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临床投资杂志。2000年3月1日；105(5): 673–681.
doi（操作界面）：10.1172/JCI5826
预防性维修识别码：项目经理289169
PMID：10712439

变异型假Hurler多营养不良症（粘脂蛋白病IIIC）的分子基础

安妮克·拉斯·罗斯基尔德,1,2 瓦莱丽·科尔米尔·戴尔,2 《明报》,3 艾曼纽尔·杰宁,4 雷米·所罗门,2 凯文·布鲁尔,3 玛莎·齐格勒,1 汉娜·曼德尔,5 史蒂夫·托斯,6 布鲁斯·罗,6 阿诺德·穆尼奇,2和威廉·M·坎菲尔德3
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

黏液表皮病IIIC，或变异性假Hurler多营养不良，是一种溶酶体水解酶运输的常染色体隐性疾病。与相关疾病粘脂蛋白II和IIIA不同，粘脂蛋白IIIC中受影响的酶(N个-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶[GlcNAc-磷酸转移酶]）在合成底物上保持完全的转移酶活性，但在溶酶体水解酶上缺乏活性。牛GlcNAc-磷酸转移酶最近被分离出来，是一种具有亚单位结构α的多亚单位酶2β2γ2我们克隆了人γ亚基的cDNA，并将其基因定位于染色体16p。我们还表明，在一个表现出这种疾病的大型多重Druze家族中，MLIIIC也映射到这个染色体区域。对来自3个家族的患者的γ-亚基cDNA的序列分析发现，γ亚基密码子167中有一个移码突变，该突变与疾病分离，表明MLIIIC是由磷酸转移酶γ-亚基基因突变引起的。据我们所知，这是对人类粘脂蛋白病分子基础的首次描述，并表明γ亚基在溶酶体水解酶识别中起作用。

介绍

粘多糖II、IIIA和IIIC是溶酶体酶贩运的3种相关疾病。虽然罕见疾病，但自首次描述以来的20年里，它们一直是广泛研究的对象(1). 对这些疾病的研究揭示了溶酶体酶靶向的先前未知过程(2,3)对发现甘露糖6-磷酸依赖的溶酶体酶转运途径至关重要(4,5; 有关最新评论，请参阅参考文献。6). 高等真核生物中大多数溶酶体水解酶的运输由M6P依赖途径介导，其中新合成溶酶体水解酶上的天冬酰胺连接低聚糖被特异且唯一地修饰为含有末端M6P。M6P修饰物生物合成的初始和决定步骤由UDP酶催化-N个-乙酰葡萄糖胺：溶酶体酶N个-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶（GlcNAc-phosphotophydrase）。GlcNAc-磷酸转移酶催化GlcNAc1-磷酸从UDP-GlcNAc转移到溶酶体水解酶上的特定α1,2-键甘露糖(7). 途径中的第二种酶，N个-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸二酯α-N个-乙酰氨基葡萄糖苷酶去除覆盖物GlcNAc，生成末端M6P。携带M6P修饰的溶酶体酶然后与2个M6P受体中的1个结合反式-高尔基体和转移到溶酶体(5,8). 在缺乏GlcNAc-磷酸转移酶的情况下，溶酶体酶无法获得M6P，进入分泌途径，并由细胞分泌。

GlcNAc-磷酸转移酶活性在2种不同的常染色体隐性遗传人类疾病中缺乏。黏液表皮病III（MLIII；伪Hurler多营养不良症；MIM 252600）最初被描述为一种溶酶体贮存性疾病，其形态学改变类似于Hurler综合征(9). 假性Hurler多营养不良与Hurler综合征的区别在于进展较慢，无器官肥大，无粘多糖尿。典型的临床表现包括手和肩僵硬、爪畸形、脊柱侧凸、身材矮小、面部粗糙和轻度精神发育迟滞。放射学上，髋关节多发性严重骨发育不良是一种特征性疾病，常导致残疾(10). 在培养的成纤维细胞中发现血清溶酶体酶水平升高和/或溶酶体酶类水平降低，可以证实临床诊断。或者，可以在培养的成纤维细胞中直接测定GlcNAc-磷酸转移酶(11,12). 在MLIII中，GlcNAc-磷酸转移酶活性降低，而在黏液脂沉积症II（MLII；包合细胞[I-cell]病；MIM 252500）中则无此活性，这是一种在前十年内通常致命的更严重的疾病。GlcNAc-磷酸转移酶的缺乏被认为是MLIII和MLII的主要遗传缺陷，尽管这尚未在分子水平上得到证实(11,13). 培养的MLIII成纤维细胞，像MLII成纤维细胞一样，表现出具有显著细胞质内含物的I细胞表型，这表示含有因溶酶体酶运输失败而无法降解的摄入物质的溶酶体。

