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癌细胞。作者手稿；PMC 2013年8月14日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2012年8月14日；22（2）：209–221。
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2012.06.07
PMCID公司：PMC3422504型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院389021
PMID：22897851

TAL1复合物控制的人T细胞急性淋巴细胞白血病核心转录调控通路

高美散打,1,* Lee N.Lawton先生,2,* M.Inmaculada Barrasa公司,2 子鹏凡,2,三 霍尔格·科尔哈默,4 亚历杭德罗·古铁雷斯,1,5 马文雪,6 杰西卡·塔塔雷克,7 叶宾安（Yebin Ahn）,1 米歇尔·凯利赫,7 卡特里奥纳·H·M·杰米森,6 路易斯·M·斯塔特,4 理查德·A·杨,2,8和A.托马斯看1,5,#
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关联数据

补充资料

总结

致癌转录因子TAL1/SCL在40%以上的人T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患者中异常表达，强调其在T-ALL分子发病机制中的重要性。在这里，我们确定了由TAL1及其调控伙伴HEB、E2A、LMO1/2、GATA3和RUNX1控制的核心转录调控电路。我们证明TAL1与GATA3和RUNX1形成一个正相互连接的自调节环，TAL1复合物直接激活马来西亚令吉癌基因，形成积极的前馈调节环，加强和稳定TAL1调节的致癌程序。该电路的关键下游目标之一是TRIB2（有毒物质排放清单2）该基因由TAL1和E2A/HEB反向调节，对T-ALL细胞的生存至关重要。

简介

在人类T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中，有助于胸腺细胞发育的正常分子事件被遗传损伤所中断，这些遗传损伤导致分化受阻、增殖失调和异常存活，导致完全转化的白血病细胞克隆性扩增(阿姆斯特朗与卢克，2005年;看，1997年). TAL1/SCL是T-ALL中最常见的致癌转录因子之一，在40–60%的T-ALL病例中过度表达，这是由于染色体易位，即激活的间质缺失(SIL-TAL1公司删除），或未定义反式-作用机制(Brown等人，1990年;费兰多和卢克，2000年;费兰多等人，2002年). 基因表达分析结果表明，TAL1过度表达与CD4处的分化阻滞有关+CD8（CD8）+人类肿瘤和小鼠模型中胸腺细胞的双阳性（DP）期(费兰多等人，2002年;Larson等人，1996年;Tremblay等人，2010年).

TAL1是一种Ⅱ类碱性螺旋环螺旋（bHLH）转录因子，与Ⅰ类bHLH E蛋白（包括TCF3/E2A和TCF12/HEB）形成专性异二聚体(Hsu等人，1991年;Hsu等人，1994年). 在造血细胞中，TAL1通过与E-box基序结合并形成包含E-蛋白、GATA家族成员和几个非DNA-结合LMO蛋白的大复合体来调节其靶基因的转录(Lecuyer等人，2002年;Wadman等人，1997年;Xu等人，2003年). TAL1的表达在胸腺细胞早期发育过程中正常沉默(Herblot等人，2000年); 因此，在DP胸腺细胞中，其表达及其向其直接靶基因招募的调节复合物明显异常。相反，E蛋白作为同源或异二聚体调节基因表达(Kee，2009年)并且是胸腺细胞以特定阶段的方式发育所必需的(Bernard等人，1998年;Herblot等人，2000年). 许多基因被认为是人类T-ALL中TAL1及其调控伙伴的直接靶点(Bernard等人，1998年;Herblot等人，2000年;Ono等人，1998年;Pali等人，2011年b;Palomero等人，2006年). 对小鼠模型的研究表明E2a公司和希伯是高度剂量依赖性的，因为任一基因的单倍体不足都会加速TAL1诱导的T-ALL的发病(O'Neil等人，2004年). 因此，尽管E2A和HEB对TAL1转录复合物的形成至关重要，但每个成员的相对剂量的改变可以通过尚待阐明的机制影响白血病的发病和严重程度。

最近，一些研究小组已经确定了编码多种转录因子的基因在TAL1（目标1）-过度表达的T-ALL亚群，包括运行NX1,马来西亚令吉,NKX3-1型和电动滑行系统家庭成员，例如ERG公司和ETS1型(Clappier等人，2007年;Kusy等人，2010年;Lahortiga等人，2007年;O'Neil等人，2007年;Thoms等人，2011年). 然而，很难将它们整合到一个统一的改变基因调控的网络中，以促进胸腺细胞转化。目前的研究旨在阐明TAL1在这种异常转录回路中的作用。

结果

TAL1结合在多个T-ALL细胞系和原代T-ALL淋巴细胞中高度重叠

我们通过染色质免疫沉淀结合大规模平行DNA测序（ChIP-seq；表S1). 多个TAL1（目标1）-对表达T-ALL的样本进行分析，其中包括两个细胞系（Jurkat和CCRF-CEM；图S1A和1B)以及两个“原移植”样本（“Prima 2”和“Prima 5”），它们来源于免疫低下小鼠中扩增的原代T-ALL细胞，没有任何暴露于在体外文化。异常表达TAL1（目标1）在原代移植物和CCRF-CEM细胞系中，由于约90 kbSIL-TAL公司删除。使用的TAL1抗体的活性通过ChIP验证，然后用不同的特异性抗体进行Western blot分析(图S1C). 值得注意的是，TAL1富含用抗HEB和抗E2A抗体沉淀的染色质(图S1C)不会交叉反应的(图S1D)，与它与这些E蛋白中的每一个异源二聚体的能力一致。

