性细胞事件导致细胞内钙2+调节失调、线粒体内膜电位快速丧失[通透性转换（PT）]、代谢功能障碍和死亡。快速钙2+-诱导解偶联是细胞死亡的重要调控因子之一。我们证明了F的c-亚基环1F类O（运行）ATP合成酶形成电压敏感通道，持续开放导致PT和细胞死亡。相反，c-亚单位通道关闭促进细胞存活并提高细胞代谢效率。因此，c-亚单位通道战略性地位于细胞能量生成复合物的中心，以调节代谢效率并协调死亡的快速发生，因此是线粒体PT孔的候选者。
关键词：代谢、坏死、凋亡、离子通道、兴奋毒性
摘要
线粒体对内线粒体膜（IMM）的通透性保持严格的调节，以维持ATP的生成。应激事件导致细胞钙（Ca2+)IMM电位迅速丧失，即通透性转换（PT），导致渗透性改变、代谢功能障碍和细胞死亡。线粒体PT孔（mPTP）的分子特性以前未知。我们证明了F的纯化重组c-亚基环O（运行）F的1F类O（运行）ATP合成酶形成一个电压敏感通道，其持续开放导致细胞内IMM快速且不受控制的去极化。延长高基质钙2+扩大c-亚单位环，并将其从ATP合成酶F中亲环素D/环孢霉素A结合位点中分离出来1，为mPTP打开提供了一种机制。相反，重组F1外源性应用于纯化的c亚基的β亚基提高了孔闭合的概率。c-亚单位耗竭减弱Ca2+-诱导IMM去极化并抑制Ca2+活性氧诱导细胞死亡，而增加c亚单位的表达或单通道电导对死亡敏感。我们得出结论，高度调节的c亚单位泄漏通道是mPTP的候选。除了细胞死亡之外，这些发现还意味着增加健康细胞中c亚单位通道关闭的概率将增强IMM耦合并提高细胞代谢效率。
线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP。线粒体内膜（IMM）中的泄漏电流通过将电子传输系统与ATP合成酶活性解耦联来降低这一过程的效率。许多研究已经描述了IMM孔[线粒体通透性转换孔（mPTP）]的生物物理和药理学特征，该孔负责IMM的快速解偶联，导致线粒体基质在细胞钙环境中的渗透位移2+调节失调与腺嘌呤核苷酸耗竭(1–4). 一些研究表明，这种解偶联在生理事件中也起作用，mPTP可能暂时作为Ca发挥作用2+-释放通道(5–7). 尽管已经提出了mPTP的分子特性模型(8)腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）和电压依赖性阴离子通道（VDAC）等假定成分的缺失未能阻止快速去极化(9). 同时，mPTP的非成孔调节成分，如亲环素D（CypD），已经被广泛研究(10，11).
我们最近报道了一种对ATP/ADP和Bcl-2家族成员B细胞淋巴瘤（Bcl-x）敏感的漏电导L（左）)在富含ATP合成酶的孤立亚线粒体囊泡（SMV）的膜内(12，13). 我们证明了Bcl-x的结合L（左）F以内1到ATP合成酶的β亚单位，表明负责泄漏电导的通道位于膜部分（ATP合成素FO（运行）)还有Bcl-xL（左）绑定到F1可能会堵住漏洞。最近的研究也支持mPTP位于ATP合成酶的多蛋白-脂质复合物中的观点(10，14，15); 然而，对这些文章的综述证实，负责毛孔形成的特定蛋白质仍未确定(16). 我们现在描述了哺乳动物ATP合成酶的纯化c-亚单位，当重组为脂质体时，形成对腺嘌呤核苷酸敏感的电压依赖性通道，重组F1β亚单位蛋白和抗c亚单位抗体。在细胞中，c-亚单位的荧光标记检测到环对钙的反应而打开和关闭2+和mPTP抑制剂环孢霉素A（CsA）。通过特异性突变使C亚基环结构永久性松动，从而增加C亚基单通道电导，促进细胞死亡。相反，细胞中c-亚单位的缺失抑制钙2+-诱导IMM去极化和细胞死亡。最后，我们证明了高基质Ca2+从F中的ATP合成酶中分离c-亚基环1，为PT提供了一种机制。
