摩尔癌症研究。作者手稿；PMC 2015年5月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院563664
肿瘤异质性在新型中枢神经系统肿瘤动物模型中的作用
,1 ,2和1
阿尔伯特·J·贝克尔
2德国波恩波恩大学医学中心神经病理系
约瑟夫·洛特科
1美国康涅狄格大学生理与神经生物学系
1美国康涅狄格大学生理与神经生物学系
2德国波恩波恩大学医学中心神经病理学系
- 补充资料
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摘要
中枢神经系统（CNS）肿瘤异质性的病因尚不清楚。为了阐明这一问题，我们建立了一种新的动物模型，用于研究子宫内启动的非病毒细胞移植在大鼠体内产生的胶质瘤和非典型畸胎瘤/类横纹肌瘤（ATRT）。该模型系统为定向癌基因表达、克隆标记和添加肿瘤修饰转基因提供了机会。通过引导HRasV12和AKT转基因在不同细胞群体中的表达，启动子具有普遍活性（CAG启动子）、星形胶质细胞选择性（GFAP启动子）或少突胶质细胞选择性启动子（MBP启动子）；因此，分别产生多形性胶质母细胞瘤（GBM）和间变性少星形细胞瘤（AO）。重要的是，GBM和AO肿瘤在细胞和分子水平上都是可区分的。此外，原神经碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子Ngn2（NEUROG2）或NeuroD1与HRasV12和AKT一起在新皮质放射状胶质细胞中表达，导致形成高致死性非典型畸胎瘤/横纹肌样肿瘤（ATRT）。本研究建立了一个独特的模型，在该模型中可以解析出CNS肿瘤多样性的决定因素，并揭示神经源性bHLH转录因子的突变和表达都有助于CNS肿瘤的多样性。
关键词：中枢神经系统肿瘤、胶质瘤、神经原2、神经分化1、，猪背肉
介绍
中枢神经系统肿瘤在细胞组成、细胞增殖、侵袭性和表观遗传状态方面具有显著的肿瘤内和肿瘤间异质性(1,2). 对200例GBM肿瘤进行综合大规模基因表达分析，发现4种亚型：原神经型、神经型、经典型和间叶型(1). 基于表观遗传学、拷贝数变异、基因表达和基因突变的最新GBM分类已鉴定出多达六个GBM亚群(2). 此外，至少有两个儿童GBM的预后亚组是基于是否存在异常活性Ras/AKT通路(三,4). GBM肿瘤的异质性可能是对治疗干预的不同反应的原因(1)了解动物模型中肿瘤异质性的病因对于设计有效靶向分子定义的肿瘤亚型的治疗策略可能变得越来越重要。
脑肿瘤的几种动物模型，包括异种移植模型、基因工程小鼠模型和利用病毒介导的体细胞转基因的模型，已被用于研究中枢神经系统肿瘤生物学的重要方面。例如，在人脑胶质瘤中发现的含有突变的GEM已被用于评估单个基因和突变的致瘤效应，并在一些模型中揭示肿瘤细胞的原发性(5,6). 通过病毒和非病毒体细胞癌基因的转基因或特定靶细胞群中抑癌基因的缺失，内源性细胞群已被诱导形成胶质瘤(7–17). 例如，少突胶质前体细胞（OPC）可能是成人胶质瘤的原细胞(5,6,13)OPC起源的胶质瘤与人类GBM原神经亚群相匹配(6,18). Friedmann-Morvinski等人发现，RNAi敲低星形胶质细胞（GFAP+）或神经元（SynI+）中NF1和p53的表达可诱导间充质GBM亚型的形成，而Nestin阳性神经祖细胞中相同的RNAi可诱导神经GBM亚类的形成(16). 为了更全面地探讨大脑皮层肿瘤多样性的原因，我们开发了一种动物模型，在该模型中，在前脑发育的不同时间，可在选定的细胞群中表达多种转基因。
在新皮质发育的研究中，DNA转座子系统已被用于非病毒体细胞转基因(19,20)，细胞重编程(21)，并生成胶质瘤动物模型(17). 子宫内电穿孔是一种相对有效的方法，可以将多种转基因组合传递到子宫内发育前脑的神经元和胶质祖细胞中(22). 当与包含细胞型特异性启动子的DNA转座子系统结合时，可以在不同的细胞群中引入多种转基因，包括致癌基因(19,20,23,24). 活性Ras途径(25)和PI3K-AKT途径(9,26)经常在人脑胶质瘤患者中发现，并用于各种胶质瘤动物模型(9,10,12,15). 在这里描述的模型中，我们在放射状胶质细胞系的细胞群中引入HRasV12和AKT，以询问胶质瘤的多样性是否与诱导表达致癌转基因的细胞群有关。我们还测试了在起始祖细胞群体中添加神经原转录因子是否会改变肿瘤类型。我们通过包括发病率、组织学、发育时间进程、肿瘤克隆模式和分子特征在内的多种指标表明，当癌基因表达被引导到不同的细胞群体中时，会产生不同的肿瘤。此外，碱性螺旋-环-螺旋转录因子Ngn2或NeuroD1以及HRasV12和AKT的表达会导致非典型畸胎样横纹肌样瘤样肿瘤（ATRT-like），这是一种在现有肿瘤模型中很少产生的儿童肿瘤类型。
