生物化学杂志。 作者手稿； PMC 2013年7月19日提供。
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美国国立卫生研究院： NIHMS484670标准
中性鞘磷脂酶2（nSMase2）是肿瘤坏死因子激活的主要中性鞘磷脂同工酶亚型- α 在MCF-7细胞中 美国南卡罗来纳医科大学生物化学和分子生物学系，查尔斯顿，SC 29425
补充资料 GUID:992CF733-C704-49C4-BBCB-CE388F150097
摘要 N-SMase（中性鞘磷脂酶）的激活是细胞因子如TNF（肿瘤坏死因子）反应的一个既定部分- α 然而，目前尚不清楚哪些当前克隆的N-SMase亚型（nSMase1、nSMase2和nSMase3）与该活性有关。 在MCF-7细胞中，我们发现TNF- α 诱导晚期（而非早期）N-SMase活性增加，nSMase2是激活的主要亚型，很可能是通过转录后机制激活的。 令人惊讶的是，在多个细胞系中过度表达标记或未标记的nSMase3对 在体外 N-SMase活性。 此外，只有nSMase2的过度表达，而非nSMase1或nSMase3的过度表达对细胞鞘磷脂水平、神经酰胺增加和鞘磷脂减少有显著影响。 此外，只有siRNA（小干扰RNA）敲除nSMase1后，基础基因表达水平显著降低 在体外 MCF-7细胞的N-SMase活性，而nSMase2而非nSMase3 siRNA抑制TNF- α -诱导活性。 综上所述，这些结果确定nSMase2是主要的TNF- α -MCF-7细胞中的反应性N-SMase。 此外，结果表明nSMase3可能不具备 在体外 N-SMase活性，不影响评估细胞系中的细胞鞘脂水平。 另一方面，nSMase1有助于 在体外 N-SMase活性，但对细胞鞘脂影响不大。
关键词： 神经酰胺、细胞因子、中性鞘氨醇酶2（nSMase2）、中性鞘磷脂酶3（nSMse3）、鞘氨醇髓鞘酶、肿瘤坏死因子- α （TNF- α )
简介 神经酰胺是一种生物活性鞘脂，与多种生理过程有关，可通过多种途径产生[ 1 ]。 其中，由鞘磷脂酶催化的鞘磷脂水解被认为是应激诱导神经酰胺生成的主要途径 2+ -依赖性N-SMases（中性SMases）被认为是介导神经酰胺细胞因子效应的有力候选酶。 值得注意的是，尽管有大量文献研究内源性N-SMase活性的作用和调节[ 2 ]克隆的N-SMase蛋白的生理作用尚未完全阐明。
目前，已鉴定出四种哺乳动物N-SMase，分别命名为nSMase1、nSMase2、nSMse3和MA-nSMase（线粒体相关nSMase）[ 三 – 6 ]。 尽管所有四种蛋白质都被报道含有 在体外 N-SMase活性，只有nSMase2、nSMase3和MA-nSMase似乎具有 体内 活性，即在过度表达时增加神经酰胺和降低SM水平[ 4 – 6 ]。 相反，当nSMase1在细胞中过表达时，它被发现作为溶血血小板活化因子磷脂酶C，但对鞘脂代谢没有影响[ 7 ]。 尽管如此，最近的研究表明，nSMase1可能作为 体内 N-SMase在某些情况下[ 8 ]。 值得注意的是，多个克隆的N-SMase的存在与之前关于多个N-SMases活性的报道密切相关[ 9 ]。 在这四种蛋白质中，MA nSMase、nS-Mase1和nSMase2属于N-SM酶的扩展家族，是DNA酶超家族的一个子集，包括细菌SM酶和酵母SM酶ISC1( 酿酒酵母 )和CSS1( 葡萄裂殖酵母 ; 已在中审阅[ 10 ]). 所有家族成员都有一个共同的催化核心，由其催化区域中的保守残基表示。 另一方面，nSMase3与nSMase1、nSMase2或MA-nSMase几乎没有同源性，并且缺少N-SMase家族的保守催化核心残基[ 5 ]。 此外，由于nSMase3从低级到高级哺乳动物似乎具有高度的进化保守性，因此nSMase 3可能包含具有特定功能的独特N-SMase家族。 另一方面，nSMase1和nSMase2双基因敲除小鼠没有 在体外 脑、肝或骨提取物中的N-S酶活性[ 11 ]。 因此，nSMase3可能具有有限的组织特异性功能； 事实上，nSMase3在心脏和骨骼肌组织中的表达最高[ 5 ].
肿瘤坏死因子- α 是一种多效性细胞因子，对炎症和细胞死亡很重要[ 12 ]。 过去20年的大量研究表明，N-SMases是TNF的重要组成部分- α 响应[ 2 ]。 事实上，据报道，nSMase2和nSMase3都被TNF激活- α [ 4 , 5 , 13 – 16 ]nSMase2与急性TNF有关- α -诱发炎症[ 13 , 14 ]、TNF- α -诱导有丝分裂反应[ 15 ]和TNF- α -突触的诱导调节[ 16 ]。 相反，尽管据报道受TNF监管- α 在MCF-7细胞和HT-29细胞中，nSMase3在TNF中的作用- α 回答不完全清楚[ 5 , 17 ]。 据报道，nSMase3位于FAN（与N-SMase活性相关的因子）的下游[ 5 ]，它可能与先天免疫反应和溶酶体生物发生等相关生理学有关[ 18 , 19 ]。 然而，据报道，nSMase2也位于FAN下游[ 20 ]。 这表明nSMase2和nSMase3可以在TNF中发挥互补作用- α 或者，可以相互竞争相同的信号通路。 然而，到目前为止，nSMase2和nSMase3对TNF的相对贡献- α -诱导的N-SMase活性尚未被研究。
在本研究中，我们试图确定主要的TNF- α -激活MCF-7细胞中的N-SMase。 我们通过过度表达和siRNA（小干扰RNA）方法提供证据，证明nSMase2是主要的TNF- α -该细胞系中的反应性亚型。 除此之外，我们也无法证明 在体外 或 体内 多个细胞系中nSMase3瞬时或稳定过度表达的N-S酶活性。 此外，MCF-7细胞中nSMase3的siRNA敲除对基础或TNF没有显著影响- α -诱导的 在体外 N-SMase活性。 总之，这些结果表明nSMase2是主要的TNF- α -激活了MCF-7细胞中的N-SMase，表明nSMase3可能不是主要的N-SMse功能。
