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公共科学图书馆一号。2008; 3（10）：e3376。
2008年10月13日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0003376
预防性维修识别码：PMC2557064型
PMID：18852878

利用RAD序列标记快速发现SNP并进行遗传定位

内森·贝尔德，#1 保罗·D·埃特，#1 特蕾莎·S·阿特伍德，2 马克·C·库里，三 安东尼·希弗，1 扎卡里·刘易斯，1 埃里克·塞尔克，1 威廉·克雷斯科，三和埃里克·A·约翰逊1，*
贾斯汀·费伊，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

单核苷酸多态性（SNP）的发现和基因分型对遗传作图至关重要。仍然需要一个简单、廉价的平台，以便在大量人群中发现高密度SNP并进行基因分型。在这里，我们描述了限制性位点相关DNA（RAD）标签的测序，该标签识别了13000多个SNP，并在两种模式生物中绘制了三个性状，使用的能力不到一次Illumina测序的一半。我们证明，通过选择限制性内切酶可以获得不同的标记密度。此外，我们开发了一个用于样本多路复用的条形码系统，并通过识别重组断点，精细绘制了三棘棘棘棘背侧板装甲损失的遗传基础F类2个人。条形码也有助于绘制第二个特征，即骨盆结构减少，通过生物信息学个人的重新分类。为了进一步证明RAD测序方法的简便性，我们鉴定了多态性标记，并绘制了一个在粗糙脉孢菌RAD标记的测序是SNP发现和基因分型的综合平台。这种方法应广泛适用于各种生物的遗传作图。

介绍

自然或诱导的基因组变异的遗传作图仍然是了解基因在各种生物过程中功能的有力方法。SNP是最丰富的遗传标记类型，其高密度使其成为研究基因组区域遗传的理想工具[1]–[3]然而，当前的基因分型平台通常需要大量投资来初步发现SNP[4]，[5]然后在大量个体中进行基因型分析[5]–[7].

遗传标记系统通常通过破坏限制性内切酶识别位点来识别SNP[8]–[10]。我们之前开发了一种新型标记，称为对限制区一有关联的D类NA（RAD），其是与特定限制性内切酶识别位点的每个实例相邻的DNA的短片段。RAD标签与DNA微阵列的杂交允许对数千个多态性标记进行平行筛选，以绘制不同生物体中的自然变异和诱导突变[11]–[13]尽管功能强大且广泛适用，但基于微阵列的RAD技术只能检测一小部分分离多态性。

在这里，我们描述了RAD基因分型平台通过使用下一代测序器而取得的重大进展，该测序器允许使用全面的多态性数据。RAD标记库的大规模并行和多重样本测序有助于快速发现数千个SNP和大规模人群的高通量基因分型。测序RAD标签具有几个对遗传作图有吸引力的特征。首先，RAD标签减少了基因组的代表性，允许对限制性位点旁边的核苷酸进行过度测序，并检测SNPs。第二，通过选择限制性内切酶可以为应用选择合适数量的标记，并且通过使用额外的酶可以几乎无限期地增加标记的数量。第三，该方法适用于混合群体的基因分型以进行批量分离分析，也适用于个体的多重基因分型，以进行精细绘图。在这里，我们通过对以前在三棘棘棘棘鱼中映射的性状进行批量分离和精细定位，以及对新的诱导突变进行批量分离定位，证明了这个高通量遗传作图平台的通用性和广泛适用性粗糙脉孢菌.

结果

用于测序的RAD标记生成

我们开发了新的RAD标签生成和分型方法，通过使用Illumina Genome Analyzer测序器和结合核苷酸条形码进行样本跟踪，大大简化和增强了遗传分析(图1). 用限制性内切酶消化基因组DNA，并将适配器（P1）连接到片段的悬垂端(图1A). 该适配器包含正向扩增和Illumina测序引物位点，以及用于样品鉴定的4或5 bp长的核苷酸条形码。为了减少由于测序错误而导致的错误样本分配，所有条形码至少相差两个核苷酸。随后将连接适配器的片段合并，随机剪切，并选择大小(图1B). 然后将DNA连接到第二个适配器（P2），即Y适配器[14]有不同目的的(图1C). 反向扩增引物无法与P2结合，除非在P1扩增引物的第一轮正向延伸过程中填充互补序列。该适配器的结构确保在最后的PCR扩增步骤中只扩增P1适配器连接的RAD标签(图1D).