方法
质粒
一个系统猪背肉本研究制备并使用转座子供体质粒和辅助质粒。为了制备供体质粒PBCAG-HRasV12和PBCAG-AKT，从pTomo(15)（Addgene质粒26292），从1036 pcDNA3 Myr HA Akt1中扩增出人AKT(26)（Addgene质粒9008）分别插入pPBCAG-eGFP的EcoRI/NotI位点(19). 为了建造PBGFAP-HRasV12/AKT，PBMBP-HRasV12/AKT、HRas-V12和AKT分别插入PBGFAP-GFP和PBMBP-GFP的EcoRI/NotI站点(19). 对于bHLH供体质粒PBCAG-Ngn2和PBCAG-NeuroD1，人类Neurogen2 cDNA克隆（IMAGE ID 5247719）、人类神经元分化1 cDNA（IMAGE ID 3873419）购自Open Biosystem，PCR扩增并插入PBCAG-eGFP EcoRI/NotI位点。将Ngn2编码序列插入pCAG-eGFP的EcoRI/NotI位点，得到CAG-Ngn2。
动物
怀孕的Wistar大鼠从Charles River Laboratories，Inc.（马萨诸塞州威尔明顿）获得，并在康涅狄格大学的动物饲养场以12小时的光周期饲养随意在手术期间确定并确认动物的胎龄。男性和女性受试者均用于肿瘤诱导。为了构建生存曲线(,)当大鼠无法进食或饮水时，出于人道目的将其从实验中移除。在40周生存实验结束时，计算前一周的生存百分比，并生成%生存曲线。对于PBCAG-Ngn2/PBCAG-HRasV12/AKT和PBCAG-NeuroD1/PBCAG-HRasV12/AKT诱导的肿瘤，还计算了每天的存活率。为了统计比较存活率，使用SPSS进行了对数秩检验、Breslow检验和Tarone-Ware检验（IBM SPSS统计21）。所有程序和实验方法均由康涅狄格大学IACUC批准。
不同的供体质粒可诱导不同的肿瘤类型（A） 小鼠GFAP启动子片段标记星形胶质细胞。（B） 大鼠MBP启动子片段标记的少突胶质细胞。
（C） GFAP和MBP启动子片段对标记细胞比例的量化（单向方差分析*表示P<0.05，***表示P<0.01。NS表示无显著差异）。（D） 神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和NG2细胞的代表性图像。（E–F）Kaplan-Meier生存曲线和荷瘤大脑的代表性外观。对数秩检验显示所有组的生存率无差异。PBCAG-HRasV12/AKT诱导肿瘤的（G-K）特征。（G） 肿瘤细胞的蛛网膜下扩散（H&E）。（H） 坏死（黑色箭头，H&E）。（I–K）具有纤维突起的肿瘤细胞GFAP、波形蛋白和MAP2阳性。PBGFAP-HRasV12/AKT诱导肿瘤的（L–P）特征。（五十） H&E染色概述。黑色箭头表示船只。（M） 坏死（黑色箭头）。（N–P）GFAP、Vimentin和MAP2阳性过程。PBMBP-HRasV12/AKT诱导肿瘤的（Q-U）表征。（Q） 显著的少突胶质成分（H&E）。（R） 肿瘤细胞的圆形细胞外观（插图）和有丝分裂（黑色箭头，H&E）。（S） GFAP阳性星形胶质细胞突起。（T） 少突胶质细胞波形蛋白阴性，星形胶质细胞波状蛋白阳性。（U） MAP2阳性少突胶质成分（黑色箭头，插图）和MAP2阳性星形胶质细胞成分（灰色箭头）。
比例尺：A、B、L–N、P、Q、S中的200μm；G、I–K和100μm；H、O、R、T中为50μm；D中为20μm，R和U中为10μm。