材料和方法 材料 MCF-7、HEK（人类胚胎肾）-293和A549细胞均取自A.T.C.C.RPMI 1640、MEM（最小必需培养基）和DMEM（Dulbecco改良Eagle's培养基）培养基，FBS（胎牛血清）、杀鼠素s HCl、上标逆转录酶和V5单克隆抗体取自Invitrogen。 HRP（辣根过氧化物酶）标记的二级抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。 ECL（增强化学发光）试剂盒来自ThermoScientific。 猪脑SM和磷脂酰丝氨酸来自Avanti Polar Lipids。 [胆碱- 甲基 - 14 C] SM由美国南卡罗来纳州查尔斯顿市南卡罗莱纳医科大学脂质组学核心的A.Bielawska博士获得。人类TNF- α 来自Peprotech。 除非另有说明，否则所有其他化学品均来自Sigma。
质粒 pRK–nSMase3，如前所述[ 5 ]由M.Kronke博士和K.Wiegmann博士（德国科隆大学医学中心医学微生物学、免疫学和卫生学研究所）慷慨提供。 为了产生标记的结构，通过PCR（正向引物，5′-ATGACTTCGGCGCCGTG-3′；反向引物，5'-GGGCTGGCAGCTCCCCCG-3′）扩增nSMase3，并将其亚克隆到pEF6/V5/TOPO载体（Invitrogen）中，将V5标记放置在C末端。 构造在使用前已排序。 前面已经描述了nSMase1和nSMase2结构[ 7 , 13 ]也在pEF6/V5/TOPO载体中。
细胞培养和转染 所有细胞在37°C、5%CO、含10%FBS的培养基中生长 2 以及潮湿的空气。 A549细胞在高糖DMEM中培养，HEK-293细胞在MEM中保存，MCF-7细胞在RPMI 1640中保存。 为了进行转染，细胞接种在60mm（2×10 5 )或100-mm（4×10 5 )盘子。 24小时（MCF-7和A549细胞）或48小时（HEK-293细胞）后，根据制造商的说明使用效应试剂转染细胞（Qiagen）。 在收集用于活性测定之前转染细胞24小时，或在收集用于脂质分析之前转染细胞40小时。 为了产生稳定的细胞系，在转染24小时后，将细胞以1:5的比例传至含有10 μ g/ml速溶素。 在选择大约2-3周后，通过共焦显微镜对照V5标签评估表达效率。 在含有7 μ g/ml速溶素。 对于siRNA实验，细胞接种在60mm（1.5×10 5 )盘子。 24小时后，根据制造商的方案（Invitrogen），使用寡病毒胺转染细胞20 nM阴性对照（AllStar；Qiagen）、nSMase1、nSMse2或nSMase3 siRNA（Qiangen）。 30小时后，在刺激前将细胞在新鲜培养基中培养1-2小时。 前面已经描述了nSMase2的siRNA[ 13 ]，而nSMase1的siRNA是针对靶序列5′-CCAGAGAGGGTCGCCGTTGA-3′设计的，而nSMase3是针对靶序列5′-CCCCACAGTGGTTTGCTAAGA-3′设计的。
实时PCR 刺激后，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取MCF-7细胞的mRNA。 A部分（0.5–1 μ g） 用上标II试剂盒（Invitrogen）合成cDNA。 实时RT（逆转录）-PCR在Bio-Rad iCycler检测系统上使用iQ SYBR Green supermix（Bio-Rad）进行。 标准反应体积为25 μ l含12.5 μ 超模的l，6.5 μ l蒸馏水（Sigma）、100–500 nM寡核苷酸引物（IDT）和5 μ 1个cDNA模板（在分子生物学级蒸馏水中稀释×12）。 RT-PCR的初始步骤是在50°C下2分钟进行UNG擦除激活，然后在95°C下保持3分钟进行酶激活。 对于所有底漆，循环( n个 =40）包括98°C下10 s熔体，然后在55°C下45 s退火，在68°C下延伸45 s。 最后一步是55°C孵育1分钟。所有反应均一式三份，阈值循环阈值( C类 t吨 )所有样品的分析设定为0.15相对荧光单位。 数据被归一化为内部控制基因actin，以控制RNA制备。 单个PCR产物的分析通过熔化曲线分析得到证实。 所用引物为：nSMase1-sense，5′-GGTGCTCACGCTATGTG-3′； nSMase1-反义，5′-CGTCTGCCTTGTGGTG-3′； nSMase3-义，5′-GCCACGACCAGAGATC-3′； nSMase3-反义，5′-GCGTGGAACTGCTGAG-3′； actin-sense，5′-ATTGGCATGAGCGTTCC-3′； 肌动蛋白反义，5′-GGTA-GTTCGGATGCACA-3′。
免疫印迹 如前所述，利用标准凝胶系统（Bio-Rad）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）制备并分析蛋白质样品[ 13 ].
免疫荧光和共焦显微镜 如前所述，通过间接免疫荧光和共焦显微镜分析nSMase1、nSMase2和nSMase3转染HEK-293细胞[ 13 ].
液相色谱-串联质谱法分析鞘磷脂 为了进行脂质分析，细胞在含有0.1%BSA的无血清培养基中培养3-4小时。饥饿后，将细胞清洗并刮到冰镇PBS中，造粒并储存在−80°C下。 如前所述，从细胞颗粒中提取脂质，并通过LC-MS/MS分析神经酰胺、SM和二氢神经酰胺[ 21 ]。 脂质测量值被归一化为总磷酸脂，测量方法如[ 21 ].
