乳腺癌中琥珀酸脱氢酶的表达
, , ,和
Do Hee Kim先生
韩国首尔延世大学医学院病理学系
吴希荣（Woo-Hee Jung）
韩国首尔延世大学医学院病理学系
Ja Seung Koo先生
韩国首尔延世大学医学院病理学系
韩国首尔延世大学医学院病理学系
通讯作者。 2013年6月10日收到；2013年6月20日验收。
摘要
本研究的目的是根据乳腺癌分子亚型，利用免疫组织化学方法研究琥珀酸脱氢酶（SDH）在乳腺癌中的表达，并评估SDH表达的临床意义。在721例乳腺癌组织芯片上进行ER、PR、HER-2、Ki-67、HIF-1α、SDHA和SDHB的免疫组织化学染色。根据ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫组化结果以及HER-2的荧光原位杂交（FISH）结果，乳腺癌分子亚型分为管腔A、管腔B、HER-1和三阴性乳腺癌（TNBC）。HER-2亚型乳腺癌中SDHA在肿瘤细胞中的高表达最为常见，而管腔A亚型则在肿瘤细胞中低表达或负表达(P（P） = 0.032). 基质SDHB表达率在HER-2亚型中最高，在TNBC中最低(P（P） < 0.001). SDHA-阴性乳腺癌与诊断年龄较低有关(P（P） = 0.012），以及组织学分级较低的SDHB阴性乳腺癌(P（P） = 0.044）和较低的Ki-67标记指数（LI）(P（P） = 0.046). 根据SDH状态，肿瘤表型为SDHA（+）/SDHB（+） > SDHA（–）/SDHB（–） > SDHA（–）/SDHB（+） > SDHA（+）/SDHB（–）按频率顺序排列。基质表型为SDHA（-）/SDHB（-） > SDHA（+）/SDHB（+） > SDHA（–）/SDHB（+） > SDHA（+）/SDHB（-）。总之,在本研究中，约3%的乳腺癌中观察到SDHA或SDHB表达缺失。乳腺肿瘤细胞中SDH的低表达状态与诊断年龄较低和组织学分级较低有关。
电子辅助材料
本文的在线版本（doi:10.1186/2193-1801-2-299）包含补充材料，可供授权用户使用。
关键词：乳房，代谢，线粒体，琥珀酸脱氢酶
介绍
琥珀酸脱氢酶（SDH）（琥珀酸辅酶Q还原酶，呼吸复合物II）催化琥珀酸氧化为富马酸，泛醌还原为泛喹诺酮。通过线粒体内膜中这两个反应的耦合，SDH将TCA循环中的葡萄糖氧化与线粒体中ATP的生成联系起来（Cardaci和Ciriolo2012;King等人。2006;巴莱塔和霍尼克2012;Van Nederveen等人。2009). SDH由四个亚基组成；SDHA、SDHB、SDHC和SDHD。前两种是突入线粒体基质的亲水蛋白质，后两种是将催化核心固定在线粒体内膜的疏水蛋白质（Cardaci和Ciriolo2012；King等人。2006；巴莱塔和霍尼克2012；Van Nederveen等人。2009).
生殖系功能丧失性SDH突变与多种肿瘤相关，如嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、胃肠道间质瘤（GIST）和肾细胞癌（Hensen&Bayley2011；Kantorovich等人。2010；安德森等人。2004；Astuti等人。2001；Miettinen等人。2011；Badve等人。2011；Ricketts等人。2008). 其中，据报道，GIST和肾细胞癌显示了区分SDH缺陷肿瘤的组织学特征（Miettinen等人。2011). 尽管SDH种系突变可以通过基因测序进行准确评估，但最近的一些研究表明，免疫组化检测GIST、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中SDH突变的敏感性非常高（Van Nederveen等人。2009；Gill等人。2010年a；Miettinen等人。2013；Janeway等人。2011).
迄今为止，很少有研究调查SDH在乳腺癌中的表达。我们使用免疫组织化学方法根据乳腺癌分子亚型研究了SDH的表达状态，并评估了SDH在乳腺癌中表达的临床意义。
材料和方法
患者选择
本研究包括2002年1月至2005年12月期间在Severance医院被诊断为浸润性导管癌（未另行说明）并接受手术切除的患者。排除术前接受激素治疗或新辅助化疗的患者。乳腺病理学家（Koo JS）对每个病例的所有苏木精和伊红（H&E）染色切片进行了回顾性审查。采用诺丁汉分级系统评估组织学分级。（Elston&Ellis）1991)评估每种乳腺癌的临床病理参数包括初始诊断时的患者年龄、淋巴结转移、肿瘤复发、远处转移和患者生存率。延世大学分离医院的机构审查委员会批准了这项研究。
组织微阵列
在肿瘤的H&E染色切片上，选择一个有代表性的区域，并在石蜡块表面标记相应的斑点。使用活检针，将选定区域打孔，并将3mm的肿瘤组织芯置于6×5的受体块上。从每个样品中提取两个组织核心，以最小化偏差。每个组织核心被分配一个唯一的微阵列位置编号，该编号与数据库中的临床病理数据相关联。
免疫组织化学