PBCAG-HRasV12/AKT中添加Ngn2或NeuroD1可诱导ATRT样肿瘤（A，B）Kaplan-Meier生存曲线和含ATRT样肿瘤的大脑的代表性图像。与GBM和间变性寡星状细胞瘤荷瘤动物相比，ATRT样肿瘤荷瘤动物的生存期显著缩短（log-rank检验，*表示P<0.05，***表示P<0.01）。向PBCAG-HRasV12/AKT混合物中添加CAG-Ngn2可诱导（C–G）ATRT样肿瘤。（C） Rhabdoid成分（黑色箭头，插图），神经元分化（灰色箭头，H&E）。（D） 波形蛋白横纹肌样细胞元件（黑色箭头，插图）和突起/神经胶质分化（灰色箭头）。（E） 单个细胞肌动蛋白阳性。（F） 成簇的细胞表达上皮膜抗原。（G） 细胞角蛋白（Lu-5表位）阳性的细胞很少。将PBCAG-NeuroD1添加到PBCAG-HRasV12/AKT混合物中可诱导（H–K）ATRT样肿瘤。（H） 坏死肿瘤，有丝分裂、横纹肌样细胞分化（黑箭头，插图）、富含突起和上皮样部分（H&E）。（一） 波形蛋白阳性杆状体成分（黑色箭头，插图）以及波形蛋白正性过程（灰色箭头）。（J） 肌动蛋白阳性细胞。（K） 上皮膜抗原-阳性细胞簇。将PBCAG-Ngn2添加到PBCAG-HRasV12/AKT混合物中可诱导（L–N）ATRT样肿瘤。（五十） H&E–细胞密度高且未分化的肿瘤（有丝分裂图-灰色箭头；横纹肌样细胞-黑色箭头，插图）。（M） 波形蛋白染色，单个横纹肌样成分（黑色箭头，插图）位于富含神经胶质突起的网络环境中。（N）肌动蛋白阳性细胞簇。
比例尺：C和E–N为100μm，D为50μm，所有插图为10μm。
子宫内电穿孔
子宫内如前所述进行电穿孔(19,20,27). 在胚胎第14天或第15天（E14或E15）进行电穿孔，手术期间确认妊娠年龄。所有质粒的最终浓度均为1.0μg/μl，但PBCAG-CFP和GLAST-PBase的最终浓度为2.0μg/微升。
图像采集和三维重建
使用蔡司Axio成像仪M2显微镜和Apotome，488/546/350 nm滤光片立方体和X-Cite系列120Q光源进行多色成像(20). 所有图像都在Adobe Photoshop CS3软件（加利福尼亚州圣何塞）中进行了进一步处理。对于3D重建，P27 Wistar大鼠用异氟醚深度麻醉，并用4%多聚甲醛/PBS（4%PFA）经心灌注。样品在4%PFA中后固定过夜，并在振动仪（Leica VT 1000S）上以65μm的厚度切片。切片按顺序安装在显微镜载玻片上，所有切片均以相同的背腹和左右排列排列。使用立体调查员（Microbright Field，VT）采集图像。图像采集后，使用半球和每个克隆的彩色编码轮廓追踪大脑半球和肿瘤克隆的轮廓。然后将追踪图像传输到Neurolucida Explorer（Microbright Field，VT），在该浏览器中，来自连续切片的多个轮廓相互附加，并按顺序组织和堆叠。使用Neurolucida Explorer软件3D可视化选项创建3D模型，以可视化选定肿瘤细胞克隆的克隆性。
免疫组织化学
用异氟醚对动物进行深度麻醉，并用4%多聚甲醛/PBS（4%PFA）经心灌注。样品在4%PFA中过夜固定。为了进行免疫荧光，在一个震动器（徕卡VT 1000S）上以65μm的厚度对大脑进行切片。切片处理为自由漂浮切片，并用GFAP（Cell Signaling，3670X）、CC1（Calbiochem，OP80）和NG2（Chemicon，AB5320）抗体染色。如前所述采集和处理图像(19,20).
为了进行组织学分析，在石蜡包埋的4μm切片上进行免疫组织化学和H&E染色，如(28,29)使用GFAP（DAKO，Z0334）、MAP2c（Sigma，M4403。
肿瘤细胞培养
在P21岁时，从PBCAG-HRasV12/AKT转染的动物身上解剖肿瘤。解剖后，将肿瘤组织切碎并胰蛋白酶化为单细胞悬浮液。然后将细胞培养在无血清培养基中，该培养基由含有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、B-27、N-2、bFGF和EGF（Invitrogen，CA）的DMEM组成。2天后，将肿瘤细胞粘附培养物以10个细胞/μl的密度传代到神经球悬浮培养物中，并使其生长3天以形成肿瘤球。
RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR
P21至P27岁的动物用异氟醚进行深度麻醉。大脑在冰上很快被切除。在大脑表面发现肿瘤，取出肿瘤，然后切成方块。取对侧半球无肿瘤组织作为对照。根据制造商的说明，使用Ambion®RNAqueous®Kit（Invitrogen，CA）进行RNA提取。按照制造商的协议，使用转录第一链cDNA合成试剂盒（Roche）进行cDNA合成。qRT-PCR使用Fast SYBR®Green主混合液（加州应用生物系统公司）进行。引物序列列于补充表1每个样品中都含有三种硅酸盐。用ΔΔCt法计算基因表达调控倍数。更具体地说，从肿瘤和对照脑RNA样本中获得的Ct值直接归一化为看家基因（GAPDH）。ΔΔCt是肿瘤和对照样品之间ΔCt值的差值。肿瘤和对照脑之间相关基因表达的fold-change等于2^（−ΔΔCt）。对所分析的24个基因中的每个基因的调节倍数进行无监督的层次聚类，并使用MATLAB生物信息学工具箱（Math Works，MA）中的聚类图命令生成热图。使用KaleidaGraph 4.0版（SynergySoftware 2006）进行其他统计分析。需要95%的置信区间（p<0.05）才能认为数值具有统计学意义。所有数据均表示为平均值和标准平均误差（SEM）。
