着丝粒周围异染色质的形成取决于细胞核的位置

摘要

在哺乳动物中，精子受精卵母细胞后进行表观遗传重编程，这涉及在两个亲本基因组中从头获得染色质特征，但这种重编程的分子决定因素尚不完全清楚。特别是，异染色质从头开始的形成被认为对确保胚胎表观基因组的后续组织和胚胎发育至关重要(Probst和Almouzni 2011；Fadloun等人，2013年；Nestorov等人，2013年).

在合子中，父系染色质的重塑尤其广泛，因为它会被母系提供的组蛋白几乎全基因组范围内的精蛋白替代。受精后几个小时，着丝粒周围的染色质必须首次获得高度致密的染色质组织，以允许随后的动粒装载和通过第一次有丝分裂进行。着丝粒周围结构域由主要和次要卫星重复序列的串联重复构成，分别构成着丝粒中心和着丝粒中央染色质。在胚胎中，着丝粒周围染色质的初始沉默需要组蛋白变体H3.3的Lys27，并伴随着H3K27甲基化的渐进获得和HP1β的系留，其机制涉及合子中主要卫星（MajSat）重复序列的转录爆发，类似于异染色质的形成葡萄裂殖酵母(格雷瓦尔和埃尔金2007；Puschendorf等人，2008年；Probst等人，2010年；Santenard等人，2010年). 然而，哺乳动物的异染色质化似乎是“非典型”的，因为它独立于H3K9me3和H4K20me3，而父系染色质中不存在这两种染色质(Arney等人，2002年；Kourmuli等人，2004年；Santos等人，2005年). 一致的是，H3.3K27R突变体的表达扰乱了着丝粒周围的异染色质沉默，而H3.3K9R突变体在发育过程中没有明显的影响(Santenard等人，2010年).

着丝粒周围异染色质通常被视为间期小鼠体细胞中富含DAPI的区域，称为色心。这些形成于来自几个染色体的着丝粒周围区域的聚集。然而，在胚胎中，着丝粒周围染色质直到两细胞晚期/四细胞早期转变才形成色心(Martin等人2006a；Probst等人，2007年；Aguirre-Lavin等人，2012年). 相反，哺乳动物胚胎显示出独特的核组织，染色体区域呈放射状排列，着丝粒附着在核仁前体上。着丝粒周围的染色质包裹着这些前体，称为核仁样体（NLB），形成一个典型的环状结构。

越来越清楚的是，核组织为基因调控提供了一个里程碑(Akhtar和Gasser 2007；Kumaran等人2008). 虽然许多研究已经记录了受精后着丝粒周围染色质的核定位变化，这些变化与体细胞核移植的重编程效率相关(Martin等人，2006b)，这一过程在异染色质建立和/或维持中的功能作用尚未得到解决，并且还不知道基因组的空间组织是否能够调节重编程。在这里，我们讨论了获取中心周围染色质异色特征的时间动力学，这些异色特征与它们在核三维（3D）空间中的位置有关。我们发现，在获得其胚胎异色特征（H3K27me1、H3K17me3和HP1β）之前，中心周围重复序列在合子中的核仁前体周围定位，这表明它们的空间配置对于异色沉默至关重要。我们用一个设计好的锌指（ZF）融合到emerin上，emerin是核膜的一个组成部分，通过人工将着丝粒周围染色质连接到核外周来验证这个假设。我们的结果表明，着丝粒周围异染色质的空间定位对于其沉默和受精后胚胎染色质的重编程至关重要。