如图所示，使用抗体在福尔马林固定的石蜡包埋组织切片上进行所有免疫组织化学染色（表). 简单地说，用切片机获得5μm厚的切片，转移到粘附载玻片上，并在62°C下干燥30分钟。与一级抗体孵育后，使用生物素化抗鼠免疫球蛋白进行免疫检测，然后使用标记的链霉亲和素生物素试剂盒，以3,3′-二氨基联苯胺色原为底物，使用过氧化物酶标记的链霉菌亲和素进行免疫检测。阴性对照中省略了一级抗体孵育步骤。用哈里斯苏木精对载玻片进行复染。
表1
| 抗体 | 克隆 | 稀释 | 单位 |
|---|
| HIF-1α | EP1215Y型 | 1:100 | 美国加利福尼亚州约尔巴·琳达生物保健公司 |
| SDHA公司 | 2E3GC12FB2AE2型 | 1:100 | 英国剑桥Abcam |
| SDHB公司 | 21A11AE7型 | 1:100 | 英国剑桥Abcam |
| 肿瘤表型相关 |
| 急诊室 | SP1型 | 1:100 | 美国加利福尼亚州赛默科技公司 |
| 公共关系 | PgR公司 | 1:50 | 丹麦达科 |
| HER-2型 | 多克隆 | 1:1500 | 丹麦达科 |
| Ki-67基因 | MIB-1型 | 1比150 | 丹麦格洛斯特鲁普DAKO |
免疫组织化学染色的解释
所有免疫组织化学标记物均通过光学显微镜进行评估。从患者的病理报告中获得ER、PR和HER-2状态等参数。用1%或更多阳性染色细胞核的截止值来定义ER和PR阳性（Hammond等人。2010). HER-2染色根据美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理学家学会（CAP）指南使用以下类别进行分析：0，无免疫染色；1+，弱不完全膜染色，肿瘤细胞少于10%；2+，完全膜染色，在至少10%的肿瘤细胞中均匀或微弱；和3+，至少30%的肿瘤细胞中均匀的强膜染色（Wolff AC等。2007). 当观察到强（3+）膜染色时，HER-2免疫染色被记录为阳性，而0到1+染色类别被记录为阴性。通过荧光原位杂交（FISH）对显示2+HER-2表达的样本进行HER-2扩增评估。
SDHA和SDHB的免疫组织化学染色显示胞质表达呈颗粒状。完全表达缺失被认为是阴性的，而少于50%的肿瘤细胞中的细胞质表达被认为是低表达的，超过50%的癌细胞中的胞质表达被视为高表达（图). 当超过10%的肿瘤细胞表现出强烈的细胞质或核表达时，HIF-1α被认为是阳性的。
SDHB表达的免疫组织化学评价。（A） 阴性（B）低阳性（C）高阳性。
鱼类分析
根据制造商的说明，使用PathVysion HER-2 DNA探针试剂盒（美国伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫市Vysis）进行FISH。侵袭性肿瘤首先在苏木精-伊红染色切片上进行检查，以确认组织学。根据ASCO/CAP指南（Wolff AC等人。2007). 对三个不同区域的至少60个肿瘤细胞核进行HER-2和17号染色体信号检测。HER-2基因绝对拷贝数小于4或HER-2基因组/17号染色体拷贝数比率（HER-2/Chr17比率）小于1.8被视为HER-2阴性。HER-2绝对拷贝数在4到6之间或HER-2/Chr17比值在1.8到2.2之间被认为是HER-2模棱两可。HER-2绝对拷贝数大于6或HER-2/Chr17比值大于2.2被视为HER-2阳性。
肿瘤表型分类
根据ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫组织化学结果和HER-2的FISH结果对乳腺癌表型进行分类，如下所示（Goldhirsch A等人。2011)：内脏A亚型为ER-或/和PR-阳性和HER-2阴性，Ki-67 LI<14%；内脏B亚型为ER-或/和PR-阳性和HER-2阴性，Ki-67 LI≥14%；HER-2阳性作为ER或/和PR阳性，HER-2过度表达或/和扩增；HER-2过表达亚型为ER-和PR-阴性，HER-2过度表达或/和扩增；三阴性乳腺癌（TNBC）亚型为ER、PR和HER-2阴性。
统计分析
使用SPSS for Windows 12.0版（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）对数据进行分析。Student的t检验和Fisher的精确检验分别用于评估连续变量和分类变量。显著性水平设定为0.05。通过Kaplan-Meier和log-rank统计评估肿瘤复发时间和总生存率。使用Cox比例风险模型进行多元回归分析。
结果
患者特征
乳腺癌分子亚型的临床病理特征如表所示721例乳腺癌中的分子亚型包括302个腔A型（41.9%）、168个腔B型（23.3%）、69个HER-2型（9.6%）和182个TNBC型（25.2%）。TNBC组织学分级较高(P（P） < 0.001），较高T级(P（P） = 0.007）和更高Ki-67 LI(P（P） < 0.001）。HER-2亚型与年龄呈正相关(P（P） = 0.005），并伴有肿瘤复发和死亡(P（P） = 0.001).