统计分析 除非另有说明，否则数值以平均值±S.E.M.表示。 为了比较两组，一个未配对的学生 t吨 测试用于 P（P） <0.05被认为具有统计学意义( n个 )如图所示。 为了比较多个组，使用了单因素方差分析和Dunnet的事后检验 P（P） <0.05被视为具有统计学意义和数量( n个 )如图所示。
结果 TNF公司- α 增加MCF-7细胞中的N-SMase活性，但不增加nSMase1、nSMase2或nSMase3的表达 先前的研究报告了不同细胞类型中N-SMase的早期和晚期激活[ 4 , 5 , 13 – 16 , 22 ]。 为了阐明MCF-7细胞中的这一点，我们进行了短时间和长时间的刺激，并评估了内源性N-SMase活性。 TNF对MCF-7细胞的急性刺激作用- α （50 ng/ml）对N-SMase活性没有显著影响( ). 同样，更剧烈的TNF刺激- α （0-5分钟）对N-SMase活性也没有显著影响( ). 相比之下，更长的TNF- α 刺激（14h）显著增加内源性N-SMase活性（33±4%）； )，与之前的研究一致[ 4 , 22 ]。 为了确定这是否是由于转录调控，TNF的影响- α 研究了nSMase1、nSMase2和nSMase3的表达( ). 结果表明TNF无显著影响- α 在nSMase2或nSMase3表达式上。 此外，TNF- α 诱导nSMase1表达少量增加。 然而，使用Bonferroni事后检验进行的双向方差分析表明，这在统计学上并不显著( P（P） > 0.05). 综上所述，这表明长期而非急性TNF- α 刺激增加MCF-7细胞中的N-SMase活性，这可能是通过转录后机制实现的。
TNF公司- α 通过转录后机制刺激MCF-7细胞中晚期N-SMase活性 ( A类 – C类 )将MCF-7细胞接种，24小时后用TNF刺激- α （50 ng/ml），如图所示( A类 , B类 )或持续14小时( C类 ). 测定N-SMase活性 在体外 如材料和方法部分所述。 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性(* P（P） <0.05时， n个 =4）。 ( D类 )将MCF-7细胞接种并用TNF刺激- α （50 ng/ml）持续14 h。按照材料和方法一节所述，通过实时PCR评估nSMase1、nSMase2和nSMase3的表达。 结果为平均值±S.E.M.归一化表达式。 对于( D类 )，结果通过双向方差分析和Bonferroni事后检验进行分析（ns=不显著， n个 =5）。
TNF公司- α 增加过度表达的nSMase2的活性，但不增加nSMase1或nSMase3的活性 TNF对N-SMase活性的调节- α 似乎是翻译后的，利用过表达的方法来探测克隆的nSmase中的哪一个负责。 因此，用空载体nSMase1、nSMase2或nSMase3瞬时转染MCF-7细胞10–12小时，并用TNF刺激- α 持续14小时并评估 在体外 N-SMase活性( ). 与早期研究一致[ 三 , 4 ]在没有刺激的情况下，nSMase1和nSMase2过度表达显著增加了N-SMase活性。 令人惊讶的是，nSMase3的过度表达对基础的N-SMase活性几乎没有影响( ). 如预期，TNF- α 载体转染细胞活性显著提高（30±6%； )与上述结果一致，但nSMase1活性降低（15±10%），尽管这在统计学上并不显著。 相反，TNF显著增加了过度表达的nSMase2的活性- α (66 ± 20 %). 此外，TNF激活nSMase2- α 趋向于高于在病媒控制细胞中观察到的水平，尽管这在统计学上并不十分显著。 另一方面，在nSMase3转染细胞中，TNF- α 还增加了N-SMase活性。 然而，考虑到nSMase3的过度表达似乎不会影响基础活性，并且观察到的增加与载体转染细胞中的增加相当（20±6%， n个 = 4; P（P） >0.15），这可能反映了内源性N-SMase活性（如 ). 综上所述，这些结果表明nSMase2是主要的TNF- α -激活MCF-7细胞中的N-SMase。
TNF公司- α 增加MCF-7细胞中过度表达的nSMase2的活性 在用载体（PBS）或TNF刺激之前，用空载体nSMase1、nSMase2或nSMase3转染MCF-7细胞12小时- α （50 ng/ml）持续14小时。测定N-SMase活性 在体外 如材料和方法部分所述。 ( A类 )nSMase1、nSMase2和nSMase3过度表达对N-SMase活性的影响。 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性(* P（P） <0.05时， n个 =4）。 ( B类 )TNF的影响- α 载体中N-SMase活性，nSMase1-、nSMase2-or-nSMase3-过度表达细胞。 (* P（P） <0.05时， n个 =3）结果，表示为TNF的折叠变化- α 车辆上，为平均值±S.E.M(* P（P） <0.05时， n个 = 4).
在A549、HEK-293和MCF-7细胞中过度表达V5–nSMase3或pRK–nSMse3对N-SMase活性没有影响 在我们之前的实验中，nSMase3过度表达对 在体外 MCF-7细胞中的N-SMase活性。 然而，免疫印迹分析表明，MCF-7细胞中V5–nSMase3的表达明显低于nSMase1和nSMase2（结果未显示）。 因此，为了进一步探讨nSMase3对N-SMase活性的影响，我们对0、1、2、3和5进行了分级转染 μ g的V5–nSMase3，以确保实现最佳转染。 此外，为了确定低表达不仅仅是MCF-7细胞的结果，在HEK-293和A549细胞中进行了类似的转染。 在所有三种细胞系中都清楚地观察到V5–nSMase3的存在( )尽管在不同转染浓度下V5–nSMase3蛋白存在显著差异。 然而，尽管存在明显的nSMase3，但在HEK-293、MCF-7或A549细胞中未观察到N-SMase活性的显著变化( ; P（P） > 0.1). 综上所述，这表明V5标记的nSMase3不具备 在体外 在这些细胞系中表达的N-SMase活性。
V5–nSMase3在HEK-293、MCF-7和A549细胞中的分级转染 将HEK-293、MCF-7和A549细胞按照V5–nSMase3的指示转染24 h。通过免疫印迹分析细胞裂解液中V5–n SMase3表达。 所示的印迹代表每个细胞系至少四个免疫印迹。
表1 分级V5–nSMase3转染对HEK-293、A549和MCF-7细胞N-SMase活性的影响 用所示质粒量转染细胞或模拟转染细胞。 测定N-SMase活性 在体外 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性（神经酰胺pmol/mg/h蛋白质）。 n个 =实验次数。
转染 HEK-293细胞( n个 = 5) A549电池( n个 = 4) MCF-7细胞( n个 = 4) 嘲弄 6.61 ± 1.31 7.59±1.51 7.23 ± 1.46 V5–nSMase3版本( μ g） 1 7.26 ± 1.29 7.71 ± 1.63 6.83 ± 1.11 2 7.36 ± 1.26 6.61 ± 1.28 7.00 ± 1.19 三 8.19 ± 0.71 6.33 ± 0.80 7.05±1.14 5 7.15 ± 1.35 6.99 ± 0.66 7.14 ± 1.31
为了证实这些发现并确保V5标签不会对酶的活性产生不利影响，对未标记的nSMase3（pRK–nSMase3[ 5 ])在相同的三个细胞系中进行 在体外 评估N-SMase活性。 与V5–nSMase3一样，pRK–nSMse3的转染对 在体外 三种细胞系中任何一种转染浓度下的N-SMase活性( ; P（P） > 0.1). 综上所述，这表明瞬时nSMase3表达不会增加 在体外 N-SMase活性。