结果和讨论

我们首先讨论了着丝粒周围染色质核定位的时间动力学，与受精后MajSats上异色特征的获取有关。DNA-FISH与组蛋白修饰和HP1β的分析不兼容，因为我们注意到，与单独的免疫染色相比，DNA-FISH后几种组蛋白修饰的免疫染色图谱和HP1α受到干扰，可能是由于FISH使用除寡核苷酸以外的探针所需的变性条件（数据未显示）。因此，为了定位胚胎中的着丝粒周围染色质，我们使用了GFP标记的多指ZF，该ZF能特异识别MajSat序列（另见下文）(Lindhout等人，2007年). 重要的是，ZF-GFP显示了与使用MajSat探针在DNA-FISH上获得的着丝粒周围重复序列相同的定位模式，从雄性原核中心向NLB周围的组织逐渐去凝聚成环状，这与以前的报告一致(图1A、B；Martin等人，2006年a；Probst等人，2007年). 雌性原核也显示出NLB周围预期的重组模式(图1A、B). 在早期的双细胞期胚胎中可以清楚地看到完整的环状组织(图1A、B).

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图1。

在获得异色特征之前，着丝粒周围的染色质定位在核仁周围。(A类)DNA-FISH用于主要和次要卫星重复。图中显示了受精后立即出现的代表性合子（早期，PN0–1）以及随后阶段（中期和晚期）和早期双细胞阶段胚胎。显示了雄性和雌性原核共焦切片的完整投影。(左侧)带有着丝粒区域和探针色码的小鼠染色体示意图。（PN0）原核0期；（PN1）原核1期等Bar，2μm。(B类)使用ZF设计的着丝粒周围染色质定位的时间动力学。在受精时微量注射编码ZF靶向MajSats融合GFP（ZF-GFP）的mRNA，并在指定时间分析胚胎。所示为共焦Z系列的最大投影，如所示A类注意，ZF-GFP模式忠实地再现了DNA-FISH获得的模式（黄色标签A类). 棒材，2μm。(C类)在获得父系染色质上的异色H3K27甲基化标记之前，在NLB周围定位MajSats。在早期（PN0–1）、中期（PN2–3）和晚期（PN4–5）合子中用H3K27me3抗体对ZF-GFP表达的胚胎进行免疫染色。所示为男性原核的代表性单共焦切片，带有H3K27me3、GFP和灰度DAPI通道，以及相应的合并图像。箭头指向NLB处MajSat重复序列的积累位置，最初缺少H3K27me3，随后在晚期合子中强烈积累H3K17me3。(D类)免疫染色分析C类但带有H3K27me1抗体。注意，H3K27me1与ZF-GFP共定位的尖锐信号只有在ZF-GFP信号集中在晚期（PN5）合子的NLB（箭头）周围时才会出现。(电子)在受精后期，HP1β在中性粒旁染色质上的积累发生在其在NLB周围的重新定位之后。中的分析C类和D类带有HP1β抗体。

虽然雌性染色质从卵子发生中继承了H3K27甲基化，但在受精后立即在父代原核上检测不到H3K27me3(Santos等人，2005年；Puschendorf等人，2008年；Santenard等人，2010年). 根据原核2–3期（PN2–3）合子的ZF-GFP信号判断，中合子期时，着丝粒周围区域定位于NLB周围的环中，未检测到H3K27me3水平(图1C). 值得注意的是，着丝粒周围染色质在此阶段之后获得H3K27me3，在原核晚期NLB周围清晰地检测到H3K17me3，与ZF-GFP信号共定位(图1C). H3K27me1和HP1β在合子中显示出更为分散的定位模式，但这两种异色标记与着丝粒周围染色质的富集仅在最晚的原核期检测到，在它们到达NLB周围的环状目的地后(图1D、E). 因此，在获得可检测的异色特征之前，着丝粒周围染色质定位在NLB周围的尖锐环中，这表明这种特定的核定位可能是沉默的先决条件。