表2
| 参数 | 总计n个 = 721 (%) | 发光二极管An个 = 302 (%) | 发光二极管Bn个 = 168 (%) | HER-2型n个 = 69 (%) | TNBC公司n个 = 182 (%) | P（P）-价值 |
|---|
| n个 = 302 (%) | n个 = 168 (%) | n个 = 69 (%) | n个 = 182 (%) |
|---|
| 年龄（年，平均值±标准偏差） | 49.6 ± 10.9 | 50.6 ± 10.4 | 48.4 ± 10 | 52.4 ± 10 | 48 ± 12.4 | 0.005 |
| 组织学分级 | | | | | | <0.001 |
| 我 | 120 (16.6) | 92 (30.5) | 20（11.9） | 1 (1.4) | 7 (3.8) | |
| 二 | 364 (50.5) | 182 (60.3) | 91 (54.2) | 36 (52.2) | 55（30.2） | |
| 三 | 237（32.9） | 28 (9.3) | 57 (33.9) | 32 (46.4) | 120 (65.9) | |
| 肿瘤分期 | | | | | | 0.007 |
| T1类 | 350 (48.5) | 167 (55.3) | 85 (50.6) | 30 (43.5) | 68 (37.4) | |
| T2段 | 356 (49.4) | 127 (42.1) | 81 (48.2) | 38 (55.1) | 110 (60.4) | |
| T3航站楼 | 15 (2.1) | 8 (2.6) | 2 (1.2) | 1 (1.4) | 4 (2.2) | |
| 节点阶段 | | | | | | 0.060 |
| 编号0 | 425 (58.9) | 171 (56.6) | 92 (54.8) | 42 (60.9) | 120 (65.9) | |
| N1型 | 192 (26.6) | 89 (29.5) | 43 (25.6) | 13（18.8） | 47 (25.8) | |
| 氮气 | 65 (9.0) | 27 (8.9) | 18 (10.7) | 9 (13.0) | 11 (6.0) | |
| N3号机组 | 39（5.4） | 15（5.0） | 15 (8.9) | 5 (7.2) | 4 (2.2) | |
| 雌激素受体状态 | | | | | | <0.001 |
| 否定 | 261 (36.2) | 5 (1.7) | 5 (3.0) | 69 (100.0) | 182 (0.0) | |
| 积极的 | 460 (63.8) | 297 (98.3) | 163 (97.0) | 0（0.0） | 0（0.0） | |
| 孕酮受体状态 | | | | | | <0.001 |
| 否定 | 346 (48.0) | 49 (16.2) | 46 (27.4) | 69 (100.0) | 182 (100.0) | |
| 积极的 | 375 (52.0) | 253 (83.8) | 122 (72.6) | 0（0.0） | 0（0.0） | |
| HER-2状态 | | | | | | <0.001 |
| 否定 | 573 (79.5) | 302 (100.0) | 89 (53.0) | 0（0.0） | 182 (100.0) | |
| 积极的 | 148 (20.5) | 0（0.0） | 79 (47.0) | 69 (100.0) | 0（0.0） | |
| Ki-67 LI（%，平均值±标准差） | 17.3 ± 18.4 | 4.7 ± 3.7 | 19.6 ± 12.6 | 19.3 ± 12.8 | 35.1 ± 23 | <0.001 |
| 肿瘤复发 | 63 (8.7) | 14 (4.6) | 13（7.7） | 11（15.9） | 25 (13.7) | 0.001 |
| 患者死亡 | 60 (8.3) | 12 (4.0) | 13 (7.7) | 11 (15.9) | 24 (13.2) | <0.001 |
| 临床随访时间（月，平均值±SD） | 70 ± 31.2 | 72.4 ± 29.3 | 70.2 ± 30 | 65.2 ± 34.3 | 67.8 ± 34.2 | 0.234 |
乳腺癌分子亚型HIF-1α和sdh状态
根据乳腺癌亚型的HIF-1α、SDHA和SDHB表达如表所示和图721例乳腺癌中，仅有24例（3.3%）和4例（0.6%）在细胞核和细胞质中表达HIF-1α。HER-2肿瘤亚型中SDHA高表达频率最高，管腔A亚型中最常见的是SDHA低表达或负表达(P（P） = 0.032). 基质SDHB表达频率在HER2亚型中最高，在TNBC中最低(P（P） < 0.001). 基质SDHA表达在HER-2亚型中最常见，尽管相关性不显著(P（P） = 0.063). 核HIF-1α表达与SDHA/SDHB表达无显著相关性（表); 然而，SDHA和SDHB表达显著相关（r = 0.895,P（P） < 0.001，图).
表3
| 参数 | 总计n个 = 721 (%) | 发光二极管An个 = 302 (%) | 发光二极管Bn个 = 168（%） | HER-2型n个 = 69 (%) | TNBC公司n个 = 182 (%) | P值 |
|---|
| 核HIF-1α | | | | | | 0.319 |
| 否定 | 697 (96.7) | 296（98.0） | 161（95.8） | 65 (94.2) | 175 (96.2) | |
| 积极的 | 24 (3.3) | 6 (2.0) | 7 (4.2) | 4 (5.8) | 7 (3.8) | |
| 细胞质HIF-1α | | | | | | 0.596 |
| 否定 | 717 (99.4) | 301 (99.7) | 166 (98.8) | 69 (100.0) | 181 (99.5) | |
| 积极的 | 4 (0.6) | 1 (0.3) | 2 (1.2) | 0（0.0） | 1 (0.5) | |
| 肿瘤SDHA | | | | | |
0.032
|
| 负/低 | 41/319 (49.9) | 21/143 (54.3) | 8/76 (50.0) | 5/19 (34.8) | 7/81 (48.4) | |
| 高 | 361 (50.1) | 138 (45.7) | 84 (50.0) | 45 (65.2) | 94（51.6） | |
| 基质SDHA | | | | | | 0.063 |
| 否定 | 665 (92.2) | 286 (94.7) | 153 (91.1) | 59 (85.5) | 167 (91.8) | |
| 积极的 | 56（7.8） | 16（5.3） | 15 (8.9) | 10 (14.5) | 15 (8.2) | |
| 肿瘤SDHB | | | | | | 0.291 |
| 负/低 | 24/245 (37.3) | 15/103 (39.1) | 3/56 (35.1) | 3/19 (31.9) | 3/67 (38.5) | |
| 高 | 452 (62.7) | 184 (60.9) | 109 (64.9) | 47 (68.1) | 112 (61.5) | |