结果
纯化后的C亚单位缺乏调节成分，在重组为脂质体时形成电压敏感电导。
ATP合成酶包含一个外源性催化域（F1)和膜结合部分（FO（运行）)由中心柄和外围定子连接。质子通过F的亚基c和a连接处的易位体沿着其电化学梯度运动O（运行）提供F的α和β亚单位所使用的能量1合成ATP(17). 八聚体c-亚基形成一个中心孔状结构，可以想象，当暴露时，该结构可以解偶联。为了验证这一假设，我们分析了c-亚单位在IMM解偶联中的作用。哺乳动物的c亚单位编码在三个独立的核基因上(ATP5G1型到-3). 针对常见序列识别出的8-kDa和15-kDa条带的抗体(图S1A类). 从HEK 293T细胞中纯化ATP5G1编码的myc/FLAG标记的c亚单位(图S1B类). 在没有变性的情况下，在～250 kDa时检测到纯化的c亚单位，表明存在低聚物(图S1C类)（有关内源性低聚物，请参见); 以前已经观察到类似的含c亚单位的复合物(18). 针对ATP5G或ATP合酶（F1结合）免疫捕获抗体免疫沉淀ATP合成酶的多亚单位(图S2A类)表明抗体在F内找到表位1和FO（运行）在组装的ATP合酶复合体中。
ATP合成酶的结构重排揭示了c-亚单位孔。(A类)使用针对哺乳动物myc/FLAG标记的人类ATP合成酶亚基蛋白的抗体进行免疫印迹（代表3个印迹的印迹）。(B类和C类)纯化c亚单位的代表性蛋白脂质体膜片钳记录。添加纯化的γ、δ、ε或β亚单位（50 ng/µL记录溶液）（箭头）。(C类，下部)斜坡电压记录。(D类)NP公司O（运行）添加指示ATP合酶亚基前后的比率(n个= 5, **P（P）= 0.0036). (E类和F类)钙2+-200 nM CsA或0.5 mM ADP中WT心脏或CypD KO线粒体的诱导IMM肿胀试验。绘制的是Ca前后540 nm处的吸光度比（A）2+(n个≥3个）。(G公司)来自WT和CypD KO线粒体裂解物的ATP合成酶IP后上清液和洗脱液的免疫印迹（ATP5G-com或ATP5G1），如E类和F类（代表≥4个斑点）。(小时)凝胶中15-kDa带和120+250kDa低聚物带密度的量化G公司(n个所有波段≥3*P（P）=与对照组相比，120+250 kDa时为0.0331，15 kDa为0.0417）。(我)ATP合酶F对PT（c-亚单位）孔的调节示意图1. (左侧)CypD和Ca2+通过释放F使c亚单位环膨胀并打开孔隙1. (赖特)CsA、Bcl-xL（左）ADP/ATP通过将β-亚基定位在其口腔上方来封闭c亚基孔。
纯化的c亚单位以其天然形式重组为脂质体。免疫印迹证实纯化的c亚单位洗脱中不存在调节部分，包括ANT、VDAC1、CypD、ATP合酶b亚单位和寡霉素敏感性赋予蛋白（OSCP）(图S1C类和E类). 通过免疫标记将c亚单位定位于脂质体(图S1D类). 从蛋白脂质体上切下的补丁记录显示出一个具有显著亚电导状态的多电导通道(). 空脂质体记录显示无活性(n个=3）。贴片含有～100-pS电导，作为多电导活性的亚电导状态，峰值电导高达～1.5–2 nS()类似于之前描述的线粒体多电导通道（MCC）的活性(11，19–21). 与MCC一致的是，通道活性呈负整流(和图S3C类). 在100 mV以上的非常正的贴片吸管电位下，也一致观察到～1.5 nS和～2 nS的通道电导().