为了解决着丝粒周围染色质的核定位是否是异染色质建立和随后沉默所必需的，我们旨在操纵MajSat在细胞核中的定位。为此，我们设计了一种方法，通过将上述ZF融合到emerin（核膜的一种成分），将着丝粒周围染色质栓系到核外周本特森和威尔逊2004). 靶向融合蛋白ZF-Eme有望通过ZF相互作用与MajSats结合，并通过emerin与核膜结合。我们选择核外围是因为它在基因调控中已知的潜在作用，并且因为它是胚胎中唯一明确确定的其他核空间。由于染色质免疫沉淀（ChIP）分析无法在胚胎中进行，我们使用瞬时转染NIH3T3作为额外的对照，以验证ZF与MajSats的结合。如ChIP分析所示，ZF-GFP融合与MajSat重复序列特别相关，但与SINE B1或IAP元素无关（补充图1A）。然后，我们在NIH3T3细胞中验证了ZF-Eme结构体和两个阴性对照物——ZF-GFP结构体和一个单独表达emerin（HA-Eme）的结构体。我们通过免疫染色证实，所有三种结构均在NIH3T3细胞中表达。如预期，ZF-GFP和HA-Eme控件分别定位于DAPI富集区和核外围（补充图1B）。与ZF-GFP构造相反，ZF-实体构造定位于核外围（补充图1B）。重要的是，ZF-Eme保留了与MajSat序列结合的特定能力，而不是仅与emerin结合，emerin不与MajSat或ChIP分析的任何其他重复序列结合（补充图1C）。

为了解决将ZF融合到emerin是否能有效地将着丝粒周围染色质连接到核外周，我们在表达ZF-Eme的胚胎中使用MajSat探针进行了3D DNA-FISH。我们在受精后立即显微注射ZF-GFP或ZF-Eme的mRNA，并分析两细胞阶段的胚胎。而ZF-GFP蛋白如预期的那样定位在NLB周围以及与NLB无关的一到两个色心中(Probst等人，2007年)，ZF-末端结构定位于双细胞期胚胎两个细胞核的核外围(图2A). 在大多数ZF-胚胎中，着丝粒周围染色质的定位模式受到严重影响，并在整个核膜上显示出斑点状斑点，而不是双细胞期对照胚胎中常见的环状和染色中心结构(图2B; 补充电影1-3）。MajSat的联合DNA-FISH分析和通过单个Z共焦切片对内源性拉明B的免疫染色显示，在ZF-Eme胚胎中，着丝粒周围染色质主要与拉明B共定位(图2C)，与此时ZF-Eme结构在核外围的定位一致(图2A). 在对照胚胎中，可以在NLB周围和拉明B区附近发现MajSats(图2C)在ZF-胚胎中，与核外周无关的MajSat信号的比例最小(图2C). 重要的是，MajSats与核外围的联系具有时间敏感性，因为与对照组相比，在晚期双细胞阶段表达相同的ZF-Eme结构不会导致MajSat在四细胞阶段向核外围的显著位移（数据未显示）。因此，我们在合子中的ZF-基因组方法可以有效地将着丝粒周围的染色质连接到核外周。

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图2。

ZF-Eme的表达导致着丝粒周围染色质在早期胚胎中有效地与核外周相连。(A类)使用GFP获取或HA抗体对微注射ZF-GFP和ZF-Eme的mRNA的两个细胞期胚胎进行免疫染色。点线描绘了细胞膜。显示了具有代表性的单共焦截面。棒材，2μm。(B类)胚胎中ZF-Eme的表达导致核外周着丝粒染色质的移位。用MajSat探针（绿色）处理显微注射了所示mRNA的胚胎进行3D DNA-FISH；DNA用DAPI（蓝色）染色。显示了完整的Z系列投影；补充电影1-3中显示了连续共焦截面。棒材，2μm。(C类)带有Lamin B抗体的免疫-DNA-FISH的代表性单共焦切片和表达所示蛋白的双细胞期胚胎的MajSat探针。相应单共焦段的RGB轮廓如正确的巴，2μm。