结果
GBM模型猪流感病毒-介导体细胞转基因
我们开发了一种非病毒体细胞转基因方法，从内源性大鼠神经祖细胞产生肿瘤体内HRasV12和AKT转基因被导入胚胎新皮质神经祖细胞，也称为放射状胶质祖细胞，通过子宫内胚胎大鼠侧脑室电穿孔。对于非病毒细胞转基因，我们产生了一个由辅助质粒组成的质粒系统，该辅助质粒表达猪背肉放射状胶质祖细胞中的转座酶通过GLAST启动子（GLAST-PBase），从而驱动转座子整合到放射状胶质细胞祖细胞的基因组中，一组包含转座子反向末端重复序列（ITR）侧翼的转基因的供体质粒通过猪背肉转座酶活性。供体质粒包括在三种不同启动子（CAG、MBP或GFAP）之一的控制下的HRasV12和AKT()和供体质粒的多色系统(20)通过CAG启动子驱动eGFP、mRFP或CFP的表达来创建多色克隆标记() (20,30). 将该质粒系统单侧电穿孔至E14–E15大鼠胚胎侧脑室()出生后21天总是会导致单侧大肿瘤的形成(). 肿瘤由两个颜色均匀的细胞区域组成，这表明存在明显的区域性克隆扩张()和含有不同颜色细胞混合物的区域，表明克隆混合(). 除肿瘤外，在肿瘤核心的远端还发现了典型的一种或两种不同颜色的细胞流。这些流通常以定向链的形式存在，表明其迁移和侵入周围神经组织(). 生存实验表明，经CAG供体质粒治疗的荷瘤动物在3周龄时开始死亡，到出生后31周，死亡率趋于稳定(). 在所有电穿孔动物中都证实了肿瘤（30/30）。
多色大鼠胶质瘤（A） 的示意图猪背肉IUE方法和使用的质粒。子宫内在E14–E15之间进行电穿孔，并列出质粒。我们使用了多色猪背肉克隆标记细胞的系统、诱导肿瘤的癌基因供体质粒以及编码转录因子的供体和常规上皮质粒，以评估它们在胶质瘤发生中的作用。动物出生后，在不同出生年龄进行肿瘤评估。（B） 多色转染P22大鼠大脑半球的代表性图像猪背肉质粒和PBCAG-HRasV12/ATK供体质粒。坏死用N（C）重叠图像标记，显示肿瘤细胞的大区域用mRFP均匀标记。（D） 显示肿瘤其他区域的重叠图像用eGFP均匀标记。（E） 肿瘤细胞流侵入肿瘤附近的组织。（F） 包含红色和绿色标记转化细胞混合物的肿瘤区域，表示克隆混合区域。（G） 在转染PBGFAP-HRasV12/AKT的P27大鼠中对5个肿瘤克隆进行三维重建。CT，皮层。CC，胼胝体。比例尺：B为500μm，C、D、E和F为100μm。
组织学上，由CAG供体质粒驱动的HRasV12和AKT诱导的肿瘤由原纤维和双生细胞成分组成(补充图1A). 肿瘤弥漫性浸润邻近组织(补充图1B)并且细胞具有高度多形性的细胞学外观，并且有丝分裂活性增加，提示恶性肿瘤(补充图1C). 肿瘤细胞经常侵犯蛛网膜下腔()，肿瘤有坏死区域，表明恶性程度高(箭头）。P7出现肿瘤，早在P4发现坏死区。免疫组织化学分析显示肿瘤细胞对GFAP呈强阳性()，波形蛋白()和MAP2(). 肿瘤内的一些神经元突触素阳性，而大部分肿瘤未显示突触素的阳性。有趣的是，我们在CAG供体质粒产生的大鼠肿瘤中没有观察到血管增殖，但在本研究中使用的所有其他质粒组合诱导的肿瘤中观察到了血管增殖。此外，当在神经球悬浮培养基中培养时，肿瘤细胞可以形成肿瘤球(补充图2). 总之猪背肉转座子系统有效地产生了类似人类GBM的肿瘤模型（WHO IV级）。
MBP和GFAP启动子导向的癌基因表达产生不同的肿瘤类型