ATP合成酶c亚基环形成一个大电导离子通道。(A类，上部)切除的蛋白质脂质体斑贴灯记录纯化的c亚单位蛋白。(左侧)振幅直方图显示的电导率为～227 pS、1450 pS和1680 pS；C、 封闭；O1–O3，打开。(赖特)贴片去极化后随机采集的六个记录的振幅直方图。来自左侧以红色表示。C为闭合状态；O1–O3表示电导为～100–300 pS、～1500 pS和～1800–2000 pS时的开路电平。图中也显示了～500–750 pS的电导电平，但未指定(B类)在1 mM ATP前后从−100 mV到+100 mV的连续斜坡电压钳期间，代表性（～600 pS）切除的蛋白脂质体斑贴灯记录纯化的c亚单位蛋白。(C类)暴露于抗pan-ATP5G1/2/3（c-Sub抗体）、对照抗体（IgG）或2µM CsA前后纯化的c亚单位蛋白的典型斑贴记录。(D类)抗ATP5G1/2/3暴露前后电导峰值的量化(n个= 10, **P（P）=0.0022），对照IgG(n个=3），100µM Ca2+(n个=3），或2µM CsA(n个= 4). (E类)在添加（按顺序）重组CypD蛋白（最终5µg/mL）、100µM CaCl之前和之后，将纯化的ATP合成酶重组成脂质体的代表性斑贴记录2和5µM CsA。(F类)中表示的录制的组数据E类(n个= 12; *P（P）= 0.0228, **P（P）= 0.00391). 红色虚线表示通道活动的关闭状态。
这种通道电流不太可能代表质子通过ATP合成酶质子转运体的运动，因为它们的电导很高，缺乏离子选择性，并且脂质体记录中没有α亚单位。例如，通道对钠的选择性只有1.5倍+/K（K）+(图S3). 此外，尽管我们不能用电生理学方法专门测量质子电导，但质子不太可能被排除在如此大的非选择性通道之外。总之，非选择性的高电导c子单元通道可以传导使IMM解耦的泄漏电流。
在之前的一项研究中，我们通过从天然大鼠脑中分离的贴片箝位SMV直接测量IMM中的大泄漏电导(12). 在这里，我们证明ATP通过EC阻止这种活动50约50µM(图S4A类和B类). 然而，用纯化的重组c-亚单位进行的平行实验表明，与EC相比，对ATP的敏感性降低50660µM(和图S4C类–F类). 这些数据表明，一些ATP敏感性直接定位于c亚单位本身，并且在部分（经尿素处理的SMV）或完整的c亚单位纯化过程中，其他ATP结合位点被去除。纯化的c亚单位通道活性同样被ATP、ADP或AMP减弱(图S4F类)因此，ATP合成酶对ATP的水解作用不太可能被抑制。因为F内似乎有多个ATP抑制位点1F类O（运行）ATP合成酶，我们使用了一种更特异的纯化c亚单位通道抑制剂，即抗pan-c亚单位抗体，它可以快速有效地减弱纯化c亚基的电导(). 我们发现暴露于钙后SMV中的抗体介导的衰减类似2+已知的mPTP激活剂(). 这些数据有力地支持了c-亚单位形成钙孔的观点2+-敏感mPTP。
线粒体中存在c亚单位大电导离子通道(A类)代表性（～1900 pS，上部; ∼1000 pS，下部)接触100µM Ca前后的SMV贴片灯记录2+其次是抗ATP5G1/2/3（C-sub抗体）或对照抗体（IgG）。条形图显示了峰值电导的量化(上部，N个= 8, *P（P）= 0.0194, **P（P）= 0.0033;下部，N个= 5, **P（P）= 0.0256). (B类)线粒体、SMV和经尿素处理的SMV的SDS免疫印迹。C-sub ab连接至ATP5G1。(C类)钙治疗前后全生命线粒体、SMV和尿素暴露SMV的典型斑贴灯记录2+然后是环孢素A和ATP(底部跟踪）。(D类)峰值电导对钙的响应2+、环孢素A和ATP(n个=4个Mito，5个SMV，10个经尿素处理的SMV，5个ATP*P（P）= 0.0045, **P（P）< 0.0001). 红色虚线表示闭合（0 pA）。