疾病MLII和MLIII之间的关系尚未确定。最初，有人提出，这两种疾病仅在残留GlcNAc-磷酸转移酶活性的量上存在差异。或者，这两种疾病的分子基础可能是不同的。通过基因互补研究证明了MLII与一些MLIII成纤维细胞的互补性，支持了后来的建议(14).

MLIII本身具有遗传异质性。异核体分析已被用于将MLIII分为3个不同的互补群(15,16). 互补组A（经典MLIII）的特征是所有底物上测得的GlcNAc-磷酸转移酶活性中度降低。补充组B由一名临床特征不典型的患者代表；这个病人与其他疾病的关系尚不明确。当使用溶酶体糖蛋白作为受体进行检测时，补体组C（变体或伊朗变体MLIII）的特征是活性不足，但当使用简单受体α-甲基甘露糖苷进行检测时，活性正常(16,17). 变体MLIII表型仅限于MLIIIC互补组，这两个名称似乎指的是同一原发性缺陷的生化和遗传表现(14).

牛GlcNAc-磷酸转移酶最近被纯化为一种由3种不同亚单位（α2,β2,和γ2) (18). GlcNAc-磷酸转移酶是2个基因的产物，1编码α和β亚单位，2编码γ亚单位（W.M.Canfield，未发表的研究）。通过鉴定GlcNAc-磷酸转移酶为多亚单位酶，我们试图确定生化鉴定的亚单位、互补基团和粘多糖之间的关系。我们现在报道了人GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基cDNA的分离和该基因在染色体16p上的定位。利用多态性微卫星标记进行纯合子定位导致变异体MLIII定位到染色体16p。对3个家系的变异体MLIII患者的γ亚基cDNA进行直接序列分析表明，单个碱基插入导致移码和提前终止。这些结果表明，MLIIIC可能由GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基基因突变引起。

方法

氨基酸测序。

如前所述，通过单克隆抗体免疫亲和层析分离牛GlcNAc-磷酸转移酶（1.5 mg）(18). 通过在0.2-mL POROS 50 HQ柱上用0.025 M Tris HCl（pH 7.4）平衡的色谱柱上去除Lubrol，然后在含有0.5 M NaCl的缓冲液中洗脱。酶被变性、还原和烷基化，亚基通过色谱在1.0×30 cm的Superose 6柱上分离，Superose6与5%甲酸平衡。在应用生物系统492型蛋白质测序器（美国加利福尼亚州福斯特市Perkin-Elmer Applied Biosystems）中，对等分样品进行自动Edman降解。用胰蛋白酶对第二等分样品进行消化，并用反相微孔HPLC分离胰蛋白酶肽并进行类似测序。

cDNA克隆。

通过使用SP6启动子引物和5′-GTAGACGGCTCCGCTCG-3′，将从美国纽约州格兰德岛生命科技公司（pSPORT1）人脑cDNA文库中扩增的85-bp EcoRI-ApaI片段与EST 48250中的1147-bp ApaI-Not I片段连接到EcoRI/Not I切割pcDNA3中，组装出γ亚基的全长cDNA。