| 基质SDHB | | | | | |
<0.001
|
| 否定 | 641 (88.9) | 277 (91.7) | 142 (84.5) | 51 (73.9) | 171 (94.0) | |
| 积极的 | 80 (11.1) | 25 (8.3) | 26 (15.5) | 18 (26.1) | 11 (6.0) | |
根据乳腺癌分子亚型表达SDHA和SDHB。HER-2亚型中肿瘤细胞SDHA表达最高，管腔A亚型中SDHA表达最低。基质元素表达SDHA的水平低于肿瘤细胞。
表4
| 因素 | 核HIF-1α | 细胞质HIF-1α |
|---|
| 否定n个 = 697（%） | 积极的n个 = 24（%） | P（P）-价值 | 否定n个 = 717 (%) | 积极的n个 = 4 (%) | P（P）-价值 |
|---|
| 肿瘤SDHA | | | 0.247 | | | 0.518 |
| 否定 | 40 (5.7) | 1 (4.2) | | 40 (5.6) | 1 (25.0) | |
| 低 | 311 (44.6) | 8 (33.3) | | 318 (44.4) | 1 (25.0) | |
| 高 | 346 (49.6) | 15 (62.5) | | 359 (50.1) | 50.0) | |
| 基质SDHA | | | 0.423 | | | 1 |
| 否定 | 644 (92.4) | 21 (87.5) | | 661 (92.2) | 4 (100.0) | |
| 积极的 | 53 (7.6) | 3 (12.5) | | 56 (7.8) | 0（0.0） | |
| 肿瘤SDHB | | | 0.926 | | |
0.032
|
| 否定 | 24 (3.4) | 0（0.0） | | 23 (3.2) | 1（25.0） | |
| 低 | 235 (33.7) | 10 (41.7) | | 243 (33.9) | 2 (50.0) | |
| 高 | 438 (62.8) | 14 (58.3) | | 451（62.9） | 1（25.0） | |
| 基质SDHB | | | 0.328 | | | 1 |
| 否定 | 621 (89.1) | 20 (83.3) | | 637 (88.8) | 4 (100.0) | |
| 积极的 | 76 (10.9) | 4 (16.7) | | 80 (11.2) | 0（0.0） | |
SDHA和/或SDHB阴性乳腺癌的临床病理特征
对SDHA/SDHB阳性和阴性乳腺癌的临床病理特征进行了比较（表). SDHA肿瘤阴性与乳腺癌早期诊断相关(P（P） = 0.012），组织学分级较低(P（P） = 0.062). SDHB阴性乳腺癌与低组织学分级相关(P（P） = 0.044）和更低Ki-67 LI(P（P） = 0.046). SDH和核HIF-1α的表达状态没有相关性（表).
表5
肿瘤细胞SDHA和/或SDHB阴性乳腺癌的临床病理特征
| 参数 | SDHA公司 | SDHB公司 |
|---|
| 否定n个 = 41 (%) | 积极的n个 = 680 (%) | P（P）-价值 | 否定n个 = 24 (%) | 积极的n个 = 697 (%) | P（P）-价值 |
|---|
| 年龄（年，平均值±标准偏差） | 45.4 ± 10.3 | 49.9 ± 10.9 |
0.012
| 46.9 ± 9.1 | 49.7 ± 10.9 | 0.212 |
| 组织学分级 | | |
0.062
| | |
0.044
|
| 一/二 | 33 (80.5) | 451 (66.3) | | 21（87.5） | 463（66.4） | |
| 三 | 8 (19.5) | 229 (33.7) | | 3 (12.5) | 234 (33.6) | |
| 急诊室 | | | 0.405 | | | 0.286 |
| 否定 | 12 (29.3) | 249 (36.6) | | 6 (25.0) | 255 (36.6) | |
| 积极的 | 29 (70.7) | 431 (63.4) | | 18 (75.0) | 442 (63.4) | |
| 公共关系 | | | 0.748 | | | 1 |
| 否定 | 21 (51.2) | 325 (47.8) | | 11 (45.8) | 335 (48.1) | |
| 积极的 | 20 (48.8) | 355 (52.2) | | 13 (54.2) | 362 (51.9) | |
| HER-2型 | | | 0.693 | | | 0.800 |
| 否定 | 34 (82.9) | 539 (79.3) | | 20 (83.3) | 553 (79.3) | |
| 积极的 | 7（17.1） | 141 (20.7) | | 4 (16.7) | 144 (20.7) | |
| 肿瘤分期 | | | 0.750 | | | 0.213 |
| T1类 | 21 (51.2) | 329 (48.4) | | 15（62.5） | 335（48.1） | |
| T2/T3段 | 20 (48.8) | 351 (51.6) | | 9 (37.5) | 362 (51.9) | |
| 节点阶段 | | | 0.625 | | | 0.529 |
| 编号0 | 26 (63.4) | 399 (58.7) | | 16 (66.7) | 409 (58.7) | |
| N1/N2/N3 | 15 (36.6) | 281 (41.3) | | 8 (33.3) | 288 (41.3) | |
| 分子亚型 | | | 0.452 | | | 0.134 |
| 发光二极管A | 21 (51.2) | 281 (41.3) | | 15 (62.5) | 287 (41.2) | |
| 发光二极管B | 8 (19.5) | 160 (23.5) | | 3 (12.5) | 165 (23.7) | |
| HER-2型 | 5 (12.2) | 64 (9.4) | | 3 (12.5) | 66（9.5） | |
| TNBC公司 | 7 (17.1) | 175 (25.7) | | 3 (12.5) | 179 (25.7) | |
| Ki-67 LI（%，平均值±SD） | 13 ± 12.3 | 17.5 ± 18.7 | 0.127 | 9.9 ± 10 | 17.5 ± 18.6 |
0.046
|
| 肿瘤复发 | 4 (9.8) | 59 (8.7) | 0.775 | 1 (4.2) | 62 (8.9) | 0.714 |
| 患者死亡 | 4 (9.8) | 56 (8.2) | 0.768 | 1 (4.2) | 59 (8.5) | 0.713 |
Hif-1α和SDH表达与临床病理参数的相关性
HIF-1α和SDH表达与临床病理因素的相关性分析显示核HIF-1β表达与PR阴性相关(P（P） = 0.011），并且在ER阳性的肿瘤中SDHA表达低或阴性(P（P） = 0.044），HER-2阴性(P（P） = 0.021）和更高T级(P（P） = 0.031). 肿瘤中SDHB的低或阴性表达与较高的T分期有关(P（P） = 0.011). 基质SDHB阴性与HER-2阴性相关(P（P） < 0.001，表).