二进制文件猪背肉该系统允许在一组细胞（即放射状胶质细胞神经祖细胞）中直接插入转基因，但随后在谱系中后期生成的细胞类型中延迟癌基因的表达。这一特征使我们能够将癌基因导入胚胎侧脑室表面的神经前体细胞，但随后它们的表达开始，主要是在星形胶质细胞或少突胶质细胞中。在本实验中，我们构建了HRasV12和AKT表达受小鼠GFAP启动子片段控制的供体质粒(19)（PBGFAP-HRasV12/AKT）或大鼠MBP启动子片段(31)（PBMBP-HRasV12/AKT）。我们首先以GFP为报告物评估了小鼠GFAP和大鼠MBP启动子的活性。我们发现GFAP启动子产生69.3±3%的星形胶质细胞、19.4±2%的神经元、7.1±2%的少突胶质细胞和4.3±0.7%的少突前体细胞。相反，MPB启动子构建体（PBMBP-eGFP/mRFP）标记了57.0±2%的少突胶质细胞、16.2±0.7%的星形胶质细胞、19.3±2%的神经元和7.5±0.7%的少突胶质细胞前体细胞(). 单向方差分析显示GFAP和MBP启动子标记的星形胶质细胞（p=6.91E-05）和少突胶质细胞（p=2.69E-05）之间存在显著差异。GFAP和MBP启动子标记的NG2细胞之间也存在显著差异（单向方差分析，p=0.021172），但标记神经元的比例之间没有显著差异（双向方差分析，p=0.989884）。MBP和GFAP启动子片段标记的细胞群差异与少突胶质细胞和星形胶质细胞的强化靶向性一致；然而，每个启动子也能够标记每个细胞类型的某些部分。
接下来，我们比较了含有GFAP或MBP启动子驱动癌基因表达的供体质粒产生的肿瘤。对于两种供体质粒，到40周时，肿瘤导致所有动物死亡，65.2%（15/23）的动物死亡(). 对数秩检验表明，GFAP诱导的荷瘤动物的存活率无显著差异，MBP或CAG供体质粒（对数秩检验，CAG和GFAPP之间p=0.194，GFAP和MBP供体质粒转染动物之间p=0.554。对于CAG和MBP供者质粒转染的动物之间的比较，对数秩检测p=0.093，Breslow检测p=0.121，Tarone-Ware检测p=0.106）。GFAP和MBP启动子条件下肿瘤的组织病理学分析显示有丝分裂频繁(补充图1D,，黑色箭头），类似于上述CAG启动子条件，但也显示血管增生与高度恶性肿瘤类型一致。在出生后14天至280天进行肿瘤评估的23只动物中，有23只动物出现肿瘤。此外，GFAP供体质粒诱导的肿瘤与MBP质粒不同，导致肿瘤具有明显的坏死灶，经常被“假栅栏”肿瘤细胞包围(箭头）。GFAP供体质粒诱导的肿瘤的免疫组织学评估表明，富含突起的星形胶质细胞，突起精细，GFAP、波形蛋白和MAP2阳性(). 根据组织病理学结果，我们得出结论，GFAP供体质粒诱导的肿瘤是类似于人类GBM的恶性星形胶质细胞肿瘤（WHO IV级）。虽然在许多方面与CAG供体质粒诱导的肿瘤相似，但多色克隆分析表明，GFAP供体质粒导致的肿瘤具有比CAG供者质粒更大的克隆区域。同样，GFAP供体质粒条件下的肿瘤比CAG供体质粒情况下的肿瘤表现出更多的克隆相关的侵袭和纹状体扩张。
与GFAP和CAG供体质粒诱导的肿瘤相比，MBP供体质粒诱发的肿瘤包含星形胶质细胞和寡角胶质成分的混合物，并且缺乏GFAP供体质粒所诱导肿瘤典型的显著坏死灶和假栅栏细胞排列(). 在MBP供体质粒诱导的肿瘤的某些区域，存在GFAP和Vimentin阳性的过程()但这些区域的观察频率低于GFAP供体质粒诱导的肿瘤。除了小的星形胶质细胞部分外，MBP供体质粒诱导的肿瘤还含有明显的“蜂窝状”细胞簇()核圆形同构，位于核周晕的中心(插图）：一种类似人类少突胶质瘤细胞学特征的特征。细胞内大部分波形蛋白阴性()，但MAP2阳性，这是一种与少突胶质和星形胶质混合成分一致的免疫染色模式。MAP2免疫阳性显示核周细胞质染色强，无明显突起标记(黑色箭头，插图）典型的少突胶质瘤。MBP供体质粒诱导的肿瘤中的一些MAP2染色细胞显示星形胶质细胞典型的双极或多极突起(灰色箭头）。总之，MBP供体质粒诱导的肿瘤中观察到的组织学和免疫组织化学模式与GFAP和CAG供体质粒所观察到的不同，并且与人类间变性少星形细胞瘤（WHO III级）最为相似。
碱性螺旋-环-螺旋转录因子的表达改变肿瘤类型
接下来，我们研究了添加神经原转录因子Neurogen2（Ngn2）和Neuronal Differentiation1（NeuroD1）是否会改变神经祖细胞的命运(32)会改变肿瘤表型。我们之所以选择Ngn2和NeuroD1，是因为之前已经证明它们可以阻止神经祖细胞向星形胶质细胞的分化，并促进向神经元的分化(32). 我们假设具有神经元促进作用的转录因子要么抑制肿瘤的形成，要么导致肿瘤的形成不同于CAG供体质粒诱导的肿瘤。事实上，Ngn2或NeuroD1与CAG供体质粒的表达导致了一种独特的肿瘤类型，这是我们从未在其他三种肿瘤诱导质粒组合中观察到的。此外，与其他致瘤质粒相比，转染Ngn2或NeuroD1修饰质粒的动物表现出更早的死亡和更高的死亡率()对数秩检验表明，转染Ngn2或NeuroD1修饰质粒的动物比转染CAG、GFAP或MBP供体质粒的动物生存期显著缩短（P<0.0001）().