接下来，我们询问改变着丝粒周围染色质的定位是否会导致有缺陷的异色沉默。在合子中，MajSats的转录主要发生在雄性原核，这些转录物被认为是随后沉默和组织成体样染色中心结构所必需的，这种结构从双细胞晚期开始逐步发生(Puschendorf等人，2008年；Probst等人，2010年；Santenard等人，2010年). 因此，我们使用MajSat探针通过RNA-FISH分析胚胎，以检测双细胞期胚胎着丝粒周围染色质的新生转录。如预期的那样，未注射和ZF-GFP对照胚胎显示出一些转录焦点(图3A). 相反，ZF-Eme胚胎的RNA-FISH信号显著增加，表明与对照组相比，ZF-Eme胚胎的着丝粒周围染色质转录更活跃(图3A). MajSat转录位点数量的量化(图3B)以及他们的成绩单数量(图3C)研究表明，ZF-Eme胚胎的着丝粒周围重复序列的转录输出明显较高，这表明着丝粒附近染色质向核外周的重新定位导致异染色质沉默缺陷。此外，将端粒周围染色质转移到细胞核外围也会导致色心形成受损（补充图2）。

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图3。

将着丝粒周围染色质栓系到核外周会损害沉默和发育进程。(A类)RNA-FISH显示胚胎中表达所示mRNA的新生MajSat转录物（黄色）。显示了双细胞期的代表性细胞核。虚线划定了核膜。棒，5μm。(B类)通过RNA-FISH确定的MajSat转录位点数量的量化。非注射（ni）胚胎或表达ZF-GFP或ZF-Eme的胚胎在双细胞期进行分析。胚胎根据每个核的转录位点数量进行分组，如正确的（零个站点，一到五个站点之间，六到十个站点之间等）。为每个表达构建绘制了属于每个类别的胚胎百分比。(C类)非注射（ni）胚胎或表达ZF-GFP或ZF-Eme的胚胎中转录的MajSats总量的量化方框图。(D类)未注射胚胎或表达HA-Eme、ZF-GFP或ZF-Eme的胚胎的发育进展分析。将指示的mRNA微量注射到合子中。在发育3天后，对各组达到囊胚期的胚胎数量进行评分。n个表示每组分析的胚胎总数。

接下来，我们询问着丝粒周围染色质向核外周的募集是否影响发育进程。为此，我们一如既往地将ZF-GFP或HA-Eme mRNA作为对照和ZF-Eme mRNA注射合子。对于后两种结构，GFP mRNA被视为微量注射的阳性对照。与未注射对照胚胎相比，表达HA-Eme和ZF-GFP的胚胎发育速度和比率相似，其中83%到88%的胚胎形成囊胚，这是在这种操作中获得的常规值(图3D; 补充图3A）。相反，ZF-Eme的表达导致发育进展率显著降低，只有51%的胚胎达到囊胚期(P（P）=0.000001，Kruskal-Wallis检验）(图3D). 其余49%的胚胎在2和8世纪之间停止发育，类似于异染色质沉默缺陷的胚胎(Probst等人，2010年；Santenard等人，2010年). 重要的是，51%达到囊胚阶段的胚胎发育迟缓。我们还研究了表达ZF-基因组的胚胎是否显示分裂错误，如染色质滞后。与我们早期发现的异染色质形成缺陷一致(Santenard等人，2010年)，我们观察到ZF-Eme表达胚胎中滞后染色质的发生率很高（21%，而非注射、ZF-GFP和HA-Eme分别为6%、3%和7%）（补充图3B）。因此，受精后将内源性着丝粒周围染色质靶向核外周会损害发育进程。这种发育表型是否仅仅是由于着丝粒周围染色质的沉默缺陷和/或随后的动粒负载和有丝分裂进展缺陷，尚待确定。