表6
HIF-1α和SDH表达对乳腺癌临床病理特征的影响
| 参数 | 核HIF-1α | 细胞质HIF-1α | 肿瘤SDHA | 基质SDHA | 肿瘤SDHB | 基质SDHB |
|---|
| - | + |
P（P）
| - | + |
P（P）
| -* | + |
P（P）
| - | + |
P（P）
| -* | + |
P（P）
| - | + |
P（P）
|
|---|
| 组织学分级 | | | 0.270 | | | 0.601 | | | 0.342 | | | 0.105 | | | 0.870 | | | 0.528 |
| 一/二 | 465（66.7） | 19 (79.2) | | 482 (67.2) | 2 (50.0) | | 248 (68.9) | 236 (65.4) | | 452 (68.0) | 32 (57.1) | | 182 (67.7) | 302 (66.8) | | 433 (67.6) | 51 (63.8) | |
| 三 | 232 (33.3) | 5 (20.8) | | 235 (32.8) | 2 (50.0) | | 112 (31.2) | 125 (34.6) | | 213 (32.0) | 24 (42.9) | | 87 (32.3) | 150 (33.2) | | 208 (32.4) | 29 (36.3) | |
| 急诊室 | | | 0.388 | | | 1 | | |
0.044
| | | 0.111 | | | 0.873 | | | 0.806 |
| 否定 | 250 (35.9) | 11 (45.8) | | 260 (36.3) | 1 (25.0) | | 117 (32.5) | 144（39.9） | | 235 (35.3) | 26 (46.4) | | 96 (35.7) | 165 (36.5) | | 231 (36.0) | 30 (37.5) | |
| 积极的 | 447（64.1） | 13（54.2） | | 457 (63.7) | 3 (75.0) | | 243 (67.5) | 217 (60.1) | | 430 (64.7) | 30 (53.6) | | 173 (64.3) | 287 (63.5) | | 410 (64.0) | 50 (62.5) | |
| 公共关系 | | |
0.011
| | | 1 | | | 0.118 | | | 0.165 | | | 0.645 | | | 1 |
| 否定 | 328 (47.1) | 18 (75.0) | | 344 (48.0) | 2 (50.0) | | 162 (45.0) | 184 (51.0) | | 314 (47.2) | 32 (57.1) | | 126 (46.8) | 220 (48.7) | | 308 (48.0) | 38 (47.5) | |
| 积极的 | 369 (52.9) | 6 (25.0) | | 373 (52.0) | 2 (50.0) | | 198 (55.0) | 177 (49.0) | | 351（52.8） | 24 (42.9) | | 143 (53.2) | 232 (51.3) | | 333 (52.0) | 42 (52.5) | |
| HER-2型 | | | 0.304 | | | 1 | | |
0.021
| | | 0.083 | | | 0.057 | | |
<0.001
|
| 否定 | 556 (79.8) | 17 (70.8) | | 570 (79.5) | 3 (75.0) | | 299 (83.1) | 274 (75.9) | | 534 (80.3) | 39 (69.6) | | 224 (83.3) | 349 (77.2) | | 526 (82.1) | 47 (58.8) | |
| 积极的 | 141 (20.2) | 7 (29.2) | | 147 (20.5) | 1 (25.0) | | 61 (16.9) | 87 (24.1) | | 131 (19.7) | 17 (30.4) | | 45 (16.7) | 103 (22.8) | | 115 (17.9) | 33 (41.3) | |
| 肿瘤分期 | | | 0.304 | | | 1 | | |
0.031
| | | 1 | | |
0.011
| | | 0.237 |
| T1类 | 341 (48.9) | 9 (37.5) | | 348 (48.5) | 2（50.0） | | 160 (44.4) | 190 (52.6) | | 323 (48.6) | 27 (48.2) | | 114 (42.4) | 236 (52.2) | | 306（47.7） | 44（55.0） | |
| T2/T3段 | 356 (51.1) | 15 (62.5) | | 369 (51.5) | 2 (50.0) | | 200 (55.6) | 171 (47.4) | | 342 (51.4) | 29 (51.8) | | 155 (57.6) | 216 (47.8) | | 335 (52.3) | 36 (45.0) | |
| 节点阶段 | | | 0.208 | | | 0.648 | | | 0.198 | | | 0.575 | | | 0.639 | | | 0.149 |
| 编号0 | 414 (59.4) | 11 (45.8) | | 422 (58.9) | 3 (75.0) | | 221 (61.4) | 204 (56.5) | | 394 (59.2) | 31 (55.4) | | 162 (60.2) | 263 (58.2) | | 384 (59.9) | 41 (51.3) | |
| N1/N2/N3 | 283 (40.6) | 13 (54.2) | | 295 (41.1) | 1 (25.0) | | 139 (38.6) | 157 (43.5) | | 271（40.8） | 25（44.6） | | 107 (39.8) | 189 (41.8) | | 257 (40.1) | 39 (48.8) | |
乳腺癌中SDH表达表型的病理学特征
在这712例乳腺肿瘤中，SDHA/SDHB表达表型的频率顺序为SDHA（+）/SDHB（+） > SDHA（-）/SDHB（-） > SDHA（-）/SDHB（+）>SDHA（+）/SDHB（-）。基质表型为SDHA（-）/SDHB（-） > SDHA（+）/SDHB（+） > SDHA（–）/SDHB（+）>SDHA（+）/SDHP（–）（表).