包括我们的ATP浓度依赖性数据在内的许多证据表明，纯化的c亚单位通道缺乏可能控制其体内活性的调节成分。mPTP不仅对高水平的心肌内钙敏感2+，但也对蛋白质CypD(22，23)可能通过其与F上的OSCP绑定1定子和CsA，这可能会干扰CypD–OSCP的相互作用(10，15，21). 我们对三种制剂进行了电生理学研究，以研究以下内容：(我)缺乏CypD和OSCP的纯化重组c亚单位制剂(图S1C类和E类)重组成蛋白质脂质体(ii（ii）)缺乏CypD的纯化ATP合成酶单体(图S2B类和C类)重组成蛋白质脂质体，以及(三)含有内源性CypD和OSCP的线粒体和SMV(). 与钙的缺乏保持一致2+和CsA敏感位点存在于纯化的c-亚单位环中，Ca2+nor CsA对纯化的c亚单位的通道活性有影响(). 纯化的单体ATP合成酶具有F1-相关酶活性，含有OSCP但缺乏CypD(图S2B类和C类) (15). 当重组成脂质体时，单体ATP合成酶通过添加重组CypD蛋白（无论Ca与否）而表现出罕见的通道活性显著增强2+当时在场；CsA很容易抑制通道活性(). 最后，我们记录了整个线粒体、SMV和SMV暴露于尿素变性和去除膜外蛋白（包括F1OSCP、β亚基和CypD等成分(). 线粒体和SMV的通道活性显示出强大的Ca2+尽管1 mM ATP仍能快速抑制通道活性，但尿暴露SMV完全没有CsA反应性(). 这些记录证实了Ca2+CypD和CsA通过结合膜外蛋白位点（可能在ATP合成酶的OSCP亚单位内）调节IMM传导，并解释为什么Ca2+CsA对纯化的c-亚单位通道的电导几乎没有影响。
C-亚单位泄漏通道在进入打开和关闭状态时发生可测量的构象变化。
确定ATP合成酶内的c亚单位环结构是否对CsA和Ca产生反应2+在细胞中，我们采用了一种荧光方法，即二分四胱氨酸显示（FlAsh），它可以检测活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，并将蛋白质定位到亚细胞隔室(24–26). 当放置在蛋白质上的两对半胱氨酸接近时，它们会与FlAsh染料紧密结合，增加其荧光强度(). 我们在单独的实验中表达了两个结构体，每个结构体包含插入ATP5G1（C sub 1或C sub 2）的半胱氨酸对(). 转染后48小时，FlAsh荧光在与细胞内线粒体共定位的点处高水平明显()这表明单个c亚单位蛋白与预期的相对接近。然而，在缺乏半胱氨酸结合伙伴或在OSCP上转染表达单对半胱氨酸的构建物后，只观察到背景荧光(). 然后将标本暴露于载体或环孢素A，然后用离子霉素增加细胞内和基质钙2+(). 在表达C sub 1-和C sub 2-的细胞中，预先暴露于CsA的细胞中FlAsh荧光显著升高，这表明通道抑制使单个FlAsh-标记的C亚单位更紧密地结合在一起，从而增加了C亚单位环的堆积。离子霉素降低了FlAsh荧光，这是CsA阻止的，这表明孔的开放放松了c亚基环的堆积。在OSCP上插入两对半胱氨酸的细胞中，FlAsh荧光如预期的那样高，但对离子霉素或CsA没有反应()表明两个半胱氨酸对在添加Ca时没有相对运动2+当两者都位于单体OSCP上时。总之，这些研究表明，c亚单位通道的激活或抑制会导致c亚单位环结构的变化，这些变化与c亚单位通道电导的变化有关。
c亚基环调节钙2+-诱导IMM解偶联。(A类)打开和关闭位置的两个相邻c-亚单位单体的半胱氨酸对标记示意图。当半胱氨酸对一起移动时，FlAsh和随后的荧光发生结合。(B类)HEK 293T细胞中具有代表性的TMRE、FlAsh荧光和合并图像。(C类)转染后72 h HEK 293T细胞中FlAsh荧光强度的时间进程（CC-CC表示两个半胱氨酸对，CC表示一个半胱胱氨酸对）。细胞用载体或2µM CsA预处理1 h，并暴露于2µM离子霉素（离子，箭头所示）。(D类)FlAsh荧光强度的分组数据(n个=12个数据点，每个条件下≥3个独立实验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.0001，N.S.，不显著）。(E类)将1µM（用于CsA实验）或4µM离子霉素添加到用5µM CsA处理的HEK 293T细胞或用指示的shRNA构建物转染的细胞（Scr，加扰）之前和之后钙黄绿素荧光强度的时间进程。(F类)中实验的组数据E类添加离子霉素后20分钟(n个=3个细胞、16个细胞、13个细胞、18个细胞用于CsA（1个培养基）、打乱、ATP5G3和ATP5G1 shRNA（三个独立培养基）(***P（P）< 0.0001). （比例尺：10μm）