为了解决将着丝粒周围染色质连接到核外周是否会改变基因表达，我们使用微流体生物标记方法分析了表达ZF-Eme的单个胚胎，这是一种稳健的定量方法，适合从低细胞数进行基因表达分析（补充图4；Guo等人，2010年). 我们特别关注以下基因：（1）在早期发育中发挥作用；（2）在两细胞和四细胞阶段之间合子激活；或（3）与着丝粒密切相关。所分析的基因包括看家基因、细胞周期相关基因、转录因子、染色质修饰物、信号蛋白、发育重要基因以及位于四条不同染色体（9、18、19和X）上着丝粒附近的基因（补充表1）。对于后一组基因，我们进行了计算机搜索或分析了细胞遗传学先前已知的着丝粒近端基因：Suv39h1号机组,Suv420h1号机组,Yap1号机组,Gata6公司、和岩石1我们同时分析了10个生物重复和3个技术重复中所有41个基因的表达水平。我们发现，在未注射胚胎、表达ZF-GFP的胚胎和表达ZF-Eme的胚胎中，基因表达没有显著变化（补充图4、5）。

最后，我们询问MajSats与核外围的结合是否会导致异色标记的缺陷积累，这可能解释了它们转录活性的增加。为此，我们分析了表达ZF-Eme的胚胎中的H3K27me3和Ring1b(Puschendorf等人，2008年；Santenard等人，2010年). 免疫染色显示，与对照组相比，大多数ZF-Eme胚胎显示Ring1b的异常定位(图4A; 补充图6）。我们使用DNA-FISH和免疫染色，然后进行3D重建，确定MajSats与H3K27me3和Ring1b在3D中的共定位(图4A、B). 对MajSats中H3K27me3/环1b的共定位体积进行量化显示，与对照组相比，ZF-Eme胚胎中MajSat上两个异色标记的累积减少(图4C). 这些数据表明，受精后将MajSats连接到核外周会削弱这些沉默标记向着丝粒周围染色质的有效补充。

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图4。

着丝粒周围染色质对核外周的栓系作用导致H3K27me3和Ring1b的积累减少。(A类,B类)H3K27me3染色的早期双细胞非注射、ZF-GFP和ZF-Eme胚胎的免疫-DNA-FISH的典型共焦图像(A类)和环1b(B类). MajSats的DNA-FISH信号为黄色，虚线表示核膜。所示为代表性原子核Z系列采集的单个共焦截面(n个=26个未注射胚胎；n个=19个胚胎用于ZF-GFP；n个=20个胚胎（对于ZF-Eme）。注意，对于这些实验，DNA-FISH是用寡核苷酸探针进行的。(C类)H3K27me3和Ring1b共占主要卫星数量的量化（百分比）。晶须图显示了中间值和最小-最大范围。（n.s.）不重要；(**)P（P）<0.05（方差分析，土耳其的多重比较）。

我们报告的异染色质形成缺陷表明，胚胎核组织是表观遗传重编程的关键因素，胚胎核的独特组织具有调节作用。关于核移植后克隆效率与获得NLB-like组织相关的观察(Martin等人，2006b)进一步强调这种重组的独特性，并指出对异染色质进行重新编程以恢复全能性的必要步骤。

与通常在体细胞中发现的核组织模式相反，大多数基因丰富的染色体位于中心，基因贫乏的区域靠近核外围(Boyle等人，2001年)，对牛胚胎的研究表明，在胚胎基因组激活的主要浪潮之前，染色体区域的基因密度和径向定位之间没有相关性(Koehler等人，2009年). 在人类细胞中，将转基因重新定位到核外周会改变基因表达(Finlan等人，2008年)但在分化细胞中，细胞核外围被认为是一个压抑的环境，可能是通过维持低乙酰化染色质。我们的结果表明，早期胚胎的核组织似乎与分化细胞的核组织在功能上有所不同。

核空间内其他染色质区域和一般胚胎染色质区域的全球动力学是否与体细胞的全球动力学存在差异，以及特定组蛋白修饰是否会在这种区域化中发挥作用，还有待确定。我们的数据表明，受精后事件的时间顺序和异染色质在3D核空间中的定位受到严格调节，并平行发挥作用，以确保异染色质沉默和随后的发展。这为决定哺乳动物异染色质形成的分子级联事件增加了核重组。

材料和方法

鸣谢

脚注

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