在Ngn2和NeuroD1供体质粒条件下对脑肿瘤进行尸检分析后，我们在14天大的时候遇到了表面高度不规则的大型脑肿瘤(). 组织学上，这些大肿瘤包含分化不良的细胞，并显示出广泛坏死和增殖的区域。H&E切片显示肿瘤含有显著的横纹肌样细胞成分（黑色箭头). 整体免疫组织化学特征显示有畸胎瘤特征。细胞具有典型的波形蛋白“capping”型表达模式（黑色箭头)，一些细胞肌动蛋白呈强阳性(). 上皮膜抗原也有局部表达(). 我们也没有观察到细胞角蛋白（Lu-5表位）的显著表达。INI（hSNF5/SMARCB1）的核表达在这些肿瘤的细胞中得以保留。虽然分化较差，但肿瘤显示星形胶质细胞GFAP的局部表达区域(补充图4B,补充图5C)和Vimentin阳性过程()以及神经元标记物MAP2的分散阳性(补充图4D,补充图5B)和突触素(补充图4C). 有趣的是，突触素阳性标记了具有细胞学神经元特征的肿瘤细胞区域和簇。各个元素的非器官分布与陷落的神经元相矛盾。MAP2c的表达似乎反映了树突状神经元的结构。总之，通过将Ngn2或NeuroD1供体质粒与CAG供体质粒联合诱导的肿瘤在组织学上最类似于非典型畸胎瘤样横纹肌样肿瘤（ATRT）样肿瘤。
Hertwig等人(33)据报道，一组7个特征基因可用于对三种中枢神经系统肿瘤进行无误分类：胶质瘤、PNET和ATRT。因此，我们评估了这组7个基因在HRasV12/AKT联合Ngn2诱导的肿瘤中的表达。我们发现在HRasV12/AKT和Ngn2诱导的肿瘤中，7个基因中有6个基因的表达显著上调(补充图6). 在6个上调基因中，SPP1被认为是鉴别ATRT与PNET和髓母细胞瘤的诊断标记(34)作为胶质瘤分级指标(35)，表现出最大的上调（6.6倍）。基因上调模式结合组织学特征提示HRasV12/AKT联合Ngn2或NeuroD1诱导的肿瘤为ATRT样肿瘤。
由于bHLH转染条件导致了一种独特的高致死性肿瘤，我们接下来要讨论的是，这种从GBM到ATRT样肿瘤的明显表型转化是由于bHLH-因子在放射状胶质细胞祖细胞中的瞬时表达还是肿瘤细胞中的表达。这个猪流感病毒转座子系统可以控制转基因是否整合到转染细胞中，或者是否仍然存在于外体中，从而在随后增殖的细胞中丢失(22). 我们将上述Ngn2供体质粒替换为质粒CAG-Ngn2，其中CAG-Nng2转基因没有ITR序列侧翼，因此不受转座酶介导的基因组整合的影响(22). 因此，这些外体质粒的转基因表达在1-2次细胞分裂中丢失(22,23). 添加胞外膜CAG-Ngn2足以产生肿瘤(补充图3,)表达上皮膜抗原的肿瘤细胞簇()和表达细胞角蛋白（Lu-5表位，). 核INI1也保存了下来（数据未显示）。因此，Ngn2在放射状胶质前体细胞及其直系后代中的瞬时表达足以产生ATRT样肿瘤。
肿瘤的不同发育模式
上述四种肿瘤诱导条件（CAG供体质粒、GFAP供体质粒，MBP供体质粒和带有bHLH转录因子修饰供体质粒的CAG供者质粒）在出生后相似的发育时间点进行评估时，均产生组织学上不同的肿瘤。接下来，我们试图探讨这些差异是否反映在每种肿瘤类型的发育时间进程的差异中。如所示我们发现，CAG供体质粒条件导致所有受检动物在出生当天出现异常细胞增殖的早期迹象，大量荧光标记细胞聚集体侵入纹状体和新皮质的心室和心室下区（P0）（3/3）。相反，在出生后的头几天，无论是GFAP（0/3）还是MBP供体质粒（0/3；)但出生后几天，正常分化的神经元明显可见，神经元皮质板外只有散在的细胞。出生后第一周结束时，MBP和GFAP供体质粒条件下均出现大量异常增殖的细胞()（MBP中3只动物中，GFAP供体转染的动物分别为3只）。这些肿块通常为单克隆标记颜色，位于白质和软脑膜下区的中心区域(). MBP和GFAP供体质粒条件下肿瘤生长的时间过程相似，但组织病理学分析表明，两种条件下的细胞形态因P21而不同(). 尽管相对于CAG供体质粒，GFAP和MBP供体质粒条件下的大肿瘤延迟出现，但P21在MBP和GFAP供体质粒情况下的肿瘤大小比CAG供者质粒条件下大(). 最后，与CAG供体质粒加上Ngn2修饰质粒诱导肿瘤的早期致死性和高度侵袭性相一致，这种情况下的肿瘤()出生时即明显可见（4/4），出生后3周迅速扩大为巨大肿瘤，并有街道样坏死侵犯整个大脑半球（7/7）。观察到的发育模式与表达癌基因的启动子最活跃的时间一致，普遍存在的CAG启动子在祖细胞早期强烈活跃，而胶质细胞开始分化时，GFAP和MBP启动子在谱系后期最活跃。