C-子机组消耗可防止PT。
钙2+-通过检测IMM渗透性和电势（Δψ米) (10，11，27). 为了确定c-亚单位环是否是完整细胞快速解偶联所必需的，我们通过shRNA耗尽HEK 293T细胞的c-亚基蛋白()然后使用钙黄绿素/钴淬火测试细胞的IMM渗透性(7). 在对照细胞中加入离子霉素后，线粒体钙黄绿素荧光迅速下降，时间进程与FlAsh荧光的变化相关（比较); 钙黄绿素荧光的下降是通过CsA或c-亚单位异构体ATP5G1或ATP5G3的耗尽来阻止的(). 接下来，我们测量了Δψ米电压依赖性指标JC-1和TMRE可降低IMM去极化后线粒体荧光强度(27). 与打乱shRNA-转染对照组相比，转染c-亚单位shRNA的细胞（糖酵解培养基上）具有相似的起始Δψ米(图S5A类)，胞浆ATP水平(图S5B类)和细胞存活率（MTT分析，n个=每种情况下24口井）。离子霉素降低Δψ米在未转染的对照细胞和那些转染干扰shRNA但未经2µM CsA处理或ATP5G1缺失的细胞中(图S5C类和D类). 总之，这些数据表明，c-亚单位对于PT诱导的IMM快速通透性和膜去极化是必要的。
改变c-亚单位表达或包装可调节IMM的电导和对兴奋毒性和ROS介导的细胞死亡的敏感性。(A类)使用所示抗体进行免疫印迹。(B类和C类)100µM谷氨酸或20µM h暴露30 min后24 h培养海马神经元碘化丙啶（PI）染色的图像和组数据2O（运行）2含或不含0.5µM CsA(n个≥3个独立培养物，每种条件的56-65张显微照片；G1、ATP5G1；G3、ATP5G3）。(D类)WT和M4 c子单元环的示意图。M4突变体的通道电导增加表明，由于Gly-Val突变，堆积减少，中心孔变大。(E类)用膜片钳记录用WT或M4c亚单位重建的脂质体的代表性。(F类)用指示蛋白质（WT，n个= 38; M1、，n个= 7; 平方米，n个= 17; 立方米，n个=7 M4，n个= 22; ***P（P）<0.0001（WT vs.M1–M4）。(G公司)归一化NPO（运行）在向含有指示蛋白质（WT，n个= 21; M1、，n个= 3; 平方米，n个= 6; 立方米，n个= 5; M4、，n个= 8; ***P（P）=0.0009比较WT和M4 ATP响应，NPO（运行），通道数乘以每个通道打开的概率）。(小时)使用所示抗体进行免疫印迹。用抗c-亚单位抗体标记的最上面的条带代表myc/FLAG标记的过表达蛋白。较低的条带丢失了一个标记（blot代表>5个blot）。(我和J型)比重核百分比(我)和细胞存活（MTT分析）(J型)，在表达指示结构的HEK 293T细胞中测量(n个=使用三个盖玻片进行两次实验，每个条件下每个盖玻片有两个字段(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.0001). 在切换到含半乳糖、无葡萄糖培养基24小时后进行测量。(K（K）和L（左）)暴露于100µM谷氨酸或20µM h谷氨酸30分钟后18小时海马神经元PI染色的图像和组数据2O（运行）2带车辆或0.5µM CsA(n个=3个独立培养物，每种条件下的38–53张显微照片。（比例尺：B类，C类，K（K）、和L（左），20微米）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001, ****P（P）< 0.0001.