我们首先检查了已知TAL1靶基因的结果，包括CD69型,TCRA公司增强剂和NKX3-1型(Bernard等人，1998年;Kusy等人，2010年;Pali等人，2011年b),并在每个基因调控区的位点检测到TAL1结合(图1A). 我们的结果与之前报道的TAL1结合位点一致，除了NKX3-1型(Kusy等人，2010年)其中，我们发现TAL1在四个T-ALL样本中占据了一个与候选远端增强子一致的区域，但不是先前确定的启动子区域(图1A，右侧）。然后，我们研究了所有四个T-all样本中高置信度TAL1结合区的相对重叠。与Jurkat细胞中NRSF结合区作为阴性对照的结果相比，前200个TAL1结合区的成对比较显示出高度一致性(图1B). 最近邻分析证实了这一结果(图1C). 当我们比较TAL1结合区的相对分布与蛋白编码基因的位置时，大多数结合区位于已知蛋白编码基因基因体和基因间区域内，与增强子元件的位置一致，而不是位于近端或远端启动子的位置(图1D). 因此，在多个T-ALL细胞样本中确定的TAL1结合位点在已知和候选调控元件处基本重叠。

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TAL1在T-ALL细胞系和原代移植物样本中的占有率高度一致

（A）基因轨迹表示TAL1在T-ALL原代移植物（Prima 2和Prima 5）和细胞系（CCRF-CEM和Jurkat）中的结合CD69、TCRA和NKX3-1基因座。x轴表示基因组DNA的线性序列，y轴表示映射读取的总数。每个基因示例上方的黑色横条表示以千碱基（kb）为单位的基因组规模。基因图中的黑框代表外显子，箭头指示转录起始位点的位置和方向。箭头表示受TAL1约束的区域。（B）T-ALL原代移植物和细胞系中TAL1结合区的配对比较。每种细胞类型（行）中由TAL1占据的前200个TAL1结合区在其他细胞类型（列）中的部分显示为矩阵。Jurkat中由无关转录因子NRSF占据的区域作为阴性对照。（C）测定了Prima 5中TAL1结合区中心（前200）到所示转录因子最近结合区中心的距离，并将其分组为bins（x轴）；条形的高度表示每个箱子中绑定区域的总和（y轴）。（D）TAL1结合的每个区域都被定位到最接近的Refseq基因：远端（蓝色）和近端（红色）启动子、外显子（绿色）、内含子（紫色）和基因间区域（浅蓝色），距离基因超过10kb。（E）图中显示了ChIP-seq在TAL1中富集的每个基序的代表位置权重矩阵以及不同T-ALL细胞类型中发现的E值范围。另请参见图S1和表S1.

接下来，我们试图鉴定在每个T-ALL样本中，在TAL1结合峰的200bp内统计上过度表达的DNA基序。在TAL1结合区富集了4个转录因子结合基序，包括E-box（5′-CAG[CG]TG-3′）、GATA（5′-AGATA-3′）和RUNX（5′-TGTGTC-3′），以及ETS转录因子家族识别的基序（5′-GGAA-3′）(图1E). 该序列与ChIP-seq在正常小鼠造血祖细胞和红细胞中识别的TAL1序列高度相似(Kassuf等人，2010年;Wilson等人，2010年)在人类造血细胞中(Novershtern等人，2011年;Pali等人，2011年b;Tijssen等人，2011年). 我们预计TAL1可能在T-ALL中共同调节其靶基因，其复合物类似于在正常造血细胞中发现的复合物。

TAL1复合物控制参与T细胞稳态的基因

为了确定人类T-ALL细胞中由TAL1转录复合体控制的调控网络，我们对分别表达高水平LMO1和LMO2的Jurkat和CCRF-CEM细胞中TAL1及其调控伙伴HEB、E2A、GATA3、RUNX1和LMO1/2进行了ChIP-seq分析(图S1A–C). T-ALL样本中占据的基因组位点显示了TAL1、其调控伙伴和转录共激活物CBP的显著一致性，如已知TAL1复合物靶点、TCRA公司增强剂(Bernard等人，1998年;Hollenhorst等人，2007年)(图2A). 我们确定的E2A结合区包括许多在小鼠胸腺细胞中报告的E2A靶基因，包括PTCRA、NOTCH3、RAG1、RAG2和GFI1型(宫崎骏等人，2011年).

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TAL1与T-ALL细胞中HEB、E2A、LMO1/2、GATA3和RUNX1共占基因组位点

（A）基因轨迹表示TAL1、HEB、E2A、LMO1或LMO2、GATA3和RUNX1在TCRA公司人类T-ALL细胞系中的基因座。请参见图1A图例了解详细信息。（B）Jurkat细胞转录因子结合区的配对比较。每个转录因子（行）的前200个结合区被其他转录因子（列）的所有结合区共同占据的部分显示为矩阵。（C）TAL1、HEB、E2A、LMO1、GATA3和RUNX1在Jurkat细胞中受这些转录因子结合的区域中的分布：第1组（受TAL1，HEB，E2A，LMO1，GATA3或RUNX1结合），第2组（仅受GATA3结合）或第3组（仅由RUNX1结合）。对于每个区域（y轴），以0为中心的序列密度表示重叠的绑定区域。（D）图2C所示区域的基于DREME的基序分析。结果显示为具有E值显著性和搜索序列中模体家族名称的位置权重矩阵。另请参见图S2和表S2-4.