诱导肿瘤具有明显的发育时间过程（A–E）PBCAG-HRasV12/AKT诱导肿瘤的发育时间过程。（A） P0时，VZ/SVZ、纹状体、新皮质和软脑膜细胞密集。方框区域的放大视图如A′所示。（B） P7处坏死。方框区域的放大视图如B′所示。（C） PBCAG-HRasV12/AKT转染大脑P21的代表性图像。（D） PBCAG-HRasV12/AKT诱导肿瘤边缘。DAPI以洋红色显示。（E） PBCAG-HRasV12/AKT诱导肿瘤中的双极长梭形细胞。（F–J）PBGFAP-HRasV12/AKT诱导肿瘤的发育时间过程。（F） 来自转染PBGFAP-HRasV12/AKT的P2脑的代表性切片。方框区域的放大视图以F′表示。（G） PBGFAP-HRasV12/AKT转染脑P9切片。方框区域的放大视图如G′所示。（H） 第21页PBGFAP-HRasV12/AKT转染大脑的代表性图像。（一） PBGFAP-HRasV12/AKT诱导肿瘤边缘。DAPI以洋红色显示。（J） PBGFAP-HRasV12/AKT（K–O）诱导肿瘤中具有长突起的双极锥体细胞PBMBP-HRasV12/AKT诱导肿瘤的发育时间过程。（K） 来自转染PBMBP-HRasV12/AKT的P3脑的代表性切片。方框区域的放大视图以K′表示。（五十） PBMBP-HRasV12/AKT转染脑P7切片。方框区域的放大视图如L′所示。（M） PBMBP-HRasV12/AKT转染大脑P21的代表性图像。（N） PBMBP-HRasV12/AKT诱导肿瘤边缘。DAPI以洋红色显示。（O） PBMBP-HRasV12/AKT诱导的肿瘤中具有短突起的小圆形细胞。（P） P0处转染PBCAG-Ngn2、PBCAG-HRasV12/AKT的大脑的代表性图像切片。方框区域的放大视图如P′所示。（Q） P21动物切片显示肿瘤细胞遍布整个大脑半球。（R） PBCAG-Ngn2、PBCAG-HRasV12/AKT诱导的肿瘤边缘。DAPI以洋红色显示。（S–T），在PBCAG-Ngn2、PBCAG-HRasV12/AKT诱导的肿瘤中经常发现肿瘤细胞。（U） 广泛的街道状坏死。
比例尺：C、H、m和Q中的1000μm；B、G、L和P中为500μm；A、F和K中为200μm；B′，D，G′I，L′，N，P′，T，U中为100μm；在A′E、F′、K′J、O、S和T中为50μm。
肿瘤类型的基因表达差异
癌症基因组图谱研究网络（TCGA）通过基因表达谱和基因突变鉴定了4种多形性胶质母细胞瘤亚型(1). 通过此分析，确定了一组24个特征基因，可用于对4个亚型进行分类(1). 因此，我们使用这24个特征基因的表达水平来进一步评估是否可以根据这组基因的表达来区分我们研究中产生的四种肿瘤模式。为了做到这一点，我们使用q-PCR和无监督分层聚类分析来比较和分类由四种情况产生的肿瘤。我们发现，与组织病理学分析一致，CAG和GFAP供体质粒产生的肿瘤在24个基因的表达方面聚集在一起(). 组织病理学上最明显的肿瘤是由MBP供体质粒产生并由Ngn2供体质粒修饰的肿瘤，它们的基因表达模式彼此之间以及与CAG和GFAP供体质粒条件相关的基因表达类型不同(). EGFR在人类GBM中频繁扩增和过度表达；然而，EGFR转录物在所有肿瘤类型中并不显著。这可能是因为Ras/AKT是EGFR通路的下游因子(15). 我们还发现p53既没有突变也没有缺失（数据未显示），p53转录物显示约2倍的上调。因此，我们在不同启动子条件和修饰转录因子表达产生的肿瘤中发现的异质性也反映在不同的基因表达模式中。
诱导肿瘤显示不同的分子特征（A） 基于qRT-PCR的24个Verhaak基因表达数据的无监督聚类分析等(1)跨不同供体质粒诱导肿瘤。热图显示诱导肿瘤中基因表达相对于无瘤脑组织的折叠变化。筛选出的24个基因列在左边。色标表示表达的折叠变化，红色表示上调，绿色表示下调基因表达。四种条件下的基因表达以行显示，而每组肿瘤样本中24个基因的表达以列显示。（B） 从（A）中选择的6个代表性基因的平均调控倍数。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。（单向方差分析，*表示P<0.05，***表示P<0.01）。
讨论
对肿瘤异质性提出了两种并非相互排斥的解释(36). 压倒性的实验和临床证据表明，不同的基因突变导致不同的肿瘤类型，包括不同的中枢神经系统肿瘤类型(37). 例如，Hertwig等(33)结果表明，出生后小鼠神经干细胞感染含有V12HRAS或c-MYC的病毒可能导致形成3种不同的肿瘤类型，具体取决于癌基因的引入组合和序列。同样，雅克等(38)结果表明，小鼠脑室下区神经干细胞中p53、Rb和PTEN的不同条件基因缺失组合可诱导PNET或胶质瘤的形成。也发现了不同细胞类型是中枢神经系统肿瘤异质性来源的证据(39–42). 例如，将突变稳定的N-Myc转导到围生期小鼠小脑和脑干的神经干细胞中，导致了髓母细胞瘤/原始神经外胚层肿瘤的形成，而将N-Myc转入从前脑分离的NSC中，导致弥漫性胶质瘤(41). 由于不同的神经祖细胞类型具有不同的基因表达谱，可能会改变肿瘤细胞的分化，因此来源细胞和基因突变的差异似乎都有助于中枢神经系统中的肿瘤类型多样性(36). 我们的研究表明，在发育过程中，起源于新皮质的细胞群体可以促进肿瘤的多样性，此外，在同一群体中表达的非致癌转录因子也可以改变肿瘤的类型。