表2 分级pRK–nSMase3转染对HEK-293、A549和MCF-7细胞N-SMase活性的影响 用所示质粒量转染细胞或模拟转染细胞。 测定N-SMase活性 在vitr中 o.结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性（神经酰胺pmol/mg/h蛋白质）。 n个 =实验次数。
转染 HEK-293细胞( n个 = 5) A549电池( n个 = 4) MCF-7细胞( n个 = 4) 嘲弄 6.61 ± 1.31 8.64 ± 1.44 10.33 ± 1.00 pRK–nSMase3( μ g） 1 6.64 ± 1.16 8.47 ± 0.85 10.67 ± 1.03 三 6.80 ± 1.56 8.52 ± 1.14 10.54 ± 0.74 5 6.92 ± 1.66 8.36 ± 1.11 10.14 ± 0.82
nSMase1和nSMase2（而非nSMase3）的稳定过表达增加 在体外 HEK-293细胞中的N-SMase活性 瞬时转染实验表明，nSMase3可能不具备 在体外 N-SMase活性。 然而，如上所述，nSMase3的瞬时转染程度是高度可变的。 为了绕过这一点，产生了稳定表达V5标记的nSMase1（HEK-nSMase1）、nSMase2（HEK-nSMase2）、nSMase3（HEK-nSMase3）或空载体（HEK载体）的HEK-293细胞； 此外，为了避免克隆特异性效应的可能性，产生了多克隆群体。 共聚焦显微镜的表达验证证实了所有构建物的良好稳定转染（结果未显示）。 因此， 在体外 评估N-SMase活性。 正如预期的那样，与HEK载体相比，HEK-nSMase1和HEK-nSMase2细胞具有显著更高的N-SMase活性( ). 相反，稳定的nSMase3表达没有增加 在体外 N-SMase活性高于内源性活性。 结合上述结果，这进一步表明nSMase3不具备 在体外 N-SMase活性。
nSMase1和nSMase2（而非nSMase3）的稳定过表达增加 在体外 HEK-293细胞的活性与分析条件无关 将稳定表达载体（Vec）、nSMase1（NSM1或N1）、nSMase2（NSM2或N2）或nSMase3（NSM3或N3）的HEK-293细胞接种24小时 在体外 如材料和方法部分所述。 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性(* P（P） <0.05时， n个 =4）。 ( B类 )根据Krut等人描述的方法测定N-SMase活性[ 5 ]使用贴有标签的SM（热；浅灰色条）或既有标签又有未标记的SM（冷和热；深灰色条）。 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性(* P（P） <0.05时， n个 =4）。 ( C类 )通过免疫印迹（IB）分析V5的细胞裂解液中nSMase1、nSMase2或nSMase3的表达。 所示斑点是至少五种免疫印迹的代表。 右侧显示分子质量标记（单位：kDa）。
为了确定检测条件对nSMase3没有不利影响并“掩盖”其活性，在与描述酶特性的研究中使用的检测条件相同的检测条件下，对稳定细胞系重复进行实验[ 5 ]。 对于这些实验，只有标记的SM被添加到分析中。 然而，由于我们担心SM水平可能过低，无法最佳检测酶活性，因此也对标记和未标记的SM进行了重复实验（总浓度，10 μ M； 相当于6.7 mol%，接近 K（K） 米 基底）。 值得注意的是，在HEK-nSMase2细胞的实验中，显著超过所给底物的10% 在体外 水解； 因此反应动力学可能发生了改变。 这可能是由于免疫印迹法显示HEK-293细胞中的高表达( )； 尽管如此，这证实了该分析的有效性。 重要的是，与HEK载体相比，HEK-nSMase1细胞中的N-SMase活性也显著升高( ; P（P） < 0.05). 然而，与HEK载体相比，HEK-nSMase3细胞的N-SMase活性没有显著差异( ). 如上所述，免疫印迹分析表明，稳定的HEK-nSMase2细胞的蛋白质表达显著高于稳定的HEK-nSMase1或HEK-nSMase3细胞。 然而，结果也表明，nSMase1和nSMase3在这些实验中的表达非常相似( ). 事实上，如果有的话，nSMase1的表达低于nSMase3。 尽管如此，只有nSMase1能够显著增加N-SMase活性。 这证实了SMase分析在低表达水平下的敏感性，并进一步表明，与nSMase1和nSMase2不同，nSMase3不具备 在体外 N-SM酶活性。
短暂稳定的nSMase3转染对MCF-7细胞鞘磷脂水平无影响 尽管nSMase3没有 在体外 研究表明，nSMase3可以调节细胞内鞘磷脂的水平[ 17 ]。 这表明nSMase3可能通过另一种机制间接影响鞘脂水平。 为了探索这一点，我们使用了瞬时和稳定的过度表达方法。 最初，用载体nSMase2或nSMase3瞬时转染MCF-7细胞40小时，然后用MS分析SM和神经酰胺的水平，并将其归一化为总脂磷水平。 正如预期的那样，nSMase2过度表达显著增加了总神经酰胺水平( )SM水平随之下降，尽管后者由于细胞内SM质量较大，在统计学上并不显著( ). 相反，nSMase3并没有显著改变神经酰胺或SM的水平( ). 综合起来，这些结果与 在体外 上述结果表明，nSMase2而非nSMase3具有SMase活性。
MCF-7细胞中V5–nSMase2而非V5–nSMase3的短暂过表达改变了细胞鞘脂水平 用载体V5-nSMase2或V5-nSMase3瞬时转染MCF-7细胞40 h( A类 )和神经酰胺( B类 )如材料和方法一节所述，使用LC-MS/MS分析水平。 脂质水平归一化为总磷酸脂。 结果表示为脂质pmol/磷酸盐nmol，为平均值±S.E.M(* P（P） <0.05时， n个 = 4).
为了利用稳定转染巩固这些发现，利用HEK载体作为对照，分析了HEK-nSMase1、HEK-nSMase2和HEK-nMase3稳定细胞系中的SM和神经酰胺水平。 结果表明，神经酰胺水平在HEK-nSMase2细胞中显著增加，在HEK-n SMase1细胞中略有增加。 相反，与HEK载体相比，HEK-nSMase3细胞中神经酰胺水平没有变化( ). 与这些结果一致，HEK-nSMase2细胞的SM水平显著低于载体对照。 相反，HEK-nSMase1和HEK-nSMase3细胞的SM均无统计学意义的变化( ). 通过计算不同细胞系的神经酰胺/SM比率对这些发现进行进一步分析，结果表明，与载体控制相比，只有HEK-nSMase2细胞表现出显著改变( 补充图S1 在 http://www.BiochemJ.org/bj/435/bj4350381add.htm ). 相比之下，HEK-nSMase1细胞的比率略高，但在统计学上并不显著。 同样，HEK-nSMase3细胞中的神经酰胺/SM比率也没有显著差异。
在HEK-293细胞中过度表达nSMase2而非nSMase1或nSMase3会改变细胞鞘脂水平 将稳定表达载体nSMase1（NSM1）、nSMase2（NSM2）或nSMase3（NSM3）的HEK-293细胞接种48 h( A类 )和神经酰胺( B类 )如材料和方法一节所述，使用LC-MS/MS分析水平。 脂质水平归一化为总磷酸脂。 以脂质pmol/磷酸盐nmol表示的结果为平均值±S.E.M(** P（P） < 0.01, n个 = 3). ( C类 )用nSMase1、nSMase2或nSMase3瞬时转染HEK-293细胞24小时。转染效率通过间接免疫荧光和共聚焦显微镜测定，蛋白表达通过免疫印迹测定，如材料和方法部分所述。 共聚焦图像代表四个独立实验中每个实验中至少五个场； 免疫印迹是四个独立实验的代表。 分子质量标记（以kDa为单位）显示在左侧。 ( D类 )用nSMase1、nSMase2或nSMase3瞬时转染HEK-293细胞48 h。用LC-MS/MS分析细胞神经酰胺水平。结果是平均值±S.E.M.总神经酰胺水平归一化为总磷酸脂。 (** P（P） <0.01，采用Dunnet事后检验的单因素方差分析， n个 = 4).