对TAL1、HEB、E2A、LMO1/2、GATA3或RUNX1富集区之间重叠的检查表明，TAL1与大多数HEB和E2A富集区结合，这些富集区经常与LMO1/2，GATA3-和RUNX1-富集区重叠(图2B和S2A公司). 接下来，我们研究了这些因子在高置信度富集区域内的相对结合重叠(表S2)，在两种Jurkat中确定了三类不同的调节元素(图2C)和CCRF-CEM细胞(图S2B). 一个显示多个TAL1复合物成员的一致富集（组1），另一个主要由GATA3单独占据（组2），而第三个主要由RUNX1单独占据（第3组）。

一些研究小组报告说，TAL1复合体经常包含ETS家族成员（例如。，ETS1型)多种造血细胞类型(Pali等人，2011年b;Soler等人，2010年;Wilson等人，2010年). 通过比较我们研究中确定的TAL1复合物成员的ChIP-seq结合谱与其他三组描述的结合谱(Hollenhorst等人，2009年;Pali等人，2011年b;Valouev等人，2008年)与两种非ETS转录因子SRF和NRSF相比，我们确定ETS1占有率与TAL1复合体其他成员的结合相关(图S2C).ERG公司是ETS家族成员，在人类T-ALL细胞中也由TAL1复合物高度表达和调节(Thoms等人，2011年).

由从头开始基序发现方法，基于我们分为三组的区域，确定了第1组转录因子ETS家族的E-box、GATA和RUNX基序，第2组的GATA和ETS基序，以及第3组的RUNX、ETS和SP1基序(图2D). E-box、GATA、RUNX和ETS模体的一致模体分布集中在这三组中ChIP-seq富集的峰值下(图S2D). 此外，第1组中的大多数富集区在中心200 bp范围内至少包含一个E-box或一个GATA基序（Jurkat中n=8245/12748，CCRF-CEM中n=9005/14745）。在小鼠淋巴细胞中发现了许多富含E2A结合区的基序(Lin等人，2010年)，其中它们也经常与ETS和RUNX结合位点相关。

为了确定TAL1复合物所占基因的显性功能，我们比较了目标基因(表S3)确定代表人数过多的功能组(图S2E–G和表S4). TAL1复合靶点富含调节细胞发育、生长和死亡的分子途径，以及已知的致癌、血液和免疫疾病的分子途径(图S2E和S2F). 重要的是，富集基因包括那些调节T细胞发育、分化、形态、细胞数量和活化的基因(图S2G). 这些观察结果表明，在转化的胸腺细胞中，TAL1复合物位于网络的顶点，该网络可驱动异常增殖、分化和存活。

TAL1、GATA3和RUNX1形成正相互连接的自调节环

重要的是，我们发现TAL1复合体的成员经常占据自己和彼此基因的已知和候选调控区域(图3A). 例如，其他人在正常造血细胞中发现的TAL1复合共占增强子的成员，包括GATA3协议3′T细胞特异性增强子(Hosoya Ohmura等人，2011年)，的运行NX1+23增强子(诺丁汉等人，2007年)(图3A)和低分子氧化合物−24增强子(Landry等人，2009年). 一个候选增强子，位于TAL1（目标1）基因，位于SIL（系统完整性等级）和总资产中经常删除的1TAL1（目标1）-T-ALL阳性病例，与之前描述的正常造血细胞的调节因子不同(Gottgens等人，2010年)，由TAL1复合物成员和Jurkat细胞中的CBP共同占据(图3A，左）。使用ChIP-PCR，我们发现这些已知和候选的调控元件TAL1、RUNX1和GATA3协议在原发性T-ALL病例中，TAL1复合物成员也经常共占位点(图3B).

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TAL1、GATA3和RUNX1形成正相互连接的自调节环

（A）基因轨迹表示TAL1、GATA3、RUNX1和CBP在TAL1（右），RUNX1（中）和GATA3协议（左）Jurkat细胞中的基因座。请参见图1A图例了解详细信息。（B）TAL1、GATA3和RUNX1在TAL1（目标1）,运行NX1和GATA3协议多个T-ALL细胞的基因位点。A组所示区域的富集(TAL1（目标1）增强剂，运行x1+23和GATA3+280型)用ChIP-PCR对4个T-ALL细胞样本（Jurkat、CCRF-CEM、Prima 2和Prima 5）进行分析。这个NANOG公司启动子作为阴性对照。误差条表示褶皱富集的标准偏差（SD）。红线表示阴性对照的双重浓缩检测。（C）mRNA（左）和蛋白质（右）水平TAL1、GATA3和运行NX1在Jurkat细胞中敲除（KD）这些因子后。数据为重复实验的平均值±SD*通过两样本双尾t检验，p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001。（D）基因敲除后的生长抑制和凋亡诱导TAL1、GATA3和运行NX1在Jurkat牢房里。在慢病毒感染3和7天后测量细胞活力。生长速率（第7天/3天）报告为对照shRNAs的平均值±SD百分比(GFP公司和吕克)在三个重复的实验中。用AnnexinV-FITC染色的细胞流式细胞术分析慢病毒感染后第4天的细胞凋亡。这些值是重复实验的平均值±SD。星号表示面板C所述的p值。（E）TAL1、GATA3和RUNX1形成的正互联自调节环。基因呈矩形，蛋白质呈椭圆形。另请参见图S3和表S5.