DNA序列分析。

如前所述，使用Thermus aquaticus（Taq）DNA聚合酶、通用正向、反向DNA或定制测序引物以及Perkin-Elmer Cetus染料标记Taq终止剂（美国康涅狄格州诺沃克市Perkin-Elmer Corp.）对I.M.A.G.E.克隆48250进行测序(19). 这些反应在Perkin-Elmer Cetus DNA Thermocycler 9600中培养30个周期，通过Sephadex G-50过滤去除多余的引物后，在经过拉伸升级改造的ABI 373A自动测序仪（Perkin-Elmer Applied Biosystems）上通过电泳来解析荧光标记的嵌套片段集。使用ABI分析软件（2.1版）进行基本调用后，将分析数据传输到Sun Sparcstation II（Sun Microsystems，Palo Alto，California，USA），并使用TED跟踪编辑器程序编辑电泳图。使用XGAP程序分析重叠序列和连续序列(20,21). 分析了足够的数据，以获得每个基地至少3倍的覆盖率。

GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基表达的多组织Northern印迹分析。

用标记有[32P] 用Klenow碎片随机启动六聚体。用0.1×SSC和0.1%SDS在65°C下清洗印迹，并在-70°C下暴露于Biomax胶片（美国纽约州罗切斯特市伊士曼柯达公司）中3小时。

患者。

对来自以色列北部的三个近亲家庭进行了研究。德鲁兹血统家族1包括28名个体（18名健康，10名受MLIII影响）。家庭2（6名健康者和2名受影响者）和家庭3（5名健康者，2名受感染者）均为阿拉伯血统。

MLIII的临床诊断基于典型的临床、影像学和生化特征。临床标准包括手肩僵硬、爪畸形、脊柱侧凸、身材矮小、面部粗糙和轻度精神发育迟滞。X线标准包括多发性骨发育不良伴髋关节渐进性破坏。生化标准包括血清溶酶体酶水平（芳基硫酸酯酶A、β-己糖胺酶、α-甘露糖苷酶）至少增加10倍和/或培养成纤维细胞内溶酶体的酶水平较低。

基因分型。

用标准方法从外周血淋巴细胞中分离DNA。基因分型采用基于聚合酶链式反应的炒作可变微卫星技术(22). PCR反应包含基因组DNA（100 ng）、Taq聚合酶（1个单位）、50 pmol每种引物、6.25 nmol每种脱氧核苷酸三磷酸、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl[pH 8]、1.5 mM MgCl2和0.1%明胶，最终体积为25μL。

PCR在热循环器（Perkin-Elmer 480）中进行，初始变性10分钟，变性30个循环（94℃，40秒），退火（55℃，40秒钟），延伸率（72℃，40秒内），最终延伸率（72C，10分钟）。将一等分扩增反应变性（10分钟，94°C）并加载到6%聚丙烯酰胺变性凝胶上。在转移到Hybond N+膜（美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech）并在0.4 N NaOH中交联后，膜与（CA）杂交12过氧化物酶标记探针（Amersham ECL试剂盒）在42°C下至少8小时。在0.3×SSC、0.1%SDS、42°C中洗涤一次印迹15分钟，然后在0.2×SSC溶液中洗涤两次，每次20分钟，并使用Amersham ECL试剂盒显示杂交带。

联系分析。

使用MLINK联动程序包（5.1版）进行两点联动分析(23,24). 使用了具有完全外显率的常染色体隐性遗传，假定疾病等位基因频率为0.0001，以及CEPH等位基因的频率。由于大量近亲交配环产生了过多的计算需求，将系谱1分成5个同胞，分别进行分析，并对lod得分进行汇总，从而降低了系谱的整体统计能力。同胞组1-5由VI:1-8组成；五： 2-10；六： 9-14岁；八： 1-6和V:17-25。如联动软件手册所述，母亲的近亲繁殖循环被打破(23,24). 用MAPMAKER/HOMOZ进行纯合子定位(25). 通过最小化重组事件的数量来构建单倍型。利用HOMOZ程序将家系划分为5个同胞，并用5个相关标记构建了一个多重图谱。

突变γ亚基cDNA的序列分析。

使用QIAGEN试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENInc.）从培养的皮肤成纤维细胞中分离出总RNA，并使用GeneAmpkit（Perkin-Elmer）用寡核苷酸dT逆转录生成cDNA，用以下引物对扩增出3个片段：5′-GAGGCAGGTGCGGCTCTA-3′；5′-GCGGTTCCAGCGGAAGGTCTGC-3′；5′-GTTCCACAACGTGACCCACCAGCAGCA-3′；5′-GTGACGCTCATCGGCCAGGT-3′；5′-GCAGCGGCAGTGGGACCGT-3′；和5′-TCCACTCTCGCTCCCACA-3′。