尽管这些结果表明nSMase3不能调节细胞鞘脂，但这些实验的一个缺点是这三种亚型在各自细胞系中的差异表达明显，nSMase2的表达明显高于nSMase1或nSMase 3。 为了避免这个问题，利用瞬时转染在HEK-293细胞中重复实验，如上述MCF-7细胞( ). 然而，为了获得所有亚型的可比表达，每个构建体的不同数量的DNA被转染。 间接免疫荧光和共焦显微镜证实，所有三种构建物转染效率相似( )并证明这三种亚型的表达比在稳定转染体中观察到的表达更接近( ). 重要的是，尽管表达相同，但与对照组相比，只有nSMase2过度表达显著增加神经酰胺水平( ). 此外，转染任何一种N-SMase后，SM水平没有显著差异，尽管在过度表达nSMase2的细胞中，SM水平往往较低（结果未显示）。 这些结果与在瞬时转染的MCF-7细胞中观察到的结果非常吻合，综合起来，表明nSMase2过度表达足以调节SM和神经酰胺水平，但nSMase3不能直接或间接调节鞘脂水平。
nSMase2的过度表达对HEK-293细胞中多种神经酰胺/SM的调节 上述关于总神经酰胺和SM水平的结果显示了nSMase1、nSMase2和nSMase3过度表达的差异效应。 然而，尽管总神经酰胺或SM水平可能没有净变化，但这可能是个别神经酰胺/SM物种反向调节的结果，即某些物种的增加被其他物种的减少“抵消”。 因此，在稳定的HEK-293细胞系中分析SM和神经酰胺种类，并在用载体nSMase1、nSMase2或nSMase3瞬时转染HEK-292细胞后分析神经酰胺种类( ). nSMase2的过度表达增加了许多神经酰胺物种，包括长链（C 14 ，C 16 ，C 18 和C 18:1 )和超长链（C 24 和C 24:1 )神经酰胺，尽管随着稳定的过度表达，这些作用更加明显( )与瞬时过表达相比( ). 与此一致，在稳定的nSMase2过度表达后，相应的SM物种减少( ). 与此相反，nSMase1过度表达诱导了C 16 ，C 18 和C 24比1 神经酰胺，但对SM水平没有重大影响。 最后，nSMase3的过度表达对所分析的任何神经酰胺或SM物种都没有显著影响。
在HEK-293细胞中过度表达nSMase2而非nSMase1或nSMase3改变了多种SM和神经酰胺的水平 ( A类 )用nSMase1、nSMase2或nSMase3瞬时转染HEK-293细胞48小时，并按照材料和方法部分所述，通过LC-MS/MS分析多种神经酰胺的水平。 结果是将平均值±S.E.M.神经酰胺水平归一化为总脂磷( n个 =4）。 ( B类 和 C类 )将稳定表达载体nSMase1（NSM1）、nSMase2（NSM2）或nSMase3（NSM3）的HEK-293细胞接种48 h( B类 )和SM( C类 )通过LC-MS/MS对物种进行分析。将脂质水平归一化为总脂磷。 结果表示为脂质pmol/磷酸盐nmol，为平均值±S.E.M( n个 = 3).
nSMase3的siRNA敲除对MCF-7细胞的内源性N-SMase活性没有影响 迄今为止，在文献和本研究中，只有nSMase3过表达被用作研究该酶的工具。 相反，内源性nSMase3表达的siRNA敲低对N-SMase活性的影响尚未被研究。 为了巩固上述过度表达结果，我们检测了nSMase1、nSMase2和nSMase3 siRNA对MCF-7细胞中N-SMase活性的影响。 确定了nSMase1、nSMase2和nSMase3 siRNA的功效，发现它们都能使各自靶点的mRNA水平显著降低至少50%( ). 值得注意的是，nSMase1 siRNA显著降低MCF-7细胞的基础N-SMase活性约60±5%。 ( ). 然而，nSMase2和nSMase3 siRNA均未对基础N-SMase活性产生显著影响，因此，当测量次级融合MCF-7细胞的大多数内源性N-SMase活性时 在体外 由于nSMase1。
nSMase1、nSMase2和nSMase3 siRNA对基础和TNF的影响- α -MCF-7细胞的刺激活性 ( A类 )用阴性对照（AllStar）、nSMase1、nSMse2或nSMase3 siRNA转染MCF7细胞72小时。按照材料和方法一节中的描述，通过实时PCR评估nSMse1、nSMase2和nSMase2的表达。 结果以阴性对照（AStar）的百分比表示，为平均值±S.E.M(** P（P） < 0.01, n个 = 3)( B类 )用阴性对照物（AllStar）、nSMase1、nSMse2或nSMase3 siRNA转染MCF-7细胞72小时 在体外 如材料和方法部分所述。 结果为平均值±S.E.M.N-SMase活性(** P（P） < 0.01, n个 =4）。 ( C类 )用阴性对照（AStar）、nSMase2或nSMase3 siRNA转染MCF-7细胞60 h，并用载体（PBS）或TNF刺激- α （50 ng/ml）持续14 h。测定N-SMase活性 在体外 .结果，表示为TNF的折叠变化- α 车辆上，为平均值±S.E.M(** P（P） <0.01，至少三个独立实验）。
敲除nSMase2（而不是nSMase1或nSMase3）会降低TNF- α -MCF-7细胞中诱导的N-SMase活性 确定哪些N-SMase有助于TNF- α -诱导活性，再次使用RNAi（RNA干扰）方法( ). 用阴性对照nSMase2或nSMase3 siRNA预处理细胞，用载体或TNF刺激- α 持续14小时并评估 在体外 N-SMase活性。 TNF公司- α 阴性对照siRNA细胞中的N-SMase活性显著增加（26±6%），尽管与非iRNA转染细胞相比，这些反应有些迟钝( ). 重要的是，nSMase2 siRNA预处理显著抑制TNF- α -与阴性对照细胞相比，诱导增加（1±1%； P（P） < 0.01). 相反，nSMase3 siRNA对TNF没有显著影响- α 与阴性对照siRNA处理细胞相比，N-SMase活性的激活（26±7%）。 综上所述，这些结果证实了肿瘤坏死因子激活了nSMase2而非nSMase3- α 表明nSMase2是该细胞系中主要的TNF-反应性N-SMase。
讨论 据报道，N-SMases的激活是对多种刺激的反应，包括细胞因子、化疗药物和氧化应激[ 2 ]。 然而，随着多个克隆的N-SMase蛋白的鉴定，负责这些活性的人的身份并不总是清楚的。 在本研究中，我们研究了nSMase1、nSMase2和nSMase3对TNF的贡献- α -诱导MCF-7细胞的N-SMase活性。 我们发现，刺激诱导该细胞系中N-SMase活性的晚期而非早期增加，这主要是由于nSMase2。 值得注意的是，TNF- α nSMase2的激活可能通过转录后机制发生。 最后，我们还提供证据表明，通过短暂或稳定的过度表达或siRNA敲除来操纵nSMase3水平对这两种基因都没有显著影响 在体外 N-S酶活性或鞘脂水平。 综上所述，这使我们得出结论，nSMase3可能并不主要起SMase的作用。