为了进一步分析TAL1复合物的功能，我们使用了两个独立的短发夹RNA（shRNAs）来降低TAL1（目标1）T-ALL细胞系中的表达(图S3A). 在这种情况下，一个已知的靶基因显著下调，ALDH1A2型(Ono等人，1998年)，通过重新表达TAL1（目标1）cDNA(图S3B). 几种与T细胞活化（CD69和CD84）或细胞存活相关的细胞表面标记物体内（CD47）也被下调TAL1（目标1）击倒(图S3C和表S5). 术后基因表达变化分析TAL1（目标1）Jurkat细胞的敲除显示GATA3和RUNX1显著下调(图3C). 类似地，击倒GATA3协议或运行NX1(图S3A)导致这些因子的表达协同下调(图3C). 我们在CCRF-CEM细胞中观察到相同的关系(图S3D)，除了那次击倒GATA3协议或运行NX1没有影响TAL1表达水平，这是预期的，因为在该细胞系中，TAL1的表达由SIL（系统完整性等级）启动子。基因敲除后的这些表达变化表明存在一个涉及TAL1、GATA3和RUNX1的正相互连接的自身调节环，并支持TAL1过度表达在启动环形成中的关键作用。

的击倒TAL1（目标1）在Jurkat细胞中，这些细胞的生长速度降低(图3D和第3e条)，与我们之前的研究一致，使用TAL1（目标1）shRNA#2(Palomero等人，2006年)发表了巴利和同事的研究结果(Pali等人，2011年b). TAL1 shRNA#1诱导表达TAL1的多个T-ALL细胞株的生长受到类似抑制(图S3F和表S5). 我们还检测到shRNA#1转导后凋亡细胞的比例增加，但shRNA#2转导后没有增加(图S3G)，表明TAL1（目标1）检测细胞死亡需要敲除。重要的是，敲低GATA3和RUNX1也抑制细胞生长并诱导凋亡(图3D)这表明，细胞生长和生存需要这三个自动调节环的组成部分。综上所述，我们的结果表明，TAL1复合物的成分在T-ALL中相互正向调节，并促进T-ALL细胞的生长和存活(图3E)强调了这种积极相互连接的自我调节环在维持恶性状态中的重要性。

高置信度TAL1靶点的表达水平对T-ALL亚型进行分类

接下来，我们在Jurkat细胞中每个转录因子基因敲除后进行微阵列基因表达分析(表S6). 基因集富集分析（GSEA）表明，通过ChIP-seq分析富集TAL1结合的基因更有可能在TAL1（目标1）敲除缺少TAL1占用的基因(图4A). 这种差异具有统计学意义（科尔莫戈罗夫·斯米尔诺夫检验，p<2.2E-16），表明TAL1主要作为其直接靶基因在T-ALL中表达的阳性调节器。

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高置信度TAL1靶基因的表达分类T-ALL亚型

（A）基因集富集分析（GSEA）用于确定DNA结合与基因表达变化的相关性TAL1（目标1）.GSEA图表示TAL1目标在整个排名列表的最左侧（被击倒下调）或右侧（被击落上调）的过度表达程度。实心条表示绑定的基因。（B）热图图像表示高置信度TAL1靶标在Jurkat细胞中的相对表达水平，无论是否敲低TAL1（目标1）.两个独立的shRNAs靶向TAL1（目标1）以及两个控制shRNA(GFP公司和吕克)在Jurkat细胞中转导。每一行对应一个基因，并在该行中进行标准化。（C）TAL1与四个T-ALL细胞样本（Jurkat、CCRF-CEM、Prima 2和Prima 5）中的高置信度靶基因（n=302）结合。显示了仅在Jurkat（n=1）或多个T-ALL样本（n=2-4）中结合的高置信TAL1靶点的百分比。（D）TAL1靶基因表达变化TAL1（目标1）CCRF-CEM和RPMI-8402细胞中的敲除。相对表达式值(TAL1、TOX、STAT5A、ALDH1A2、NKX3-1、ARID5B、ETV6和MYB）与相比GAPDH公司对每一行进行计算、标准化并显示为热图。通过双样本双尾t检验，所有基因的变化均显著，p<0.05。（E）基于高置信度TAL1靶基因表达谱对75份原发性T-ALL样本和7份骨髓（BM）样本进行主成分分析。主要T-ALL样本分为三组(TAL/LMO、TLX或HOXA公司)基于原始文章中报道的基因改变(Homminga等人，2011年). 该分析使用了一组238个与TAL1结合的基因，这些基因在TAL1（目标1）击倒（见图4B，左侧）。另请参见图S4,表S6和S7.