虽然儿童GBM与成人GBM在组织学上有相似之处，但现在认为它们是不同的实体，具有不同的分子特征(2,43). 例如，已有研究表明，儿童GBM表现出与成人GBM不同的拷贝数变异谱(44). 综合分子分析实验也揭示了儿童和成人GBM之间的差异。例如，IDH热点突变在成人高级别胶质瘤中经常发现，但在儿童肿瘤中不常见(2,43). 此外，虽然PDGFRA是儿童高级胶质瘤局灶性扩增的主要靶点，但在成人胶质母细胞瘤中EGFR是最常见的靶点(43). 此外，组蛋白H3.3突变在儿童GBM中经常发现，而在成人GBM中则不存在(2,45). 儿童GBM的起源细胞未知，可能与成人GBM不同。我们使用CAG供体质粒诱导GBM，GBM早在大鼠P7时就出现，早在P4时即显示坏死区域，这是早熟大鼠的发育时期，相当于人类的新生儿期。未来的实验将需要确定在该系统中建模的早期肿瘤在分子特性和起源细胞方面是否与儿童或成人GBM更相似。
我们的研究表明，ATRT样和GBM突变的细胞可能是胚胎新皮质的放射状胶质细胞。这个子宫内我们使用电穿孔方法靶向排列在侧前脑侧脑室中的放射状神经胶质细胞和放射状神经祖细胞。E14/15大鼠前脑脑室表面的祖细胞群包含能够产生不同类型神经元的祖细胞亚群，主要是胶质细胞或主要是神经元(23). 我们使用普遍存在的CAG供体质粒在放射祖细胞群体中立即诱导HRasV12和AKT的表达。由同一立即激活的启动子表达的Ngn2或NeuroD1足以改变产生的肿瘤类型。早在出生当天，即诱导基因表达后约一周，肿瘤差异就很明显。我们还发现，Ngn2（通过非供体上体质粒）在放射状胶质细胞中的瞬时表达足以产生ATRT样肿瘤。瞬时Ngn2表达的有效性，以及之前在胶质瘤细胞中表达的Ngn2或NeuroD1在不改变肿瘤类型的情况下诱导细胞死亡和神经元分化的研究结果(46,47)支持Ngn2和NeuroD1在早期放射状祖细胞中起作用以改变所产生的肿瘤类型的观点。我们已经用GFAP供体质粒共同表达了Ngn2，并且发现所产生的肿瘤与GFAP供者质粒单独诱导的肿瘤相似。但我们确实在结果肿瘤中发现了横纹肌样细胞（数据未显示）。然而，由于小鼠GFAP启动子片段在放射状胶质细胞中也很活跃，因此必须谨慎解释该结果。将来，结合Ngn2和MBP供体质粒可能会区分Ngn2的作用时间。
INI1基因功能丧失被认为是人类ATRT的重要原因(48). INI1基因敲除小鼠发生肿瘤，但这些似乎不是ATRT(49). 赫特维希等(33)结果表明，连续感染c-MYC和V12HRAS的NSC/NPC移植可产生ARTR样肿瘤，其基因表达谱与人类ATRT相似，表明在啮齿类动物模型中，其他突变类型可导致ATRT。同样，我们在本研究中证明，新皮质放射状胶质细胞的HRasV12和AKT转染可产生ATRT样肿瘤，但只有在与bHLH转录因子Ngn2或NeuroD1共同表达时，这两个基因本身才是非致癌的。这强调了肿瘤类型多样性不仅可能受到突变细胞的影响，还可能受到该细胞中存在的特定分子环境的影响。
我们目前的研究结果还表明，放射状胶质细胞系中GFAP和MBP启动子活性群体产生的肿瘤具有不同的分子和组织学特征。有趣的是，所有细胞类型都由GFAP和MBP供体质粒标记，但产生的肿瘤类型在组织学和分子特征上始终不同。这可能表明肿瘤的多样性是由经历转化的人群中的主要细胞类型决定的。通过在未来的实验中混合GFAP和MBP供体质粒并跟踪其克隆扩展，我们可能能够区分一个肿瘤细胞群体是否占优势。
的几个属性猪背肉这里展示的转座子系统使该模型在肿瘤生物学的各种新应用中具有潜在的实用价值。它的主要优势猪背肉IUE方法允许引入多个转基因。例如，在这项研究中，我们同时引入了一种转座酶辅助质粒，以靶向GLAST阳性细胞的稳定转基因，两种表达癌基因的供体质粒及其自身的启动子，3种荧光报告基因(,和)和转录因子。高共表达效率使我们能够按顺序在不同亚群中直接表达，引入克隆标记方法和修饰转录因子。这种功能应该使这种方法成为筛选肿瘤发展潜在修饰物和进一步确定基因修饰物如何改变肿瘤发展的有用平台。
启示
一种新的中枢神经系统肿瘤模型揭示，发生在不同细胞类型和/或分子环境中的致癌事件导致不同的肿瘤类型；这些发现揭示了脑肿瘤异质性的来源。
致谢
我们要感谢西山明子博士提供NG2和CC1抗体。我们还要感谢以下人员慷慨地与我们分享他们的构建：William Sellers博士为pcDNA3 Myr HA Akt1构建；Inder Verma博士为pTomo构建。
赠款支持
这项工作得到了NIH拨款的支持：为Joseph LoTurco提供RO1HD055655和R01MH056524。
工具书类
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