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RAD标记生成。

（A） 用限制性内切酶消化基因组DNA，并将P1适配器连接到片段。P1适配器包含正向扩增引物位点、Illumina测序引物位点和条形码（彩色方框表示具有不同条形码的P1适配器）。（B） 将连接适配器的片段组合（如果是多路传输）、剪切，并将（C）连接到第二个适配器（P2，白色框）。P2适配器是一个发散的“Y”适配器，包含反向扩增引物位点的反向补体，防止缺少P1适配器的基因组片段扩增。（D） 带有P1适配器的RAD标签将有选择性地进行增强。

用序列RAD标记进行批量分离分析

三棘棘棘鲷多个淡水种群骨侧板丢失的主要部位(图2A，支架)之前已映射到链接组（LG）IV[15]，[16]并在一些人群中精确映射到教育部轨迹[17]我们之前使用RAD标记微阵列来重新映射这一特征，并发现LGIV上其他物理上不同的连锁区域。确认Illumina测序在RAD标签分析中的实用性，并确定是否在阿拉斯加人群中发现了这些额外的连锁区域，而不是我们最初研究中使用的区域[11]，我们分析了F类2具有低侧板表型的不同湖泊种群（Bear Paw，BP）和完整板块祖先海洋种群（Rabbit Slough，RS）之间的映射交叉。

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序列RAD标记映射。

（A） 本地咸水刺鱼种群Rabbit Slough（RS）有完整的侧板甲（括号），而衍生的淡水熊掌（BP）种群中没有这些结构。与海洋鱼类相比，淡水鱼类的骨盆结构也有所减少（箭头所示）。这两种表型在F类2映射交叉。使用南非法郎I（B）或EcoR公司I（C），我们从RS（红色）和BP（绿色）亲鱼沿着21个棘鱼连锁群绘制了多态RAD标记。（B）和（C）之间链接组的明显大小差异反映了以下事实：经济效益识别序列发生频率高于南非法郎I.联动组上方的红色和绿色条表示F类2子代，表示局部区域紧密连锁标记的数量。（D） 每个条形码的序列读取F类2用于创建（C）的个人。从我们分析中使用的96个个体中的每个个体中获得了不同的读取次数，反映了起始DNA模板的不同浓度。68%的个体测序的RAD标签介于50 K和150 K之间（基因组中的约150 K标签覆盖率为～0.4–1.0倍）。只有2个人的阅读次数少于10000次（红色）。（E） （C）中方框区域的特写显示了六个信息丰富的低板中的复合断点F类2LGIV上的鱼。黑色勾号在物理距离上相隔1Mb。（F）F类2个体被再次冷却生物信息学基于骨盆结构表型（A，箭头）。联系如（B，C）所示，将骨盆结构减少的位置映射到LGVII末端。

作为RAD标签测序性能的初步测试，我们从亲本RS和BP基因组DNA中创建了RAD标签库，用南非法郎一、 识别8-核苷酸序列（CCTGCAGG）。我们对由RS和BP父母条形码识别的140万个RAD标签进行了测序，并删除了那些缺少南非法郎I站点，产生608000个BP和760000个RS RAD标签。删除了序列中最容易出错的部分，并将包含其余26个核苷酸的标签明确地映射到参考基因组中的33074个位点，另8548个位点映射到一个不匹配的位点。

从这组41622个RAD标记中，通过选择在一个群体中至少有8个实例，而在另一个群体没有实例的RAD标记，可以确定BP和RS亲本之间的RAD标志多态性。多态性标记可以通过对切位点的破坏而发生，从而导致差异分离，或者通过两个个体中存在的标签序列读取中的SNP而发生。我们在1890个位点上鉴定了1136个RS-特异性和1097个BP-特异性RAD标记，利用RAD微阵列从我们最初的研究中重新描述了标记密度[11]在读取的序列中，60.8%的RAD标记中发现了SNP，39.2%的剪切位点被破坏。