进一步的分析基于高置信度TAL1靶基因（n=302），该靶基因显示TAL1结合和表达的显著变化（p<0.05，绝对log2 fold-change≥0.24）TAL1（目标1）击倒(图4B和表S7). 自TAL1（目标1）该基因减少了1.89倍，我们预计其他靶基因的表达会发生适度但一致的变化。与所有基因相比，所选基因的表达变化分布在统计学上存在差异（p<2.2E-16；另见图S4A–C详细信息）。TAL1在四个T-ALL细胞（Jurkat、CCRF-CEM、Prima 2和5）中占据的高置信度靶区内的基因百分比表明，Jurkat细胞中占据的90%的基因在其他T-ALL样本中至少有一个被TAL1占据(图4C). 为了解决在Jurkat细胞中直接受TAL1调控的靶基因是否在TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞，我们分析了其他TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞株和原始T-ALL样本。我们观察到，在TAL1（目标1）在另外两个T-ALL细胞系（CCRF-CEM和RPMI-8402）中敲除；图4D). 75例遗传改变明确的原发性T-ALL样本和7例正常骨髓（BM）样本基因表达水平的主成分分析(Homminga等人，2011年)基于正调控的高置信度靶基因的表达水平（n=238；图4B，左），清楚区分TAL/LMO公司-其他亚组的阳性T-ALL亚组(TLX公司-或HOXA公司-阳性）和BM样本(图4E)，证实了这些TAL1靶基因在TAL1（目标1）-阳性T-ALL病例。TAL1靶点在原代细胞中高表达TAL1（目标1）-阳性T-ALL样本(图S4D).

TAL1与GATA3和RUNX1协同正向调节靶基因

本研究的一个重要问题是GATA3和RUNX1是否与TAL1在T-ALL细胞中协调调节基因表达。当GSEA分析富含GATA3结合的基因时，大多数基因在GATA3协议击倒(图5A)这意味着GATA3是其在T-ALL中表达的积极调节器。相比之下，RUNX1的直接靶点在运行NX1已耗尽(图5B).

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TAL1与GATA3和RUNX1在Jurkat细胞中正向调节靶基因

（A、B）GSEA测定DNA结合与基因表达变化的相关性GATA3协议或运行NX1分别是。请参见图4A图例了解详细信息。（C）热图图像表示Jurkat细胞中高置信度TAL1靶点的相对表达水平，包括或不包括TAL1（目标1）（左），GATA3协议（中间）或运行NX1（右）。请参见图4B图例了解详细信息。（D、E）敲除TAL1高可信靶点后GSEA表达变化GATA3协议或RUNX1。TAL1敲低显著下调的TAL1靶基因（n=238）(图4B，左）用作基因集。

质疑GATA3协议或运行NX1238个高置信度TAL1靶基因的表达缺失表明，这些基因在缺失TAL1（目标1）表达通常也受到GATA3协议或运行NX1表达式(图5C-E)表明TAL1与GATA3和RUNX1协同作用，积极调节T-ALL中的大多数直接靶基因。

MYB癌基因协同调控TAL1靶基因

马来西亚令吉TALL中普遍存在部分通过基因复制介导的过度表达(Clappier等人，2007年;Lahortiga等人，2007年;O'Neil等人，2007年)(图S5A). 查询ChIP-seq数据MYB公司轨迹表明马来西亚令吉是TAL1复合体在TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞系(图6A)表明TAL1复合物直接上调其表达，这是由于TAL1（目标1）TAL1占据的区域包括位于77kb上游的已知位点控制区域Myb公司在小鼠中(拉姆齐和贡达，2008年)和T-ALL细胞中TAL1复合体共同占据的内含子8（+14）内的一个候选调控元件(图6A). 通过ChIP-PCR在T-ALL原代移植物和细胞系中的候选调节元件处观察到TAL1复合物的共现性(图6B). 在所有情况下，马来西亚令吉基因表达对Jurkat和CCRF-CEM细胞中多个TAL1复合物成员的减少敏感(图6C和5亿).

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TAL1积极调节马来西亚令吉癌基因，协调调节TAL1靶基因

（A）基因轨迹表示TAL1、HEB、E2A、LMO1、GATA3、RUNX1和CBP在马来西亚令吉Jurkat细胞中的基因位点。请参见图1A图例了解详细信息。（B）TAL1复合物在马来西亚令吉通过ChIP-PCR检测多个TALL细胞样本中的基因。请参见图3B图例了解详细信息。（C）mRNA（顶部）和蛋白质（底部）水平MYB公司击倒（KD）后TAL1、GATA3和运行NX1在Jurkat牢房里。数据为重复实验的平均值±SD*两样本双尾t检验，p<0.05和**p<0.01。（D）高置信度TAL1靶点表达变化的GSEA马来西亚令吉击倒。TAL1靶基因（n=238）被TAL1（目标1）敲除被用作基因集。请参见图4A图例了解详细信息。（E）由TAL1复合物和MYB形成的正前馈回路，控制T-ALL细胞的基因表达程序。马来西亚令吉被TAL1复合物结合并激活，进而调节同一组基因。另请参见图S5.

因为MYB是已知的正常和恶性造血的转录调节器(拉姆齐和贡达，2008年)，其表达减少可能表明TAL1复合物与T-ALL中该基因之间的转录关系。因此，我们对马来西亚令吉(图S5C)然后进行基因芯片表达分析。结果表明，许多TAL1靶点也被马来西亚令吉击倒(图6D和S5D系列)表明MYB不仅由TAL1诱导，而且还协同上调TAL1控制的靶基因重叠集。因此马来西亚令吉癌基因似乎通过维持T-ALL细胞基因表达程序的前馈电路加强TAL1调节的致癌网络的活动(图6E).