表7
| 因素 | 肿瘤表型 | 基质表型 |
|---|
| SDHA（+）/SDHB | SDHA（+）/SDHB | SDHA（−）/SDHB | SDHA（-）/SDHB |
P（P）
| SDHA（+）/SDHB | SDHA（+）/SDHB | SDHA（−）/SDHB | SDHA（−）/SDHB |
P（P）
|
|---|
| （+）n个 = 679 (%) | (−)n个 = 1 (%) | （+）n个 = 18 (%) | （−）n个 = 23 (%) | （+）n个 = 42 (%) | (−)n个 = 14 (%) | （+）n个 = 38 (%) | (−)n个 = 627（%） |
|---|
| 组织学分级 | | | | | 0.038 | | | | | 0.150 |
| 一/二 | 450 (66.3) | 1 (100.0) | 13 (72.2) | 20 (87.0) | | 25 (59.5) | 7 (50.0) | 26 (68.4) | 426 (67.9) | |
| 三 | 229 (33.7) | 0（0.0） | 5 (27.8) | 3 (13.0) | | 17 (40.5) | 7 (50.0) | 12 (31.6) | 201 (32.1) | |
| 肿瘤分期 | | | | |
0.495
| | | | | 0.640 |
| T1类 | 329 (48.5) | 0（0.0） | 6 (33.3) | 15 (65.2) | | 20 (47.6) | 7 (50.0) | 24 (63.2) | 299 (47.7) | |
| T2/T3段 | 350 (51.5) | 1 (100.0) | 12 (66.7) | 8 (34.8) | | 22（52.4） | 7 (50.0) | 14 (36.8) | 328 (52.3) | |
| 节点阶段 | | | | | 0.491 | | | | | 0.314 |
| 编号0 | 398（58.6） | 1（100.0） | 11 (61.1) | 15 (65.2) | | 21 (50.0) | 10 (71.4) | 20 (52.6) | 374 (59.6) | |
| N1/N2/N3 | 281 (41.4) | 0（0.0） | 7 (38.9) | 8 (34.8) | | 21 (50.0) | 4 (28.6) | 18 (47.4) | 253 (40.4) | |
| 急诊室 | | | | | 0.284 | | | | | 0.205 |
| 否定 | 248 (36.5) | 1 (100.0) | 7 (38.9) | 5 (21.7) | | 16 (38.1) | 10 (71.4) | 14 (36.8) | 221 (35.2) | |
| 积极的 | 431 (63.5) | 0（0.0） | 11 (61.1) | 18 (78.3) | | 26 (61.9) | 4 (28.6) | 24（63.2） | 406 (64.8) | |
| 公共关系 | | | | | 0.793 | | | | | 0.336 |
| 否定 | 324 (47.7) | 1 (100.0) | 11 (61.1) | 10（43.5） | | 21（50.0） | 11 (78.6) | 17 (44.7) | 297 (47.4) | |
| 积极的 | 355 (52.3) | 0（0.0） | 7 (38.9) | 13 (56.5) | | 21 (50.0) | 3 (21.4) | 21 (55.3) | 330 (52.6) | |
| HER-2型 | | | | |
0.567
| | | | |
0.001
|
| 否定 | 539 (79.4) | 0（0.0） | 14 (77.8) | 20 (87.0) | | 26 (61.9) | 13 (92.9) | 21 (55.3) | 513 (81.8) | |
| 积极的 | 140 (20.6) | 1 (100.0) | 4 (22.2) | 3 (13.0) | | 16 (38.1) | 1 (7.1) | 17 (44.7) | 114 (18.2) | |
| 分子类型 | | | | | 0.057 | | | | |
<0.001
|
| 发光二极管A | 281（41.4） | 0（0.0） | 6 (33.3) | 15 (65.2) | | 14 (33.3) | 2 (14.3) | 11 (28.9) | 275 (43.9) | |
| 发光二极管B | 160（23.6） | 0（0.0） | 5（27.8） | 3 (13.0) | | 13 (31.0) | 2 (14.3) | 13 (34.2) | 140 (22.3) | |
| HER-2型 | 63 (9.3) | 1 (100.0) | 3 (16.7) | 2 (8.7) | | 9 (21.4) | 1 (7.1) | 9 (23.7) | 50 (8.0) | |
| TNBC公司 | 175 (25.8) | 0（0.0） | 4 (22.2) | 3 (13.0) | | 6 (14.3) | 9 (64.3) | 5 (13.2) | 162 (25.8) | |
| Ki-67 LI（%，平均值±SD） | 17.5 ± 18.7 | 8 ± 0 | 16.8 ± 14 | 10 ± 10.2 | 0.260 | 17.8 ± 15.3 | 24.3 ± 22.8 | 22.1 ± 19 | 16.8 ± 18.4 | 0.161 |
| 肿瘤复发 | 59 (8.7) | 0（0.0） | 3 (16.7) | 1 (4.3) | 0.955 | 4 (9.5) | 1 (7.1) | 2 (5.3) | 56 (8.9) | 0.877 |
| 患者死亡 | 56 (8.2) | 0（0.0） | 3（16.7） | 1（4.3） | 0.968 | 3 (7.1) | 1 (7.1) | 3 (7.9) | 53 (8.5) | 0.727 |
与SDHA（+）/SDHB（-）和SDHA（-）/SDHP（-）肿瘤相比，SDHA（+/SDHB（+）肿瘤的组织学分级更高(P（P） = 0.038). 基质性SDHA（–）/SDHB（+）肿瘤HER-2阳性率最高，而基质性SDHA+/SDHB肿瘤HER-1阳性率最低(P（P） = 0.001). 分子亚型之间的基质SDHA/SDHB表型差异显著，SDHA（+）/SDHB（+）在Luminal A中最常见，在TNBC肿瘤中最少。SDHA（+）/SDHB（-）表型在TNBC中最常见，在HER-2亚型肿瘤中最少；SDHA（-）/SDHB（+）在Luminal B中最常见，在TNBC中最少；SDHA（−）/SDHB（–）在Luminal A中最常见，在HER-2亚型中最少(P（P） < 0.001).
