严重急性呼吸综合征冠状病毒开放阅读框（ORF）3b、ORF 6和核衣壳蛋白作为干扰素拮抗剂的功能^▿

转染。

将293T细胞接种在24孔或6孔培养皿中24小时。除非另有说明，否则分别使用0.2或1μl Lipofectamine 2000将细胞转染为每个质粒100 ng或500 ng。

NDV-GFP检测。

将A549细胞接种在24孔培养皿中，并用3μl Lipofectamine 2000和1μg图中所示的质粒转染。​图1A：。1安培如前所述，刺激干扰素诱导需要更多的脂蛋白2000和DNA(16). 细胞在转染后24小时感染表达绿色荧光蛋白的新城疫病毒（NDV-GFP），感染倍数（MOI）为10，并在感染后24小时进行显微镜分析。

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图1。

SARS-CoV ORF3b、ORF6和N蛋白作为潜在干扰素拮抗剂的鉴定。A.用对照质粒或表达HA标记SARS-CoV蛋白的质粒转染A549细胞。在转染后24小时，细胞被NDV-GFP感染，该病毒在干扰素拮抗剂存在下生长。使用10倍物镜在感染后24小时获得图像，这些图像代表了三个实验。用表达HA标记的SARS-CoV蛋白的质粒转染A549细胞24小时，固定，并使用HA标记抗体分析SARS-CoV蛋白的表达。

细胞凋亡分析。

将293T细胞接种在24孔培养皿中，并转染各种GFP标记质粒。在转染后24小时，使用相控法和荧光显微镜分析细胞与凋亡相关的形态学变化。如前所述，收集细胞并分析活性caspase-3(13).

共焦显微镜。

293T细胞接种在盖玻片上的24孔培养皿中。转染后24小时，细胞用5%甲醛固定，并用1%Triton X-100渗透。将细胞与封闭缓冲液（磷酸盐缓冲液[PBS]、0.05%吐温、0.5%牛血清白蛋白、0.8%甘氨酸）孵育5分钟，然后在室温下以1:500的稀释度与一抗孵育1小时。使用的主要抗体是小鼠抗细胞色素c（c）（Pharmingen）、兔抗蛋白二硫键异构酶（PDI）（多梅尼科·托托雷拉（Domenico Tortorella）馈赠）、兔抗磷-STAT1（细胞信号技术）、小鼠抗HA标签（Sigma）和小鼠抗仙台病毒抗体11F3和5F5（1μg/ml）(15). 用封闭缓冲液清洗细胞三次，然后用与Alexa fluor 488、驴抗兔Alexa fluor 594、驴抗鼠Alexa fruor 596或BODIPY TR（均来自分子探针）偶联的驴抗鼠免疫球蛋白孵育1小时，6-二氨基-2-苯基吲哚-二盐酸盐（DAPI）（分子探针）或Hoechst 33342（分子探测器）5分钟。将细胞清洗三次，并使用Aqua Polymount（Polysciences）将盖玻片安装在载玻片上。使用蔡司LSM 510 Meta显微镜通过共焦显微镜分析载玻片。

荧光素酶分析。

将293T细胞接种在24孔培养皿中，并转染空载体质粒，质粒编码SARS-CoV蛋白，雷尼利亚荧光素酶质粒和pNF-κB萤火虫荧光素素酶质粒或p55-CIB萤火虫萤光素酶质粒。对于这些转染，使用0.5μl Fugene代替Lipofectamine 2000，因为该量的Fugene不会诱导可检测量的干扰素。NF-κB应答启动子质粒包含两个NF-κ子B结合位点，p55-CIB质粒包含三个IRF-3结合位点。在转染后24小时，细胞以10的MOI感染仙台病毒24小时。收集细胞，进行裂解，并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶符合制造商的协议（Promega）。使用雷尼利亚荧光素酶值，并表示为阳性对照值的百分比。