HEB和E2A反对TAL1对关键靶基因的正调控

一些研究小组假设TAL1（目标1）在正常胸腺细胞中，通过将E2A或HEB招募到TAL1复合物中，可以拮抗其在胸腺细胞发育中的生理活性，从而解除对关键靶基因的调控(贝恩等人，1997年;Herblot等人，2000年;O'Neil等人，2004年). 因此，我们接下来询问了HEB公司和E2A型击倒(图S6)直接靶基因的表达。GSEA发现，通过ChIP-seq分析富集HEB或E2A结合的基因在每个基因敲除后可能下调或上调(图7A和7B). 正如预期的那样，40%的TAL1靶基因在TAL1（目标1）击倒也受到了两次击倒的下调E2A公司或HEB公司(图7C–7E，左）。相比之下，被TAL1敲低下调的25%的TAL1靶基因通过缺失E2A公司或HEB公司表达式(图7C–7E，右侧）,表明它们可以在没有TAL1的情况下抑制基因表达。238个基因中只有50个在TAL1（目标1）在击倒HEB公司和/或E2A公司而由7个TAL1靶基因组成的更小的一组则显示出相反的关系(表S8).

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TAL1正向调节HEB和E2A负调控的特定基因子集的表达

（A、B）GSEA测定DNA结合与基因表达变化的相关性HEB公司或E2A公司分别是。请参见图4A图例了解详细信息。（C、D）敲除TAL1高可信靶点后GSEA表达变化HEB公司或E2A。TAL1靶基因（n=238）被TAL1（目标1）击倒(图4B，左）用作基因集。（E）热图图像表示Jurkat细胞在敲除TAL1（目标1）,HEB公司或E2A公司说明了每个基因的相对基因表达水平。另请参见图S6和表S8.

TRIB2（有毒物质排放清单2）是TAL1的关键靶点，是T-ALL细胞生存所必需的

我们还进行了诱导RNA干扰筛选(Ngo等人，2006年)二分之一TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞系（Jurkat和CCRF-CEM），并在高置信度靶点中确定了T-ALL生长所需的四个基因：STAT5A型,TNFSF4型,PI3KC2B项目和TRIB公司2 (表S9). TAL1复合物的一个特别有吸引力的候选靶点是TRIB2（有毒物质排放清单2）(图8A)，其表达被下调TAL1（目标1）通过E2A公司多个TAL1阳性T-ALL细胞系的敲除(图8B). 培养3周后，Jurkat或CCRF-CEM细胞表达两种不同的shRNA靶向TRIB2（有毒物质排放清单2）都耗尽了(图8C). 该结果通过击倒验证TRIB2（有毒物质排放清单2）使用另一个shRNA(图8D)，部分被异位表达的TRIB2（有毒物质排放清单2）cDNA(图8E).TRIB2（有毒物质排放清单2）击倒抑制了额外的TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞系(图8F)并诱导每个细胞系的凋亡(图8G)，但不影响细胞周期相位分布(图S7)表明该因子是T-ALL细胞存活所必需的。一个合理的假设是TRIB2（有毒物质排放清单2）被E蛋白转录抑制，通过易位或染色体内重排上调TAL1的异常表达TRIB2（有毒物质排放清单2）通过与E2A和HEB异二聚体表达，从而积极对抗其对TRIB2（有毒物质排放清单2）轨迹(图8H).

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三元2基因是T-ALL细胞生存所必需的

（A）基因轨迹表示TAL1、HEB、E2A、LMO1、GATA3、RUNX1和CBP在TRIB2（有毒物质排放清单2）Jurkat细胞中的基因位点。请参见图1A图例了解详细信息。（B）mRNA表达的比较TRIB2（有毒物质排放清单2）靶向shRNAs转导的三个TAL1阳性T-ALL细胞系中的基因TAL1（目标1）,E2A型或控制shRNAs并通过qRT-PCR进行分析。显示了平均折叠变化（击倒/控制，log2）。（C）用12500个靶向1050个基因的诱导型shRNA筛选shRNA，对两个TAL1（目标1）-阳性T-ALL细胞株（Jurkat和CCRF-CEM）。耗尽TRIB2（有毒物质排放清单2）来自细胞群体的shRNAs被计算为未诱导/诱导的log2，并显示为四个独立实验平均值的平均值±标准误差。（D）生长抑制TRIB2（有毒物质排放清单2）击倒Jurkat细胞。在慢病毒感染对照组（GFP）和TRIB2（有毒物质排放清单2）shRNA。显示了与第3天相比的生长速率（折叠式变化）。数值为三次试验的平均值±SD。（E）包含野生型的cDNATRIB2（有毒物质排放清单2）编码区通过Jurkat细胞的逆转录病毒感染转导，然后通过慢病毒介导的感染细胞转导GFP公司或TRIB2（有毒物质排放清单2）shRNA。评估慢病毒感染后的生长速度（第7天/3天）TRIB2（有毒物质排放清单2）shRNA相对于GFP公司shRNA和表示为三次实验的平均值±SD；**两样本双尾t检验的p<0.01和***p<0.001。（F）对每一组的生长率（第7天/3天）进行评估TRIB2（有毒物质排放清单2）相对于对照的shRNAGFP公司每个细胞系（Jurkat、RPMI-8402、PF-382或MOLT-4）中的shRNA，并报告为三次实验的平均值±SD。（G）通过流式细胞术分析AnnexinV-FITC染色的细胞，在慢病毒感染4天后，在4个T–ALL细胞系中检测细胞凋亡。数值为三次试验的平均值±SD。（H）正常与恶性T细胞中E蛋白（HEB和E2A）靶点的差异调节模型。TRIB2（有毒物质排放清单2）正常细胞（左侧）中被HEB和E2A抑制的基因被T-ALL（右侧）中的TAL1复合物上调。另请参见图S7和表S9.