HIF-1α和SDH表达状态对预后的意义
在单变量分析中，HIF-1α和SDH的表达与患者预后均无显著相关（表). 在多元Cox分析中（表)，与DFS负相关的因素为T期（危险比：2.535，95%CI:1.376 − 4.670,P（P） = 0.003），淋巴结转移（危险比：2.257，95%CI:1.335 − 3.816,P（P） = 0.002），组织学分级高（危险比：1.685，95%CI:1.013 − 2.804,P（P） = 0.045). 与OS负相关的因素为T期（危险比：2.218，95%CI:1.229 − 4.001,P（P） = 0.008），淋巴结转移（危险比：1.831，95%CI:1.076 − 3.115,P（P） = 0.026），SDHA肿瘤高表达（危险比：4.157，95%CI:1.657 − 10.432中，P（P） = 0.002），SDHB表达低（危险比：3.223，95%CI:1.295 − 8.025,P（P） = 0.012).
表8
根据低氧相关蛋白在乳腺癌中的表达对无病生存期和总生存期进行单因素分析
| 参数 | 患者数量/复发/死亡 | 无病生存 | 总体生存率 |
|---|
| 平均生存期（95%CI）个月 | P（P）-价值 | 平均生存期（95%置信区间）月 | P（P）-价值 |
|---|
| 核HIF-1α | | | 0.911 | | 0.943 |
| 否定 | 697/61/58 | 126 (122 − 130) | | 129 (127 − 132) | |
| 积极的 | 24/2/2 | 120 (108 − 133) | | 131 (122 − 141) | |
| 细胞质HIF-1α | | | 不适用 | | 不适用 |
| 否定 | 717/63 | 不适用 | | 不适用 | |
| 积极的 | 4/0 | 不适用 | | 不适用 | |
| 肿瘤SDHA | | | 0.670 | | 0.085 |
| 负/低 | 360/35/26 | 125 (121 − 129) | | 131 (128 − 135) | |
| 高 | 361/28/34 | 126 (120 − 132) | | 126 (121 − 130) | |
| 基质SDHA | | | 0.853 | | 0.901 |
| 否定 | 665/58/56 | 126 (123 − 130) | | 130 (127 − 132) | |
| 积极的 | 56/5/4 | 115（101 − 130） | | 121 (107 − 134) | |
| 肿瘤SDHB | | | 0.124 | | 0.715 |
| 负/低 | 269/31/26 | 123 (119 − 128) | | 129 (125 − 133) | |
| 高 | 452/32/34 | 126 (121 − 131) | | 129 (125 − 132) | |
| 基质SDHB | | | 0.821 | | 0.981 |
| 否定 | 641/57/54 | 126 (122 − 130) | | 130 (127 − 132) | |
| 积极的 | 80/6/6 | 119 (110 − 128) | | 123 (114 − 131) | |
表9
| 参数 | 无病生存 | 总体生存率 |
|---|
| 危险比 | 95%置信区间 | P（P）-价值 | 危险比 | 95%置信区间 | P（P）-价值 |
|---|
| T级 | | |
0.003
| | |
0.008
|
| T1与T2-3 | 2.535 | 1.376 − 4.670 | | 2.218 | 1.229 − 4.001 | |
| N级 | | |
0.002
| | |
0.026
|
| N0与N1-3 | 2.257 | 1.335 − 3.816 | | 1.831 | 1.076 − 3.115 | |
| 组织学分级 | | |
0.045
| | | 0.372 |
| I/II与III | 1.685 | 1.013 − 2.804 | | 1.276 | 0.748 − 2.176 | |
| 核HIF-1α | | | 0.599 | | | 0.486 |
| 消极与积极 | 0.682 | 0.163 − 2.846 | | 0.599 | 0.142 − 2.528 | |
| 肿瘤SDHA | | | 0.290 | | |
0.002
|
| 负面/低对高 | 1.570 | 0.681 − 3.620 | | 4.157 | 1.657 − 10.432 | |
| 基质SDHA | | | 0.727 | | | 0.747 |
| 消极与积极 | 1.254 | 0.352 − 4.468 | | 0.807 | 0.218 − 2.978 | |
| 肿瘤SDHB | | | 0.096 | | |
0.012
|
| 负面/低对高 | 0.498 | 0.219 − 1.131 | | 3.223 | 1.295 − 8.025 | |
| 基质SDHB | | | 0.712 | | | 0.965 |
| 消极与积极 | 0.802 | 0.248 − 2.590 | | 0.976 | 0.327 − 2.908 | |
讨论
SDH中的种系缺陷，尤其是SDHA和SDHB，已在多种肿瘤类型中检测到，包括嗜铬细胞瘤（Van Nederveen等人。2009;Astuti等人。2001)副神经节瘤（Van Nederveen等人。2009；Astuti等人。2001；贝索尔2003;Burnichon等人。2010)、GIST（Gaal等人。2011;Gill等人。2010年b；Gill等人。2011年a)以及肾细胞癌（Gill等人。2011年b). 直到最近，SDH突变的准确检测主要依赖于直接测序和免疫印迹，而临床实验室可能会发现这种方法成本太高且耗时。然而，在一项副神经节瘤和嗜铬细胞瘤的研究中，Van Nederveen等。证明了免疫组织化学方法检测SDH中种系突变的高灵敏度（Van Nederveen等人。2009). 虽然具有SDHB、SDHC或SDHD种系突变的肿瘤在SDHA表达完整的情况下表现出SDHB免疫表达的损失，但具有SDHA种系突变的肿瘤表现出SDHA和SDHB的表达的损失。