PCR在94℃初始变性10分钟后进行，包括30个循环（变性94℃，40秒；退火65℃，40秒钟；延伸72℃，40秒内）。

扩增产物被加载到2%Nusieve-琼脂糖凝胶上，通过酚氯仿萃取纯化，并通过乙醇沉淀回收。使用荧光双脱氧终止子方法对两条链进行测序(26). 根据制造商的协议，使用Applied Biosystem 373A DNA测序器分析荧光序列。

单品牌构象多态性。

单核苷酸构象多态性（SSCP）分析(27)用正向引物5′-AGCACCTGCGTTACGGCGCT-3′和反向引物5’-GGGGG TGCGGAACGATCACAT-3′进行PCR-扩增基因组DNA，产生68-bp产物。通过添加20μCiα-[P标记产品33]-dCTP到PCR反应。PCR产物在95°C下变性10分钟，然后加载到氢键MDE凝胶上（法国蒙特勒的Bioprobe Systems），并在0.6 TBE中在3 W下电泳10小时。凝胶干燥并进行放射自显影。

GlcNAc磷酸转移酶测定。

GlcNAc磷酸转移酶向α-甲基甘露糖苷的转移用β-[32P] -如上所述的UDP-GlcNAc(28). 通过在37°C下将溶解的膜组分与40μM的子宫铁蛋白和10μCi孵育16小时来转移到子宫铁蛋白[32P] -UDP-GlcNAc公司。然后用10%的三氯乙酸沉淀子宫铁蛋白，在12%的SDS-PAGE凝胶上通过电泳进行解析，并通过磷成像仪（美国加利福尼亚州森尼维尔市分子动力学研究所）进行放射性定量。采用微量BCA分析法对蛋白质进行定量（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯化学公司），结果表示为与正常人成纤维细胞对照组相比，每毫克蛋白质中含有pmol GlcNAc-1磷酸盐。

接入号码。

GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基cDNA已保存在GenBank中，注册号为179091。

结果

人GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基cDNA的克隆和鉴定。

纯化的牛GlcNAc-磷酸转移酶被还原和烷基化，并通过凝胶过滤分离γ亚基。NH的序列2-末端AKMKVVEEPNTFGLNNPFLPQTSRLQP和胰蛋白酶肽LAHVSEPSTCVY通过自动Edman降解测定。

当肽序列用于使用程序TBLASTN搜索数据库时(29)共鉴定出3个人类表达序列标签（EST）。EST 29315和179293包含一个99-bp的共同序列，其中20/22氨基酸序列的部分代码与牛γ亚基NH相匹配2-端子顺序。EST 280314包含与胰蛋白酶肽序列匹配的12/12氨基酸。EST 29314和EST280314之间的关系用5′-GCGAAAGATGAAGAGAGAGACC-3′正向引物PCR证实，对应于NH2-末端蛋白序列和反向引物5′-GTAGACGCAGGTGCTCCGCTCG-3′，对应于以人脑cDNA文库为模板的胰蛋白酶肽序列。获得402-bp产物，测序后证明EST 29315和280314来自一个普通cDNA，45-bp序列桥接了该缺口。

获得了测定280314 EST序列的I.M.A.G.E.克隆48250，并对其进行了测序，结果表明该克隆有1151-bp的插入物，其中包含一个几乎全长的γ亚基cDNA，编码部分仅缺失起始蛋氨酸。用SP6启动子引物作为正向引物，通过对人脑cDNA文库的PCR获得cDNA的剩余5′部分，之前描述的反向引物在克隆和测序后产生了569-bp的产物，该产物包含23 bp 5′非翻译序列和引发剂蛋氨酸的密码子。

GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基cDNA的序列分析。

包含20 bp poly（a）尾部的1219 bp cDNA序列如图所示​图1a。1a.预测的915 bp开放阅读框起始于碱基24处的潜在引发剂ATG密码子，结束于碱基939处的TGA终止密码子。该cDNA缺乏一致的多聚腺苷化信号。序列中的第一个ATG满足引发剂蛋氨酸的一致序列(30). 在引发剂之后，甲硫氨酸是24个氨基酸的信号肽，随后是共有信号肽酶切割位点(31)就在实验确定NH之前2-末端丙氨酸。该序列预测了一个含有281个氨基酸的成熟蛋白质，分子量为31827。使用Pustell protein Matrix（MacVector，版本4.5.3；Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA）搜索蛋白质基序，仅发现2个N个-糖基化位点。序列预测成熟蛋白包含7个半胱氨酸，奇数与牛GlcNAc-磷酸转移酶中发现的二硫键γ亚基同二聚体一致。

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(一)人类GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基cDNA的核苷酸和推导的氨基酸序列。预测的蛋白质序列显示在DNA序列下方。假定的信号肽由虚线表示。与牛γ亚基同源的序列用单下划线表示。两个潜在的站点N个-连接的糖基化用双下划线表示。(b条)GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基的Northern blot分析。将γ亚基cDNA随机标记并与人多组织Northern印迹杂交（CLONTECH）；每条车道含有2μg聚（A）+来自指定组织的RNA。在65°C下，在0.1×SSC和0.1%SDS中清洗过滤器，并暴露18小时。在一，在所有组织中鉴定出1.3 kb的转录本，在肺部鉴定出更多的转录本；在里面b条杂交后，剥离印迹，并用人β-actin mRNA探针重新杂交，作为负载对照。

BLOCKS数据库的搜索(32)以及使用BLASTN或BLASTP算法的瑞士Prot GenBank和dbEST数据库(29)与已知功能的基因没有明显的相似性。然而，从7个独立的cDNA文库中分离出的许多人类EST几乎相同（>95%相似性）。

用全长γ亚基cDNA进行的多组织Northern杂交显示，在所有8个检测的人类组织中都有一个1.3kb的转录物（图​（图1b）。1b） ●●●●。该转录物的大小表明，我们分离的1189 bp cDNA克隆代表全长mRNA。在肺部发现了高达7.5 kb的其他转录物，与交替剪接、不完全加工或多聚腺苷化变化一致。

COS细胞γ亚基基因产物的生化特性。

GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基的瞬时表达是通过在载体pRcRSV中亚克隆表位标记的cDNA获得的(33). 该结构用人转铁蛋白信号肽（MRLAVGALLVCAVLGLCLA）取代天然信号肽，并将HPC4钙依赖表位（EDQVDPRLIDGK）添加到NH2-成熟γ亚基的末端。作为阴性对照，COS细胞也与载体平行转染。转染48小时后，分离细胞膜，溶解膜蛋白，进行SDS-PAGE，并转移到硝化纤维素膜上。用小鼠单抗HPC4检测表位标记的γ亚基[125一] 兔抗鼠IgG和放射自显影（图​（图2）。2). 在转染表位标记的γ-亚基cDNA但不单独转染载体的COS细胞中，35-kDa蛋白表达，形成类似于牛GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基的二硫键同源二聚体。

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人GlcNAc磷酸转移酶γ亚基在COS细胞中的表达。通过免疫印迹分析转染表位标记的γ亚基cDNA或载体对照的COS细胞的膜组分。样品在还原和非还原条件下用7.5%SDS-PAGE进行分析，然后转移到硝化纤维素膜上，用单克隆抗体HPC4和125I标记的山羊抗鼠IgG。在标记为+SH的通道中电泳的样品中，用10%的β-巯基乙醇还原了二硫键。分子质量标记的迁移位置（单位：kDa）如左图所示。

人类GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基基因的染色体定位。

美国东部时间T30150型此前通过基因桥4辐射杂交板的辐射杂交定位，已定位到染色体16p（D16S3024-D16S3070）(34). 这些结果表明γ-亚基基因也定位于16p染色体。

MLIII与染色体16p的连锁。

为了测试MLIII是否由γ亚基基因突变引起，在以色列北部的一个大型多重MLIII家族中使用来自染色体16p的5个多态性微卫星标记进行了连锁分析（图​（图3，3，系列1）。由于多个近亲繁殖环的计算复杂性，家族1被分析为5个独立的同胞。表​表11显示了16号染色体微卫星标记和疾病位点之间的成对lod评分。探针AFMa134xcl在D16S3024位点获得最大成对lod评分（θ=0时Zmax=10.04）。多态性标记在D16S3070和D16S3082位点的lod得分也为正（θ=0时Zmax=3.81，θ=0.时Zmax=9.39）。为估计MLIII基因的位置而进行的多点连锁分析在D16S3024位点给出了11.59的lod峰值得分。MLIII基因座位置的最大似然估计值由基因座D16S521和D16S3072在7 cM的遗传区间内定义（图​（图44).