讨论

我们已经确定了一组转录调控因子，它们与TAL1合作生成一个“核心”调控回路，有助于人类T-ALL的启动和维持。关键的是，我们发现TAL1、GATA3和RUNX1共占元件各自的基因和彼此的基因，形成一个正相互连接的自我调节环。这种网络结构提供了一种手段，通过这种手段，单个致癌转录因子的异常表达可以对导致恶性转化的整个基因表达程序产生持续影响。事实上，这种调控结构已被证明可以加强和增加基因表达程序的稳定性(阿龙，2007)，进而建立和维持关键的细胞状态，如胚胎干细胞的多能性(Young，2011年).

GATA3和RUNX1的表达分别在CD4或CD8单阳性细胞的正常T系承诺中是必需的(Collins等人，2009年;Ho等人，2009年). 因此，TAL1持续上调GATA3和RUNX1可能导致DP期分化阻滞。因此，RUNX1的过度表达似乎有助于胸腺细胞转化TAL1（目标1）-T-ALL阳性，与其作为肿瘤抑制因子的作用形成鲜明对比，其功能丧失会促进急性髓细胞白血病（AML）和骨髓增生异常综合征的发病。两组最近也报告了失活运行NX1T-ALL早期胸腺细胞前体（ETP）亚群的突变(Della Gatta等人，2012年;Grossmann等人，2011年). ETP白血病不同于TAL1（目标1）-T-ALL阳性，通常在胸腺细胞发育的DP阶段表现为阻滞，并涉及导致转化的不同异常分子途径(Coustan-Smith等人，2009年;古铁雷斯等人，2010年;Zhang等人，2012年). 因此，尽管存在失活运行NX1我们的数据显示，ETP T-ALL的突变表明，在胸腺细胞发育的晚期DP阶段被阻断的T-ALL中，RUNX1是参与增强和稳定恶性细胞状态的相互连接的自身调节环的关键成员。

我们还鉴定了一个致癌转录因子基因，马来西亚令吉，作为TAL1的直接靶点，在TAL1（目标1）-T-ALL阳性病例。它通过一个可能起到稳定TAL1致癌程序作用的正前馈环与TAL1控制的转录网络整合，类似于最初在模型生物中发现的机制(阿龙，2007). 这个Myb公司基因被报道为塔尔1小鼠造血祖细胞中的靶点(Wilson等人，2009年)这可能反映了白血病干细胞和正常干细胞共有的一个重要调节模块。MYB最近涉嫌控制AML中异常的自我更新项目(Zuber等人，2011年)增强了其作为T-ALL中TAL1复合物介导的前馈调节基序靶点的潜在重要性。这种转录调控回路也与正常造血有关(Novershtern等人，2011年)可能有助于TAL1过度表达胸腺细胞转化状态的建立和稳定。

正如我们在原代T-ALL细胞中对ChIP-seq分析所做的那样，用shRNA敲除来确认和扩展我们的结果将是重要的。一些研究小组已经报告成功地在原代T-ALL细胞中敲除shRNA基因(Gerby等人，2009年;Kusy等人，2010年;Pali等人，2011年a;Pali等人，2011年b). 这些程序包括使用新一代质粒改进慢病毒的生产(Pali等人，2011年a;Pali等人，2011年b)或新的假分型载体，产生IL-7显示慢病毒载体，促进有效基因转移到原代T细胞(Gerby等人，2009年;Kusy等人，2010年;Verhoeyen等人，2003年). 我们现在正试图优化这些程序，以便将shRNA转导到从我们的原代移植模型中移植的原代T-ALL细胞中。建立后，该方法应有助于追踪从头开始严重白血病。

我们还对TAL1及其伙伴HEB和E2A差异调节的基因集进行了全面分析。这三种相互作用蛋白的许多直接靶点由于与关键调控区域结合而协调上调。当E2A和HEB共同表达时，这些直接靶点中只有一小部分在生理上受到不同的调节，而当TAL1（目标1）异常过度表达。我们研究的这一方面对理解T-ALL发病机制至关重要，因为它直接解决了体内数据表明两者的单倍体不足E2a公司或希伯明显加速T-ALL的发病塔尔1-转基因小鼠(O'Neil等人，2004年). 在T-ALL细胞中TAL1直接靶向的相对较小的一组基因中，只有那些被TAL1激活但被E2A和HEB抑制的基因才会产生这种表型。就恶性表型的贡献而言，其中一些基因可能无关紧要，例如那些通常只在激活的成熟T细胞中表达的基因（例如。，CD28编号和格姆扎)以及与T细胞谱系完全无关的基因（例如。，KRT1公司和KRT2公司).