RS-by-BP重组DNAF类2根据侧板表型对个体进行汇总。从每个池中分离RAD标签并测序。在RS和BP亲本之间鉴定的多态RAD标记位点上，对660000个低板池和590000个完整板池RAD标记进行匹配并制成表格。我们之前表明，侧板表型遗传是孟德尔遗传，完全板表型显性到低板表型[15]令人惊讶的是，我们还发现孟德尔遗传涉及LGIV的一个广泛区域，具有几个不同的连锁区域。因此，我们预计低板中的链接标记F类2池应该几乎完全来自BP亲本，而包含杂合子和RS-纯合子个体的高板池应该对来自RS亲本的标记表现出强烈的偏见。我们通过计数一个相邻标记仓中完全相关的标记来确定连锁。为了证实我们之前的RAD微阵列结果，我们在LGIV上发现了三个链接区域，其中一个位于教育部该位点位于13 Mb，另一个位于20 Mb，第三个位于25 Mb(图2B). 这些数据支持RAD标签测序在遗传作图中的实用性，证实了我们之前的结论，即横向板块变异涉及复杂的遗传学，并通过显示阿拉斯加多个湖泊种群中存在这种现象来证明这一发现的普遍性。

识别没有参考基因组的连锁标记

我们重新分析了上述RAD标签序列数据，没有利用任何可用的参考基因组信息。我们发现18个标签与侧板表型完全相关。当检查基因组位置时，所有18个基因都分布在LGIV上的三个簇中，证实了RAD标签的Illumina测序将为后续分析提供有用的标记，即使在没有参考基因组的生物体中也是如此。

使用条形码适配器进行精细映射

为了更紧密地绘制侧板缺失的遗传基础，我们改变了RAD标签库制备的两个方面。第一，经济效益一、 而不是南非法郎一、 用于创建RAD标记。更频繁的识别站点经济效益I（GAATTC）允许检测更多SNP，从而允许更高分辨率的映射。其次，我们追踪了F类2通过分别消化和连接到每个具有唯一条形码的P1适配器来进行种群F类2鱼。这使得所有样本都可以组合用于RAD库准备和测序的所有后续步骤。条形码的汇集和跟踪简化了RAD标签与许多样本的隔离，并减少了样本之间的准备差异。

来自150万BP和250万RS亲本RAD标签的序列被映射到148390个经济效益我切割侧翼序列，产生2311个BP特异性和4530个RS-特异性RAD标记。从低板和全板中总共获得了300万和370万次读取F类2每个多态性标记平均产生16或20个RAD标记。因此，每个F类2该个体只测序了RAD标记的一个子集。链接区域由标识生物信息学如前所述，测定了连锁标记的池化和装箱频率计数。与相同南非法郎我，EcoR公司I RAD标记在LGIV上识别出相同的三个位点，尽管每个区域都有更多的标记(图2C). 由于初始样本中的DNA浓度不同，从每个个体中获得了不同数量的序列读取(图2D).

接下来，对LGIV沿线的基因型进行了个体基础上的检测，以便识别在连接区域附近有断点的信息丰富的重组染色体(图2E). 位于教育部区域（12.8 Mb），我们发现低板个体的RS-特异性标记位于教育部为12.5Mb。位于的右侧教育部，我们发现RS-特异性标记位于教育部作为14 Mb，在LGIV上定义一个完整链接的区域，该区域的大小小于1.5 Mb，围绕先前映射的区域教育部轨迹，与从F类2这种大小的映射族。此外，通过跟踪低延迟人群中的个体，我们确定这两个额外区域具有强大但不完全的联系。

生物信息学群体内分离的附加性状的映射

除了有助于通过批量分离分析确定的精细标度映射区域外，使用个体特异性条形码还可以在没有额外实验工作的情况下映射在交叉中分离的额外表型。为了说明这种能力，我们重新组合了RAD标记，用于将侧板的减少映射为新的表型F类2基于骨盆结构变化的水池(图2A，箭头). 这个生物信息学水池F类2使用binned频率计数检测标记的连锁。我们能够将第二个特征映射到连锁组VII的远端(图2F)，确认以前的映射结果[15]，[18]。为了询问这种联系模式是否会偶然发生，我们使用了生物信息学重新筛选以确定链接的伪事实区域随机出现的频率。使用蒙特卡罗模拟方法填充骨盆结构池F类2个体，并分析了超过评分阈值的标记物数量。只有不到1.3%的模拟将标记评分为链接，只有一个模拟(P（P） = 0.0007）有三个标记映射到单个染色体。没有一个模拟有实际骨盆结构图中发现的七个相邻标记。因此，当对每个个体的基因型进行分析时，大规模群体的多重测序允许快速绘制多个性状。