TNF对内源性N-SMase活性的调节- α 在许多细胞系中已经建立[ 4 , 5 , 13 – 16 , 22 ]而且，自从克隆哺乳动物nSMase亚型以来，研究已经开始探讨它们的生理作用。 例如，nSMase2与A549细胞中粘附蛋白的诱导有关[ 13 ]，平滑肌细胞的有丝分裂反应[ 15 ]人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中内皮一氧化氮合酶（eNOS）的激活[ 14 ]和神经细胞中突触的调节[ 16 ]。 最近的研究发现，nSMase2通过蛋白EED（胚胎外胚层发育）与TNFR（TNF受体）结合蛋白FAN直接相互作用[ 20 ]从而确认nSMase2和TNFR之间的直接联系。 与nSMase2相比，尽管有报道称nSMase3是由TNF转录诱导的，但对其在TNF应答中的作用知之甚少- α 在HT-29细胞中[ 17 ]。 此外，据报道，当nSMase3在MCF-7细胞中表达时，它也位于FAN的下游[ 5 ]尽管还不清楚这是否通过上述nSMase2的类似机制发生。 综上所述，这些研究表明，nSMase2和nSMase3在TNF反应中可能具有互补、重叠或相反的作用。 然而，他们对TNF的相对贡献- α -诱导的N-SMase活性尚未得到解决。 在本研究中，我们发现TNF- α 诱导N-SMase活性的后期增加，这可能是通过翻译后机制实现的。 更重要的是，通过利用过表达和siRNA，nSMase2被鉴定为主要的TNF- α -在此系统中激活N-SMase。 与翻译后激活一致- α 能够激活过表达的nSMase2，但倾向于抑制过表达nSMase1的活性，尽管这在统计学上并不显著。 总的来说，这些结果与我们实验室早期的报告一致[ 4 ]。 这也与GW4869抑制TNF有关- α -MCF-7细胞中诱导的N-SMase活性[ 22 ]，因为GW4869也被发现抑制nSMase2 在体外 [ 4 ]。 作为TNF- α 未诱导MCF-7细胞内源性N-SMase活性的早期增加，本研究中未提及早期激活的N-SMases的身份。 然而，值得注意的是，许多其他研究报告称，这也可归因于A549细胞、HUVEC、小鼠胚胎成纤维细胞、平滑肌细胞和Jurkat细胞中的nSMase2[ 13 – 16 , 20 , 23 ]。 综合来看，这有力地证明nSMase2是主要的早期TNF- α -多种细胞类型中活化的N-SMase亚型。
在本研究过程中，我们惊讶地发现我们无法检测到 在体外 过度表达nSMase3时的N-S酶活性。 这与 在体外 用nSMase2观察到的N-SMase活性和 在体外 nSMase1的N-S酶活性。 虽然nSMase3的瞬时转染不如nSMase1或nSMase2有效，但通过不同转染“剂量”的nSMase 3质粒的进一步评估再次表明，对 在体外 尽管V5–nSMase3蛋白水平发生明显变化，但N-SMase活性仍然存在。 重要的是，这不是由细胞类型引起的，也可以通过未标记的pRK–nSMase3构建体观察到，排除了V5标记以某种方式干扰酶活性的可能性。 此外，即使在HEK-293细胞中稳定表达nSMase3也不会影响 在体外 N-SMase活性，尽管nSMase3表达更清晰。 当然，在HEK-293细胞中nSMase1的可比稳定表达足以增加N-SMase活性，这表明这不是检测灵敏度的问题。 此外，nSMase3缺乏N-SMase活性并不取决于实验条件，因为检测是利用我们实验室的标准分析以及其他实验室使用的不同条件进行的。 总的来说，我们认为这是nSMase3不具备的有力证据 在体外 N-SMase活性。
尽管缺乏 在体外 N-SMase活性，我们考虑了nSMase3仍可能调节鞘脂水平的可能性 体内 但也可能通过替代机制间接做到这一点。 因此，测量了短暂和稳定过度表达细胞中的神经酰胺和SM水平。 与我们实验室之前的结果一致[ 4 ]nSMase2过度表达（稳定和短暂）显著增加神经酰胺水平，降低SM水平。 相反，稳定的nSMase1过度表达对细胞SM水平没有显著影响，并诱导细胞神经酰胺水平的小幅度增加，尽管不显著。 值得注意的是，nSMase3过度表达（稳定或短暂）对神经酰胺或SM水平没有显著影响。 这些实验的一个潜在缺点是三种N-SMase亚型的差异表达。 因此，在HEK-293细胞中重复瞬时转染实验，利用每个N-SMase的不同DNA量，以产生更具可比性的表达。 通过免疫荧光和免疫印迹分析蛋白质表达，证实所有N-SMase的水平和效率相似。 更重要的是，正如在MCF-7细胞中观察到的那样，nSMase1和nSMase3都不能增加神经酰胺水平。 相反，神经酰胺通过nSMase2显著增加。 值得注意的是，任何亚型的瞬时转染都不会显著影响SM水平，尽管与对照组相比，nSMase2细胞中的水平有降低的趋势（结果未显示）。 nSMase3对细胞鞘磷脂的作用不足与之前的研究不一致[ 17 ]，尽管这可能是由于所使用的细胞类型（与HT-29细胞相比，本研究中的MCF-7和HEK-293细胞）。 然而，Corcoran等人[ 17 ]据报道，稳定的nSMase3细胞中SM减少，但神经酰胺没有增加。 此外，nSMase3的表达与SM的减少之间没有相关性：一个细胞系的nSMase 3表达显著增加，但SM的减少较小[ 17 ], 在体外 在两种细胞系中均未评估N-SMase活性。 因此，我们推测对SM的影响可能不是由于nSMase3的过度表达。
如上所述，之前的两项关于nSMase3的研究都利用过表达作为研究该酶及其下游效应的工具。 然而，nSMase3 siRNA对N-SMase活性的影响尚未评估。 为了进一步确定nSMase3是否确实是 真诚地 因此，我们在本研究中进行了siRNA实验。 至关重要的是，nSMase1的下调显著降低了基础N-SMase活性。 相反，nSMase2 siRNA对基础N-SMase活性几乎没有影响，但能抑制TNF- α -诱导的N-SMase活性。 值得注意的是，我们实验室以前的一项研究发现，随着细胞接近融合，nSMase2对N-SMase活性更为重要[ 24 ]。 此外，尽管nSMase3 mRNA受到显著抑制（>50%），但nSMase 3下调对基础活性没有影响。 此外，nSMase3对TNF并不重要- α -诱导MCF-7细胞的N-SMase活性。 虽然这并不是nSMase3不作为N-SMase发挥作用的唯一证据，但当结合利用瞬时和稳定的nSMase 3过度表达的大量结果时，这提供了强有力的证据，证明nSMase1可能不是主要作为N-SMage发挥作用的。
缺乏 在体外 和 体内 nSMase3的SMase活性可能并不令人惊讶。 事实上，nSMase3的氨基酸序列与扩展的N-SMase家族的任何成员几乎没有同源性[ 10 ]，包括细菌和酵母SMase亚型。 更重要的是，nSMase3似乎不具有对SMase活性至关重要的N-SMase家族成员中存在的核心催化残基[ 10 ]。 事实上，nSMase3从低等生物到高等生物表现出高度保守性[ 6 ]表明它可能发挥另一种独特的作用； 然而，目前的研究提出了一个重大问题。 如果nS-Mase3的主要功能不是SMase，那么它的主要功能是什么？ 鉴于所报道的组织分布，特别是在心脏组织中的高表达，这可能是进一步研究蛋白质功能的更有用的系统。 此外，尽管我们的结果表明nSMase3不调节鞘脂水平，或具有 在体外 SMase活性，我们确实观察到，在MDA-MB-231细胞中，nSMase3的表达随着阿霉素的反应而增加（C.J.Clarke，未发表的工作），这表明它可能在某些细胞类型的细胞应激反应中发挥作用，如前所述[ 17 ]。 总的来说，nSMase3的真正功能需要进一步研究。 尽管我们无法确定其功能，但BLAST分析表明，nSMase3与假设的大鼠核苷酸三磷酸水解酶显示出密切同源性（P.L.Roddy和Y.a.Hannun，未发表的工作）。 这可能是未来研究的良好起点。 此外，还应该注意到，尽管有报道称nSMase1没有起到 体内 N-SMase，最近的研究表明，在某些情况下，它可能充当N-SMases[ 8 ]。 尽管nSMase3可能并非如此，但由于缺乏 在体外 在某些情况下，nSMase3可能影响细胞鞘脂，特别是考虑到nSmase 3的拟议作用和鞘脂在细胞应激反应中的既定作用[ 1 , 17 ].