使用本研究中的类似方法，我们发现721例乳腺癌患者中有23例（3.19%）出现SDHA突变（SDHA–/SDHB–表达），1例（0.1%）出现SDHB突变（SHDA+/SDHB–表达；表). 由于之前很少有研究评估乳腺癌中SDH突变，这些发现为未来的研究提供了一个起点。然而，之前的一项研究报告称，SDH种系突变或变异发生在一些Cowden综合征（CS）患者中，这些患者没有出现预期的PTEN突变。与生殖系PTEN突变阳性的患者相比，这些CS/CS样个体发生乳腺癌、甲状腺癌和肾癌的频率更高（Ni等人。2008). 因此，一些乳腺癌患者可能会出现SDH突变。
本研究的结果可能有限，因为与直接测序相比，免疫组织化学检测SDH突变在乳腺癌中的敏感性尚未得到测试。我们假设乳腺癌的可靠性与检测副神经节瘤和嗜铬细胞瘤中SDH生殖系突变的可靠性相似（Van Nederveen等人。2009). 为了确认SDH突变，应在整个肿瘤（Barletta&Hornick）中检测SDH表达的缺失2012)而在本研究中，免疫组化仅在组织芯片上进行。
在以往对嗜铬细胞瘤和GIST的研究中，SDH缺陷肿瘤显示细胞质颗粒表达完全丧失（Miettinen等人。2011；Gimenez-Roqueplo等人。2003). 即使在极少数SDH缺乏肿瘤的肿瘤细胞中观察到弱的、局部的或弥漫的细胞质染色，这一发现也可能被认为是阴性的，因为它与周围非肿瘤细胞中的强斑点表达模式明显不同。然而，在本研究中，大多数乳腺癌中基质细胞不表达SDHA和SDHB，这使得无法比较肿瘤细胞和内部正常对照（基质细胞）之间的染色强度。因此，根据染色细胞的比例，将肿瘤细胞的表达分为三个等级：等级（1），阴性（完全表达缺失）；等级（2），低（在不到50%的细胞中表达）；等级（3）高（在50%以上的细胞中表达）。
SDH突变参与肿瘤发生的机制有多种，其中HIF-1α途径依赖性机制最为著名。SDH功能丧失突变可能导致细胞内SDH积累，进而抑制HIF-1α（Cardaci和Ciriolo）负调节因子脯氨酰4-羟化酶（PHD）2012；巴莱塔和霍尼克2012). PHD活性受损使HIF-1α在常氧条件下稳定，从而上调参与细胞生长刺激和血管生成的HIF靶基因，从而促进肿瘤进展。由于预计SDH中的功能丧失突变会稳定HIF-1α并上调HIF-1转录活性，因此我们检测了HIF-1 a和SDHA/SDHB的表达。然而，我们发现HIF-1α和SDH在这些乳腺癌中的表达没有密切关系。
SDH缺陷的GIST和肾细胞癌表现出与无SDH突变的肿瘤不同的特征性组织学特征（Miettinen等人。2011；Gill等人。2011年b). 同样，本研究中的SDHA+/SDHB-和SDHA-/SDHB-乳腺癌以较低的组织学分级进行区分（表)在SDHB阴性肿瘤中，Ki-67 LI降低（表). 管腔A型乳腺癌的低/阴性SDHA表达频率最高(P（P） = 0.032，表). 根据这些结果，乳腺癌中SDH突变与低组织学分级和侵袭性较小的分子亚型有关。
SDHA和SDHB阴性的乳腺癌患者也比SDH表达完整的患者年轻，尽管在SDHB的情况下，这种差异没有统计学意义。在肾细胞癌（Baysal）SDH突变的早期研究中2003)，GIST（Miettinen等人。2011)副神经节瘤和嗜铬细胞瘤（Gimenez-Roqueplo等人。2003)，肿瘤也发生在较年轻的年龄段。
许多恶性肿瘤的代谢以Warburg效应为特征，这是一种通过糖酵解进行的高水平无氧葡萄糖代谢，尽管存在线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）相对较低的氧气1956). 在这项研究中，超过50%的乳腺癌表达SDHA和SDHB，它们是通过TCA循环和线粒体电子传递有氧葡萄糖代谢的关键成分。乳腺癌中线粒体高活性的这一发现与早期的报道一致，即乳腺癌细胞表现出线粒体代谢酶如细胞色素C氧化酶、NADH和SDHB的高表达（Whitaker-Menezes等人。2011).
Glut-1和CAIX（糖酵解指标）的表达也已在乳腺癌中观察到，最显著的是在高级别肿瘤如TNBC或基底样癌中（Choi等人。2013；Pinheiro等人。2011). 虽然乳腺癌总体上可能表现出OXPHOS和糖酵解的高活性，但主要的能量代谢模式可能因肿瘤类型而异（Moreno-Sanchez等人。2007：Kallinowski等人。1989；Liu等人。2001).
尽管本研究中大多数乳腺癌基质成分中SDH均为阴性，但基质SDHB的表达在分子亚型之间存在显著差异。HER-2亚型表达频率最高，TNBC表达频率最低（表). 然而，在之前的一项研究中，乳腺癌基质细胞不表达线粒体代谢酶（细胞色素c氧化酶、NADH或SDHB）（Whitaker-Menezes等人。2011). 需要进一步研究以确定乳腺癌分子亚型间质SDHB表达的差异。
总之，在本研究中约3%的乳腺癌中检测到SDHA或SDHB表达缺失。SDH缺乏型乳腺癌患者的诊断年龄较年轻，肿瘤组织学分级相对较低。
同意
发布本报告和任何随附图像时，已获得患者的书面知情同意。
致谢
本研究得到了韩国国家研究基金会基础科学研究项目的支持，该基金会由教育、科学和技术部资助（2012R1A1A1002886）。
脚注
竞争性利益
作者声明没有利益冲突。
作者的贡献
SK参与了研究的设计，并进行了统计分析，起草了手稿。DHK进行了免疫分析。WHJ参与了其设计。JSK构思了这项研究，参与了其设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
参与者信息
Sewha Kim，电子邮件：ca.shuy@6250rewolf.
Do Hee Kim，电子邮件：ca.shuy@10万美元.
吴希荣，电子邮件：ca.shuy@69hwgnuj.
Ja Seung Koo，电子邮件：ca.shuy@6791sjk电话.
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