C-亚单位的消耗减弱，而突变大电导C-亚单位的过度表达加剧，细胞死亡。
因为PT是某些形式细胞死亡的标志，尤其是在脑和心脏缺血后(28，29)，我们测试了钙是否需要c亚单位2+-和H2O（运行）2-诱发死亡。我们发现，如前所述，环孢素A减弱了H2O（运行）2-或谷氨酸诱导培养海马神经元死亡(). 此外，尽管shRNA对ATP5G1或ATP5G3的缺失并不影响Bax或ANT的蛋白水平()，它衰减了H2O（运行）2-或与环孢素a相似程度的谷氨酸诱导死亡(). 这些研究表明，c-亚单位表达是兴奋毒性和活性氧（ROS）相关细胞死亡所必需的。
为了进一步证明c-亚基环创造了一个解偶联孔，我们在c-亚单位的第一个（N末端）α-螺旋区内突变了四个高度保守的甘氨酸(图S6). 这些甘氨酸可能负责环结构中c亚单位分子的紧密堆积，并控制膜偶联和OXPHOS() (30–32). 为了减少这种紧密堆积，我们制作了四个含有甘氨酸-缬氨酸突变（M1–M4）的单独构建物，当将所有四个突变蛋白重组为脂质体时，与WT c亚单位相比，平均多个痕量的单通道电导增加（仅包括那些具有亚电导状态的）；M4的电导是四种电导中最大的(). 我们还发现M4消除了ATP对通道活性的衰减(). 由于c-亚单位环的这些变化可能会降低代谢效率，从而增加细胞死亡，因此我们确定这些突变是否通过结合内在c-亚基缺失和shRNA-resistant WT和M4结构的过度表达来改变细胞存活率(). 在c-亚单位耗尽后，强迫OXPHOS使用无葡萄糖、含半乳糖的培养基会增加细胞死亡，而WT的过度表达（而非M4）则会挽救这些效应(). 因此，我们在神经元中过度表达M4c亚单位，并确定其对H2O（运行）2-或在正常培养基中谷氨酸诱导的细胞死亡。在过度表达M4的细胞中，神经死亡显著增加，CsA不抑制这种死亡(). 这些数据表明，释放ATP合成酶c亚基包装的突变永久性地增加了c亚基环的电导，降低了对CsA和ATP的敏感性，增加了氧化条件下或对PT诱导刺激的反应下的细胞死亡。
F类1抑制C-亚单位通道激活需要，FO（运行）释放F1PT期间。
因为我们之前的研究表明1β亚基可以控制泄漏电流(12，13)其他研究表明，F1去除分离细菌膜(33)，我们假设F的定位1为了充分耦合和抑制c亚单位泄漏电导，可能需要在c亚单位环上。检测F的分量1结合并抑制c亚单位通道，我们应用纯化的单个F1重组c亚单位通道的蛋白质(). 尽管γ、δ和ε亚基没有影响，但纯化的β亚基蛋白在小电导和大电导模式下都减弱了c亚基的电导()，表明β亚基可以直接与c亚基结合，从而在体外抑制孔隙活性。
我们的发现是F的去除1含有尿素的蛋白质被揭开了面纱，加回β亚基被抑制，c亚基孔的电导增加了F的物理解偶联的有趣可能性1来自FO（运行）可以增加c亚单位的孔传导率并启动PT。因此，我们确定是否释放F1c亚单位环与PT相关。事实上，使用整个ATP合成酶的免疫捕获（图S7)，加利福尼亚州2+-变性或天然免疫印迹中可见的诱导肿胀释放的c-亚单位低聚物（15kDa、120kDa和250kDa），而PT抑制剂（CsA、ADP）阻止ATP合成酶的释放(). 此外，即使用非常高浓度的钙诱导肿胀，CypD KO小鼠的线粒体中也未检测到c亚单位的释放2+() (22). 这种c亚单位的释放并不是由于线粒体破裂，因为在线粒体后的上清液中，Ca后发现了少量的c亚单位2+-诱导肿胀，相反，它确实释放细胞色素c（c）(图S8). 这些数据表明CypD介导的Ca2+绑定到F1破坏ATP合成酶的稳定性，导致c亚基环的揭开，从而启动PT(和图S7B类).