绘制中的诱导突变N.克拉萨

序列RAD映射方法的另一个强大方面是SNP发现的简便性，这需要不到两天的库准备时间。与粘贴回定位平行，我们通过定位第二种生物真菌的诱导突变，证明了这项技术的简单性N.克拉萨从橡树岭N2977背景菌株中衍生出一株甲基化缺陷菌株AX7(图3A). 我们对来自菌株N2977和多态性莫里斯维尔菌株N32的150万个RAD标签进行了测序，该菌株在异交中用于创建重组定位群体。已测序的RAD标签映射到参考基因组中的21000多个基因座，产生2804个N2977特异性标记和1801个N32特异性标记。我们根据甲基化表型对后代进行汇总和测序，并使用binned频率计数分析，确定与contig 5的～122 Kb（位于先前组装的LGII的3 Mb附近）有显著联系[13])在两个池中以及野生型池中更大的链接区域中(图3B、C). 我们从RAD标记中设计了限制性片段长度多态性（RFLP）标记，分别位于1 Mb的contig 5（2.1 Mb的LGII）和0.1 Mb的contig 5（3.1 Mb的IGII）(图3C，箭头)并确认了两个池中的链接模式(图3D). 抑制野生型池中重组的原因尚不清楚。

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绘制一个新的诱导突变。

（A） 消化后的Southern印迹N.克拉萨甲基化敏感基因组DNA艾娃二、 与亲本突变的N2977菌株相比，AX7突变菌株的甲基化缺失。（B） 来自N32（红色）和N2977（绿色）亲本菌株的多态RAD标记沿着七个N.克拉萨连杆组。连锁群上方的红色和绿色条表示重组子代中的连锁，表示局部区域紧密连锁标记的数量。（C） 连锁群II的特写视图，显示了证实性RFLP标记的位置（箭头）。（D） RFLP标记确认。RFLP标记使用LGII上2.1 Mb和3.1 Mb的多态RAD标记设计，用于N.克拉萨2.1 Mb的标记证实了野生型库中缺乏重组体，而突变库中的一部分个体在此位置进行了重组。3.1Mb的RFLP分析显示，野生型和突变型池与甲基化缺陷表型完全相关。

讨论

我们将RAD标记分离与大规模并行高通量Illumina测序相结合，开发了一个基因分型平台，该平台可以快速、经济高效地发现新的SNP标记，并同时对许多个体进行基因分型。我们通过在两种不同的生物体中发现13000多个多态性标记，并在两个分离群体和96个个体中快速绘制三个性状，使用的容量不到Illumina基因组分析仪一次运行容量的一半，证明了该平台的可行性。使用微阵列的第一代RAD标记分析已被证明是绘制不同物种基因组变化的有效方法。然而，这项技术需要为每种生物制作特定物种的阵列，并为每一个期望的比较执行新的阵列杂交。我们的新RAD标记测序方法将RAD阵列方法的积极方面用于高通量Illumina测序，并允许研究人员在一次测序运行中执行相当于数百个RAD阵列实验的操作。这种新方法的主要优点是显著增加了检测标记的数量和类型，降低了成本，提高了分析速度。此外，虽然基于阵列的方法仅检测RAD标签存在的变异，但Illumina测序同时提供位于限制性内切酶识别位点以外的SNP的数据。使用Illumina测序平台对异质DNA样本进行测序的能力，以及我们的样本条形码，允许实验的多路复用，从而可以并行执行许多单独的绘图项目，减少启动和完成绘图项目所需的成本和工作量。

在映射杂交中发现SNP需要每个标记对每个父代进行大量的序列读取。然而，F类2具有参考基因组的生物体中的个体可以轻轻测序，以对基因组区域进行基因型推断，因为遗传物质是在由重组断点定义的大块中遗传的。我们通过从侧面的RAD标记序列推断LGIV上未测序标记的基因型来证明这一点，以建立连锁块并在附近精细定位侧板断点教育部一种有用的两步方法是首先对高密度标记进行欠采样，以识别具有信息重组断点的个体，然后获取这些个体的额外序列。这种在未测序的大种群中推断基因型的能力可以有效地在基因组测序的生物体中定位数量性状位点（QTL）。当每个个体的基因组区域的亲本来源为F类2可以确定映射族。