本研究的结果也证实了nSMase1具有 在体外 N-SMase活性，但缺乏调节细胞鞘脂的能力 体内 这与我们实验室和其他实验室之前的结果非常一致[ 三 , 7 ]。 尽管如此，据报道，在某些情况下，nSMase1对应激诱导的神经酰胺生成很重要[ 9 , 25 ]。 这就增加了一种可能性，即nSMase1通常可能与SM隔离，只有当它能够访问其基底时才能作为N-SMase发挥作用； 事实上，nSMase1可以清除任何“游离”SM，这些SM可以到达内质网，内质网是酶的定位地。 重要的是，本研究结果表明，MCF-7细胞的大多数基本N-SMase活性可归因于nSMase1。 由于nSMase1似乎无处不在[ 三 ]，在解释N-SMase激活的实验数据时应考虑到这一点。 事实上，高基础活性可以有效地“掩盖”其他N-SMase亚型的显著激活。
最后，尽管我们已经研究了nSMase1、nSMase2和nSMase3在肿瘤坏死因子应答中的作用，但还应注意的是，我们的实验室最近发现了第四种哺乳动物N-SMase，称为MA-nSMase[ 6 ]。 MA-nSMase与之前鉴定的斑马鱼线粒体SMase同源[ 26 ]。 然而，到目前为止，仅鉴定出一种小鼠MA-nSMase，尚未发现人类同源物。 因此，MA nSMase对TNF的贡献- α 未对该细胞系的反应进行评估。 然而，由于MA-nSMase优先在睾丸和皮肤中表达[ 6 ]这些可能是研究MA-nSMase调控和作用的最佳系统。 事实上，这是我们实验室目前进一步研究的主题。
综上所述，通过利用获得函数和损失函数的方法，本研究发现nSMase2是主要的TNF- α -激活MCF-7细胞中的N-SMase。 此外，我们进一步报告，nSMase3不具备 在体外 和 体内 N-SMase活性，表明其可能不是主要的SMase功能。
致谢 我们感谢南卡罗来纳医科大学脂质组核心对细胞鞘磷脂的分析，以及分子成像核心对共焦显微镜的使用。 我们还感谢纳比尔·马马蒂博士、大卫·蒙特福斯科博士和罗素·詹金斯博士的有益讨论。
资金
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的支持[赠款编号GM 43825（发给Y.A.H.）]。 在脂质组学核心中开展的工作得到了国家研究资源中心（National Center for research Resources）校外研究项目NIH的支持[赠款编号C06 RR01882]。 分子成像核心由NIH支持[授权号P30 CA138313]。
使用的缩写 DMEM公司 Dulbecco改良的Eagle's培养基 FBS公司 胎牛血清 HEK公司 人胚胎肾 HEK载体 稳定表达V5标记空载体的HEK-293细胞 胡韦克 人脐静脉内皮细胞 液相色谱-质谱/质谱 液相色谱串联质谱 MEM公司 最低必需培养基 RT公司 反转录 小干扰RNA 小干扰RNA 性虐待 鞘磷脂 S底座 鞘磷脂酶 N-S底座 中性SMase 风扇 与N-SMase活性相关的因子 MA-nS基准 线粒体相关nSMase HEK-nSMAS1等 稳定表达V5标记的nSMase1等的HEK-293细胞 TNF公司 肿瘤坏死因子 TNFR公司 肿瘤坏死因子受体
脚注 作者贡献
克里斯托弗·克拉克（Christopher Clarke）和艾米丽·克洛伊斯纳（Emily Cloessner）设计并执行了这些实验。 克里斯托弗·克拉克分析了这些数据。 Patrick Roddy生成了所使用的构造。 Yusuf Hannun监督该项目并提供资金支持。 手稿由克里斯托弗·克拉克和优素福·汉农撰写。 工具书类 1 Hannun YA，Obeid LM。 生物活性脂质信号传递原理：鞘脂的教训。 Nat Rev摩尔细胞生物学。 2008; 9 :139–150. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 2 Wu BX、Clarke CJ、Hannun YA。 哺乳动物中性鞘磷脂酶：在细胞信号反应中的调节和作用。 神经分子医学。 2010; 12 :320–330. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 三。 Tomiuk S、Hofmann K、Nix M、Zumbansen M、Stoffel W。克隆哺乳动物中性鞘磷脂酶：鞘磷脂信号的功能？ 美国国家科学院程序。 1998; 95 :3638–3643. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 4 Marchesini N、Luberto C、Hannun YA。 哺乳动物中性鞘磷脂酶2的生化特性及其在鞘磷脂代谢中的作用。 生物化学杂志。 2003; 278 :13775–13783. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 5 Krut O，Wiegmann K，Kashkar H，Yazdanpanah B，Kronke M。新型TNF应答哺乳动物中性鞘磷脂酶-3是一种C-尾锚定蛋白。 生物化学杂志。 2006; 281 :13784–13793. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 6 Wu BX、Rajagopalan V、Roddy PL、Clarke CJ、Hannun YA。 小鼠线粒体相关鞘磷脂酶（MA-nSMase），哺乳动物鞘磷脂磷酸二酯酶5的鉴定和表征。 生物化学杂志。 2010; 285 :17993–18002. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 7 Sawai H、Domae N、Nagan N、Hannun YA。 克隆的假定中性鞘磷脂酶作为溶血血小板活化因子-磷脂酶C的功能。 生物化学杂志。 1999; 274 :38131–38139. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 8 Tonneti L，Veri MC，Bonvini E，D'Adamio L.中性鞘磷脂酶介导的神经酰胺在T细胞受体诱导的凋亡和有丝分裂原活化蛋白激酶介导的信号转导中的作用。 《实验医学杂志》。 1999; 189 ：1581–1589。 [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 9 Jung SY，Suh JH，Park HJ，Jung KM，Kim MY，Na DS，Kim DK.牛脑中多种形式膜相关中性鞘磷脂酶的鉴定。 神经化学杂志。 2000; 75 :1004–1014. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 10 Clarke CJ、Snook CF、Tani M、Matmati N、Marchesini N、Hannun YA。 