哺乳动物基因毛球族家庭(三合一，2和三)编码含有假激酶结构域的蛋白质，这些结构域不能直接磷酸化靶蛋白，而是作为负向调节关键细胞信号通路的适配器(2011年横山和中村). 的过度表达三元2通过逆转录病毒在小鼠造血干细胞中的转导，确定其为导致AML的癌基因(Keeshan等人，2006年). 我们的数据表明，TRIB2是T-ALL细胞生存所必需的。在我们分析之前，没有证据表明TRIB2（有毒物质排放清单2）在T-ALL发病机制中，尽管这种作用并不完全出乎意料，因为TRIB2（有毒物质排放清单2）在与T细胞有共同特征的AML病例的特定亚群中，以及该基因作为NOTCH1靶点的状态(Wouters等人，2007年). 自TRIB2（有毒物质排放清单2）是NOTCH1和TAL1转录因子上调的直接靶点，我们的数据表明，其表达水平的逐渐增加有助于异常TAL1（目标1）表达和突变激活槽口1在T-ALL的发病机制中。

实验程序

T-ALL细胞样本

人类T-ALL细胞系保存在RPMI-1640培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，该培养基补充了10%的FBS（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素（Invitro gen）。在知情同意和机构审查委员会（IRB）批准的情况下，从接受Dana-Farber癌症研究所05-01研究治疗的儿童中获取诊断性T-ALL样本，并在加州大学圣地亚哥分校（UCSD）人类研究保护计划的现有IRB批准下使用，题为“方案070678：允许从血液学问题患者（成人）处采集血液和/或骨标本和/或肿瘤样本和/或唾液用于研究”。人CD34+将T-ALL细胞移植到抹布2−/−γc−/−小鼠将细胞作为“原代移植物”进行繁殖。本研究严格按照加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会的建议进行。委员会根据动物使用协议编号S06015批准了该协议。从这些原代移植物中分离出人类白血病细胞，并用于TAL1 ChIP-seq分析。

染色质免疫沉淀（ChIP）

根据上述方法进行ChIP(Lee等人，2006年). 抗体和详细的ChIP条件可以在补充实验程序对于ChIP-seq分析，Solexa/Illumina测序和分析是根据(Marson等人，2008年).

shRNA敲除分析

shRNA序列被克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro中。使用FuGENE 6试剂（印第安纳波利斯罗氏）将每个构建物与δ8.9和VSV-G共转染到293T细胞中。收集、过滤含有慢病毒的上清液，并将其添加到T-ALL细胞系中。通过RNA的qRT-PCR或蛋白质印迹验证敲除水平。

RNA提取、cDNA和表达分析

我们使用Trizol（Invitrogen）提取mRNA，然后使用RNeasy Mini Kit（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGEN）进行柱纯化。使用QuantiTect（Qiagen）对纯化的RNA进行逆转录。使用基因特异性引物和Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）在AB7300检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行定量实时qPCR。

微阵列表达分析

在Jurkat细胞中进行的两次生物复制的总RNA样本用于评估每个转录因子的两个靶shRNA与在Affymetrix HG U133 2.0 plus微阵列上重复进行的两个对照shRNA的基因表达变化。详细分析见补充实验程序GSEA（马萨诸塞州剑桥市布罗德研究所）通过比较对照样品和敲除样品，对ChIP-seq识别的直接靶点进行了检测。这些基因是ChIP-seq根据shRNA敲除后显著的基因表达变化（绝对log2-fold-change≥0.24；p值<0.05）确定的直接TAL1靶基因，被定义为高置信度TAL1目标并用作基因集。

​

重要性

对胚胎干细胞的研究揭示了控制多能性和自我更新的“核心”转录调控电路，这增加了类似机制可能导致恶性转化的可能性。在这里，我们鉴定并解剖了一个由T-ALL细胞中TAL1异常表达控制的核心转录调控电路。我们的研究结果表明，TAL1及其结合伙伴GATA3和RUNX1形成一个阳性的自身调节环，通过涉及MYB癌蛋白的前馈机制加强，这可能有助于胸腺细胞恶性状态的启动和维持。此外，我们暗示TRIB2（有毒物质排放清单2）它由TAL1和E2A/HEB反向调节，是T-ALL细胞生存所必需的。

亮点

  • TAL1、GATA3和RUNX1形成一个正相互连接的自调节环
  • TAL1核心调控电路控制参与T细胞稳态的基因
  • TAL1复合体在正向前馈调节回路中招募MYB
  • TRIB2（有毒物质排放清单2）受TAL1和E蛋白的相反调节，对细胞生存至关重要

补充材料

01

单击此处查看。（7.7M，docx）

致谢

我们感谢Look and Young实验室成员的讨论和批判性审查，感谢Jennifer O'Neil的初步实验和TAL1质粒。我们感谢Garrett Frampton和Dave Orlando开发ChIP-seq分析工具并继续支持分析。我们还感谢Whitehead Genome Technology Core（V.Dhanapal、J.-A.Kwon、J.Love、S.Gupta和T.Volkert）在ChIP-Seq和表达阵列杂交方面提供的帮助，并感谢BaRC的Bingbing Yuan开发表型本体分析。我们感谢RNAi联盟提供慢病毒shRNA构建物，并感谢John R.Gilbert对原稿的编辑和批判性审查。本研究得到了国家癌症研究所（5P01CA109901、5P01CA 68484和1K99CA 157951）以及NIH、国家癌症研究院、癌症研究中心的校内研究计划的资助。T.S.得到了威廉·劳伦斯和布兰奇·休斯基金会、儿童白血病研究协会和日本科学促进会的资助。W.M.和C.J.得到了CIRM白血病团队的资助。

脚注

加入人数

表达式数据和ChIP-seq可以在网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/在超系列登录号下GSE29181标准.

补充信息

补充信息包括补充实验程序，7张图和9张表，可以在网上找到这篇文章。

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