如果没有测序的基因组，上述从邻近RAD标记推断基因型的策略将不起作用。然而，我们已经证明，批量分离分析可以成功地识别完全连锁的标记。在没有参考基因组的生物体中，存在几种从RAD标记转移到基因组位置的途径。RAD标记的分离可以在作图杂交中进行分析，以生成遗传连锁图。此外，配对RAD标签序列可用于生产探针或PCR引物，以筛选磷酰胺或BAC文库，以识别与表型相关的基因组区域。

RAD标记物方法具有灵活性，可以根据限制性内切酶的选择来测定不同数量的标记物，正如我们通过对来源于具有6或8核苷酸识别序列的限制性内切酶的标记物进行测序所表明的那样。将限制位点的GC含量与基因组相匹配也可用于影响标记数。经济效益I（25%GC）在棘鱼基因组中的位点比预期的要少，而南非法郎我（75%GC）的站点数量超出了预期。

随着测序技术成本的降低和能力的提高，对每一个感兴趣的个体进行完整测序以确定整个基因组序列可能是一个可行的选择。然而，来自相邻SNP的信息往往是高度冗余的，以如此高的密度收集的额外信息将是浪费的。通过将测序工作集中在多路复用样本中限制位点两侧的标签上，我们的新方法显著降低了数据复杂性并提高了吞吐量。这允许高效、高密度的SNP发现和定位杂交的基因分型。因此，即使测序技术不断改进，RAD标记测序仍将是大多数遗传图谱研究的有用且具有成本效益的工具。

方法

用于Illumina测序的RAD标记的分离

基因组DNA（0.1–1µg；来自单个或混合样品）在37°C下以50µL的反应在20个单位（U）的经济效益我或南非法郎I（新英格兰生物实验室[NEB]）。样品在65°C下热失活20分钟。2.5µL 100 nM P1适配器，改良Solexa©适配器（2006 Illumina，Inc.，保留所有权利经济效益我消化，顶部：5′-AATGATACGGCGACCGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACCTCTCTCTCCCGATCTxxxxx-3′[x = 条形码]，底部：5′-Phos-AATTxxxxxAGATCGAGAGAGAGCGTGTAGGGAAGTGTATCGGGTCGCGGTCATT-3′，用于南非法郎我消化，顶部：5′-AATGATACCGGCGACCGAGATCTACCTCTTCCCTACGACCTCTCTCCCGATCTxxxxTGCA-3′，底部：5′-Phos-xxxxAGATCGGAAGAGAGAGCGTGTGTAGGAAGTGTATCGGTCGCGGTCATT-3′)与1µL 100 mM rATP（Promega）、1µL10×经济效益I缓冲液，0.5µL（1000 U）T4 DNA连接酶（高浓度，NEB），5µL H2O，并在室温（RT）下孵育20分钟。再次将样品在65°C下热灭活20分钟，合并，并随机剪切（Bioruptor或Branson sonicator 450）至平均大小为500bp。然后将样品放在1%琼脂糖（Sigma）、0.5×TBE凝胶上，并使用MinElute凝胶提取试剂盒（Qiagen）分离300 bp至700 bp的DNA。使用快速Blunting Kit（NEB）抛光DNA末端。然后使用快速旋转柱（Qiagen）和15 U Klenow exo纯化样品−（NEB）用于在37°C时在DNA的3′端添加腺嘌呤（发酵剂）悬液。经过另一次纯化，1µL 10µM P2适配器，一种经改良的发散型Solexa©适配器（2006 Illumina，Inc.，版权所有；顶部：5′-Phos-CTCAGGCATCACTCGATTCCTCGAGAACAA-3′，底部：5′-CAAGCAGACGGCATACGGAGAGAGATCGAGTGATGCCTGAGT-3′)在RT下与DNA片段连接。再次纯化样品并在50µL中洗脱。5µL本品用于PCR扩增，50µL Phusion Master Mix（NEB），5µL10µM改良Solexa©扩增引物混合物（2006 Illumina，Inc.，版权所有；P1前引物：5′-AATGATACCGGCGACCGA-3′; P2-反向引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3′)和40µL H2O.Phusion PCR设置遵循产品指南（NEB），共进行了18个循环。样品经凝胶纯化，切割300-700 bp的DNA，并稀释至10 nM。按照Illumina Solexa方案进行测序。序列可在Short Read Archive中获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra网站/)，加入时SRA001825.1。