中性鞘磷脂酶的大家族。 生物化学。 2006; 45 :11247–11256. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 11 Stoffel W、Jenke B、Block B、Zumbansen M、Koebke J.中性鞘磷脂酶2（smpd3）在出生后生长发育控制中的作用。 美国国家科学院程序。 2005; 102 :4554–4559. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 12 Aggarwal BB.肿瘤坏死因子超家族的信号通路：一把双刃剑。 Nat Rev免疫学。 2003; 三 :745–756. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 13 Clarke CJ、Truong TG、Hannun YA。 中性鞘磷脂酶-2在肿瘤坏死因子中的作用 α -肺上皮细胞中血管细胞黏附分子-1（VCAM）和细胞间黏附分子1（ICAM）的刺激表达：p38 MAPK是nSMase2的上游调节因子。 生物化学杂志。 2007; 282 :1384–1396. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 14 De Palma C、Meachi E、Perrotta C、Bruni P、Clementi E。肿瘤坏死因子激活内皮型一氧化氮合酶 α 通过中性鞘磷脂酶2、鞘氨醇激酶1和鞘氨醇1磷酸受体：一种与内皮病理生理学相关的新途径。 动脉硬化血栓血管生物学。 2006; 26 :99–105. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 15 Tellier E、Negre-Salvayre A、Bocquet B、Itohara S、Hannun YA、Salvayre R、Auge N。呋喃在肿瘤坏死因子中的作用 α -诱导基质金属蛋白酶/鞘脂有丝分裂途径的激活。 分子细胞生物学。 2007; 27 :2997–3007. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 16 Wheeler D、Knapp E、Bandaru VV、Wang Y、Knorr D、Poirier C、Mattson MP、Geiger JD、Haughey NJ。 肿瘤坏死因子- α -诱导的中性鞘磷脂酶-2通过控制NMDA受体的膜插入来调节突触可塑性。 神经化学杂志。 2009年； 109 :1237–1249. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 17 Corcoran CA，He Q，Ponnusamy S，Ogretmen B，Huang Y，Sheikh MS。中性鞘磷脂酶-3是一种DNA损伤和非基因毒性应激调节基因，在人类恶性肿瘤中被解除调控。 摩尔癌症研究。 2008; 6 :795–807. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 18 Montfort A、de Badts B、Douin-Echinard V、Martin PG、Iacovoni J、Nevoit C、Therville N、Garcia V、Bertrand MA、Bessières MH等。FAN刺激TNF α -诱导基因表达、白细胞募集和体液反应。 免疫学杂志。 2009年； 183 :5369–5378. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 19 Möhlig H，Mathieu S，Thon L，Frederiksen MC，Ward DM，Kaplan J，Schütze S，Kabelitz D，Adam D。WD重复蛋白FAN调节溶酶体大小，与蛋白激酶C的异常下调/膜募集无关。 实验细胞研究。 2007; 313 :2703–2718. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 20 Phillip S、Puchert M、Adam-Klages S、Tchikov V、Winoto-Morbach S、Mathieu S、Deerberg A、Kolker L、Marchesini N、Kabelitz D等。多梳组蛋白EED将TNF受体1与中性鞘磷脂酶偶联。 美国国家科学院程序。 2010; 107 :1112–1117. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 21 Bielawski J、Pierce JS、Snider J、Rembiesa B、Szulc ZM、Bielawsca A.高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）分析鞘脂 高级实验医学生物。 2010; 688 :46–59. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 22 Luberto C、Hassler DF、Signorelli P、Okamoto Y、Sawai H、Boros E、Hazen-Martin DJ、Obeid LM、Hannun YA、Smith GK。 一种新型中性鞘磷脂酶抑制剂抑制肿瘤坏死因子诱导的MCF7细胞死亡。 生物化学杂志。 2002; 277 :41128–41139. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 23 Devillard R、Galvani S、Thiers JC、Guenet JL、Hannun Y、Bielawski J、Nègre-Salvayre A、Salvayre R、AugéN。应激诱导的鞘磷脂信号：2型中性鞘磷脂酶在小鼠细胞凋亡和增殖中的作用。 《公共科学图书馆·综合》。 2010; 5 ：e9826。 [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 24 Marchesini N、Osta W、Bielawski J、Luberto C、Obeid LM、Hannun YA。 哺乳动物中性鞘磷脂酶2在融合诱导MCF7细胞生长停滞中的作用。 生物化学杂志。 2004; 279 :25101–25111. [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 25 Yabu T、Imamura S、Yamashita M、Okazaki T。镁的鉴定 2+ -依赖性中性鞘磷脂酶1作为热应激诱导神经酰胺生成和凋亡的介质。 生物化学杂志。 2008; 283 :29971–29982. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 26 Yabu T，Shimuzu A，Yamashita M。斑马鱼细胞中一种新的线粒体鞘磷脂酶。 生物化学杂志。 2009年； 284 :20349–20363. [ PMC免费文章 ] [ 公共医学 ] [ 谷歌学者 ] 