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3个MLIII家系的系谱。家族1起源于德鲁兹；家族2和家族3都是阿拉伯血统。圆圈表示女性家庭成员；广场，男性家庭成员；实体符号，影响家庭成员；和带有斜线符号的已故家庭成员。

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使用DNA标记D16S521-D16S3024-D16S3070-D16S3082-D16S307和MAPMAKER/HOMOZ对MLIII位点进行多点连锁分析。横坐标上5个标记位点之间的遗传距离用cM表示，并基于1996年的Généthon人类遗传连锁图。

表1

MLIII（家系1）与染色体16p上5个多态性DNA标记的双对数核

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MIII中GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基突变的鉴定。

在家族1（VI:8）和家族3（II:3，II:4）的先证者中使用3组引物通过RT-PCR扩增γ亚基cDNA。产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定并切除，并使用PCR引物和荧光双脱氧终止物直接对两条链进行测序。在第167密码子插入单个胞嘧啶（ACC CCC CTC→ ACC CCC CCT公司；图​图5，5、a和b）导致帧移动，并预测在插入下游107 bp处提前终止翻译（图​（图55c） ●●●●。

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突变型和野生型γ亚基cDNA的序列分析。从培养的成纤维细胞中分离RNA，逆转录，并用PCR扩增出300-bp的γ亚基cDNA，如方法所述。扩增的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行解析，切割，并使用PCR引物作为引物和荧光终止物直接测序。(一)野生型序列。(b条)突变序列。(c（c）)插入对γ-亚单位蛋白的影响。

通过SSCP分析MLIII与γ-亚基插入的连锁。

从基因组DNA中扩增出一个68-bp片段，包含此处已确定的插入物，用于SSCP分析。除了个体VIII:5（家族1）的SSCP谱正常外，这3个家族中的突变与疾病分离（图​（图6）。6). 对75名无关健康个体的SSCP研究未显示异常轮廓。这些结果表明γ亚基突变是这3个家族中MLIII的分子基础。

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通过SSCP分析，家系2和3中γ亚基突变与MLIII的连锁。如方法所述，扩增、变性、电泳并通过放射自显影术检测包含γ亚基突变的γ亚基基因的680-bp区域。每个受试患者的SSCP模式在系谱符号下方给出。(一)家族2；(b条)家族3。m、 突变等位基因；+，野生型等位基因。

SSCP在VIII:5和他的父母中是正常的。尽管该患者在所研究的位点上是纯合子，但他的单倍型与家族1其他成员分离的单倍型不同，可能来自个体IV:11。GlcNAc-磷酸转移酶检测表明该患者属于互补组A（数据未显示）。这表明MLIII互补组（A和C）在家族1中分离（见下文）。患者VIII:5γ亚基cDNA的序列分析没有显示胞嘧啶插入。这些数据表明该患者携带不同的突变，可能在α或β亚单位中。

突变GlcNAc-磷酸转移酶的酶学特性。

为了将γ亚基突变引起的疾病分类为经典型或变异型MLIII，进行了GlcNAc-磷酸转移酶分析。从患者VI：8（家系1）、II：3（家系3）、2个参考MLIII系（GM2425；MLIIIA和GM3391；MLIIIC）和对照组的培养皮肤成纤维细胞中制备可溶性膜组分。在MLIII（A）中，以α-甲基甘露糖苷或溶酶体酶作为受体，GlcNAc-磷酸转移酶活性同样降低。在MLIII（C）中，以α-甲基甘露糖苷为受体的GlcNAc-磷酸转移酶活性被保留，但以溶酶体酶为受体时其活性有缺陷。如图所示​图7，7MLIII（A）和MLIII（C）细胞的提取物同样缺乏GlcNAc-磷酸转移到溶酶体酶子宫铁蛋白的能力。然而，将GlcNAc-磷酸转移到简单受体α-甲基甘露糖苷的能力不同。GM2425缺乏（约2%活性），而GM3391表现出约140%的简单受体正常活性。当检查患者VI:8（系谱1）和II:3（系谱3）的膜组分时，观察到很少转移到子宫铁蛋白，但在α-甲基甘露糖苷测定中发现60-85%的正常活性。这些结果表明γ亚基突变导致变异或MLIII（C）型缺陷。