讨论
线粒体PT于20世纪50年代首次被描述(10)而mPTP（或MCC）的电生理特性在20世纪80年代和90年代被描述为电压和钙2+-灵敏多电导通道（电导从100 pS到2 nS(1，19–21)). mPTP被CsA和ADP抑制。我们在纯化的c亚单位中发现类似的生物物理特征，但它对钙不敏感2+并且对CsA有抵抗力。然而，MCC/mPTP的原始记录使用了IMM或有丝分裂体的制剂，这些制剂包含现在被认可的调节成分，如CypD，我们使用SMV和纯化的ATP合成酶来重述这些报告的数据。因此，我们得出结论，mPTP的主要调控位点对钙敏感2+、CypD、CsA和ADP位于F1这些位点在c亚单位纯化过程中或通过剥离F而去除1来自FO（运行）使用尿素，暴露低亲和力腺嘌呤核苷酸结合位点(和和图S1和第3章). 此外，纯化的c-亚基环与MCC类似，在很大程度上缺乏阳离子选择性。基于这些原因，我们认为c-亚基环是mPTP的孔。
如果c亚单位包含mPTP，则mPTP的开放与ATP合成酶活性之间存在关系。如果mPTP是开放的，则发生ATP水解而不是合成，导致能量消耗和mPTP的进一步开放。此外，消除c亚单位可能会破坏ATP合成酶的组装和功能，损害依赖氧磷的细胞的代谢(). 然而，糖酵解条件可防止这种毒性，除非发生应激（兴奋毒性，H2O（运行）2) (和图S5). 总的来说，过多的孔隙活性将阻止ATP的生成，而过少的mPTP活性虽然可以提高OXPHOS的效率，但可能通过阻止Ca的逃逸阀而对细胞生存不利2+和ROS。
总之，我们发现mPTP的长期寻找的分子孔是一个迄今为止未受保护的离子通道，位于哺乳动物ATP合成酶的c亚单位环内，可能在F的物理解偶联过程中暴露出来1和FO（运行）复合物。c-亚单位的耗竭可防止线粒体PT，减轻原代神经元的兴奋毒性和ROS诱导的死亡。跨膜结构域的突变使c亚单位的堆积松动，从而增加了c亚单位通道电导的大小，并使细胞以抗CsA的方式死亡。ATP合成酶β亚基抑制c亚基通道，也受Bcl-x调节L（左）改善新陈代谢(12). 从病理生理学的角度来看，PT的诱导暴露了产生mPTP的c亚单位环。我们认为，c-亚基环的位置可以调节新陈代谢和死亡。
材料和方法
F的净化1F类O（运行）ATP合成酶亚单位蛋白质和C-亚单位敲除。
转染细胞以表达或敲除（shRNA）WT或突变的人类ATP5G1或-3。
电生理学。
SMV、线粒体或蛋白质脂质体的记录是通过在细胞内溶液中形成一个千兆欧姆的密封来完成的。根据电导对各组数据进行量化。
二分四半胱氨酸显示。
两个半胱氨酸残基位于c亚单位序列的N末端，位于第一个α-螺旋区之前（位于膜间间隙侧）。
统计分析。
图表中的数据显示为平均值±SEM。统计比较包括t吨测试或ANOVA和Kruskal–Wallis测试以及事后测试(P（P）< 0.05).
致谢
我们感谢Leonard K.Kaczmarek博士富有洞察力的科学讨论和对手稿的建设性审查。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款NS064967（发给E.A.J.）和美国心脏协会拨款12GRNT12060233（发给G.A.P.）的支持。
工具书类
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