序列分析

原始序列读取由自定义Perl脚本（E.A.J.）处理，以优化读取数量并减少数据中的伪影。首先，将序列修剪为条形码加上26个核苷酸，以避免在读取结束时出现更高的错误率，同时包含足够的信息以将大多数读取明确映射到参考基因组。带有模糊“N”核苷酸的序列被删除。相同序列的读取按条形码分组并计数。亲本菌株中的多态RAD标签通过一个菌株中至少有8个读数而另一个菌株没有读数来鉴定。多态性标记被映射到参考基因组，首先确定与参考基因组中潜在RAD标记位点的完美匹配，然后搜索单个错配。对多态性标记进行个体遗传评估F类2后代并被分类为母系或父系。通过对相邻标记进行装箱并计数装箱内的连锁标记来确定连锁区域。对于涉及脊背肌的研究经济效益I RAD标记，10个相邻标记被装箱，并计算链接标记的数量（即在低晚群体中缺乏RS-特异性RAD标记的标记数量，或在高晚群体中少于三个BP-特异性的RAD标记）。对于个体追踪，低板个体中RS-特异RAD标记的存在被认为足以推断该区域是从RS父代遗传来的。由于单个染色体通常具有单一交叉事件，因此RS-亲本染色体块和BP-亲缘染色体之间的断点可以通过包含多个RS-特异标记的区域的末端来定义。在大批量回粘研究中，低板池中每10个标记的每一个箱子中都计算了来自RS亲本的少于3个标记的链接标记，而来自BP亲本的不到3个标记则在全板池中进行了计算。在N.克拉萨池，计数突变体池中的野生型特异性标记和野生型池中的突变体特异性标记。

杂交和DNA分离

所用的棘背鱼来自于最初从阿拉斯加马塔努斯卡-苏西特纳区采集的野生样本中提取的鱼线。将一个缺乏侧板和骨盆结构的淡水个体（熊爪湖）与一个拥有每种表型完整形式的海洋个体（兔子沼泽）杂交。两人的全同胞杂交F类1个人制作了F类2用于映射分析的个体。如前所述进行杂交、饲养和表型分析[15]使用DNeasy组织试剂盒（Qiagen）从胸鳍夹中分离基因组DNA。96年的DNAF类2个体被独特的条形码，这使我们能够追踪RAD标记，并将其与不同的侧板或骨盆结构表型联系起来。F类2绘图分析中使用的个体包括60条具有完整侧板表型的鱼类，31条低侧板个体，67条具有高骨盆结构表型的个体，29条具有低骨盆评分的个体。

要隔离N.克拉萨DNA甲基化缺陷的突变体，我们诱变了N2977菌株(酒吧米;每小时米;Δ英寸上午132)含有甲基化的巴斯塔和潮霉素抗性基因的沉默拷贝(酒吧米和湿度米）。诱变后，我们选择了在两种药物存在下生长的突变菌株。随后的Southern分析显示，所选菌株在DNA甲基化模式中显示出全局缺陷。将原始突变菌株回交到菌株N3311(A sad-1型;酒吧米;马力米;Δ英寸上午132)分离同核体并确认突变表型是由单个基因突变引起的。为了产生重组子代，将AX7突变体与多态性Mauriceville野生型菌株（N32）杂交，分离出28个突变子代和24个野生型子代。为了进行基因分型，RAD标签是从背景亲本菌株N32和N2977的基因组DNA以及N32和AX7杂交的突变和野生型子代库中制备的。使用的RFLP引物如下：RFLP2.1，正向：5′-GCCTTTGCTCTACTCGCATCG-3′，反向：5′-TCCGCAGTCTTTGGGTTACGACC-3′; RFLP3.1，转发：5′-TTGATGGAGTCTTCTTCGCCG-3′，反向：5′-GCTTTCTCGTCATTTGGTC-3′.经济效益我被用来消化RFLP标记。

脚注

竞争利益：EAJ已经申请了RAD标记的专利，并在一家将该系统商业化的公司中拥有部分权益。TSA是该公司的受薪员工。

基金：所描述的项目得到了美国国家人类基因组研究所（E.A.J.）的资助R21HG003834，美国国家普通医学科学研究所的资助R24GM79486（E.A.J和W.A.C.）和GM025690（E.U.S.），以及美国国家科学基金会（W.A.C）的资助IOS-0642264。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