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突变GlcNAc-磷酸转移酶的酶学特性。正常人皮肤成纤维细胞（Wt）；经典型MLIII（GM2425）和变异型MLIII患者的皮肤成纤维细胞（GM3391）；对患者VI:8（家系1）、患者II:3（家系3）进行培养，并按照方法制备可溶性膜组分。使用溶酶体酶子宫铁蛋白和α-甲基甘露糖苷作为受体测定GlcNAc-磷酸转移酶，并计算为每小时每毫克细胞蛋白转移的pMol GlcNAc-1磷酸。数据以野生型细胞系中观察到的活性百分比表示。

讨论

MLIII（C）突变型GlcNAc磷酸转移酶独特特性的分子基础自最初的描述以来一直是谜一样的(17). GlcNAc磷酸转移酶是一种由2个不同基因编码的多亚基酶，这表明MLIII（C）缺陷可能是由于1个基因产物的缺乏。本研究表明，MLIII（C）是由γ亚基基因突变引起的，并首次描述了人类粘脂蛋白病的分子基础。

本研究中发现的突变导致GlcNAc-磷酸转移酶具有催化活性，但缺乏将溶酶体酶识别为受体的能力，这强烈表明γ亚基在底物识别中起作用。γ亚基功能的机制尚不清楚，该序列与之前描述的蛋白质没有同源性，也没有提供任何线索。这种突变如何改变GlcNAc-磷酸转移酶复合物的结构也不清楚，但考虑到突变酶与一些底物保持接近正常的活性，完整γ亚基的缺失不太可能干扰复合物的组装或稳定性。

MLII和MLIII的多个变异体之间的遗传关系很复杂，在缺乏相关基因信息的情况下很难理解(14–16,35). 本研究表明，MLIII（C）表型可能是由GlcNAc-磷酸转移酶γ亚基突变引起的。需要进一步的研究来证明MLIII（C）表型完全是由γ亚基基因突变引起的，尽管我们相信这是可能的。缺失完整γ亚基的突变型GlcNAc-磷酸转移酶仍表现出接近正常的催化活性，这强烈表明γ亚基对酶的催化功能没有贡献。由于MLII和MLIII（A）与所有底物的催化活性降低或缺失，因此很容易推测这些疾病是由酶的α和/或β亚基的改变引起的，并且α和/或者β亚基包含GlcNAc-磷酸转移酶的催化部分。该模型还预测MLII和MLIII（A）将由MLIII（C）在基因上补充，这一结果已在之前得到证明(14).

致谢

A.Raas-Rothschild是临时代办（法国）Chateaubriand奖学金和R.M.Goodman奖学金（美国）的接受者。这些研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH；HD31920授予W.M.Canfield和HG00313，NSF/EPSCoR授予B.Roe）以及W.K.Warren医学研究所和长老会健康基金会（均授予W.M.Canfiell）的资助；由Vaincre Les Maladies Lysosomales Association（致A.Raas-Rothschild）。我们感谢所有参与患者诊断的以色列医生，以及Y.Zlotogara、J.Kaplan和S.Lyonnet的帮助。我们感谢哥伦比亚密苏里大学的R.M.Roberts提供纯化的子宫铁蛋白。我们感谢K.Jackson和W.K.Warren医学研究所的分子生物学资源设施在蛋白质测序方面提供的帮助，以及M.Arcade在秘书方面的专业知识。

脚注

Annick Raas-Rothschild、Valerie Cormier-Daile和Ming Bao对这项工作做出了同样的贡献。

工具书类

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会