定量显微镜分析。

将293T细胞接种在24孔培养皿中，并转染适当的质粒以及IFN-RFP或ISRE-RFP质粒。在转染后24小时，细胞被仙台病毒感染或用3000 U/ml人干扰素-β（钙生物化学）处理。在感染后或处理后24小时使用Olympus 1X70显微镜通过显微镜分析细胞。使用ImageJ软件（NIH）对来自三个实验的图像进行定量。

ORF3b、ORF6和N蛋白抑制IFN-β的合成。

研究了这三种蛋白抑制干扰素反应的机制。病毒蛋白抑制干扰素反应的一种机制是通过阻止干扰素启动子的表达。研究表明，感染SARS-CoV的细胞不产生干扰素(22). 为了确定拮抗剂是否抑制干扰素的诱导，在IFN-β启动子的控制下，用表达RFP的质粒转染293T细胞。这些细胞与表达SARS-CoV蛋白的质粒共转染，以空载体质粒作为阴性对照，或与表达流感病毒NS1蛋白的质粒作为阳性对照。转染后24小时，细胞感染仙台病毒以诱导干扰素合成，感染后24小时通过显微镜分析细胞的红色荧光（显示为白色）。干扰素诱导拮抗剂阻止RFP的表达。

荧光图像如图所示。​图3A，3A级，三个实验中RFP表达的定量如图所示。​图3B。3B公司阳性对照流感病毒NS1蛋白显著降低IFN-β启动子RFP的表达。SARS-CoV ORF3b、ORF6和N蛋白均降低RFP的表达（图。3A和B). 这表明这三种拮抗剂抑制干扰素的诱导。N基因实际上编码两种蛋白质，N蛋白和ORF 9b蛋白。构建了一个N基因，该基因在ORF 9b蛋白的起始位点含有突变，但没有改变N蛋白的氨基酸。该质粒表达N蛋白，但不表达ORF 9b，能够像含有未改变的N基因的质粒一样有效地抑制IFN-β启动子RFP的表达。该结果与图。​图11显示ORF 9b不能拯救NDV-GFP的生长表明N蛋白而不是ORF 9b是干扰素拮抗剂。仙台病毒蛋白在严重急性呼吸系统综合征冠状病毒蛋白存在下的表达如图所示。​图3C。3C公司SARS-CoV蛋白均未抑制仙台病毒蛋白的表达。

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图3。

SARS-CoV ORF 3b、ORF 6和N蛋白抑制干扰素的产生。在IFN-β启动子和空载体质粒、表达流感病毒NS1的质粒或表达SARS-CoV蛋白的质粒的控制下，将表达红色荧光蛋白的质粒与A.293T细胞共转染。转染后24小时，细胞感染仙台病毒以刺激干扰素的产生。使用10倍物镜在感染后24小时拍摄图像。B.使用Image J软件对针对面板A描述的三个实验的图像进行量化。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。C.用所示质粒转染细胞24小时，然后感染仙台病毒24小时。细胞固定、渗透，并使用仙台病毒单克隆抗体分析仙台病毒蛋白。

ORF3b、ORF6和N蛋白抑制IRF-3的功能，N蛋白抑制NF-κB的功能。

病毒有几种抑制干扰素诱导的方法。转录因子IRF-3在激活时与干扰素启动子结合，已被证明是诱导干扰素的必要条件。已证明IRF-3在SARS-CoV感染的细胞中受到抑制(22). 在具有三个IRF-3结合位点（55-CIB）的启动子控制下，使用含有萤火虫荧光素酶基因的质粒构建物检测IRF-3激活其DNA结合位点的能力。细胞与对照质粒或表达SARS-CoV蛋白的质粒、p55-CIB荧光荧光素酶质粒以及组成性表达雷尼利亚荧光素酶。这个雷尼利亚荧光素酶质粒用于标准化样品的表达水平。转染后24小时，细胞感染仙台病毒以刺激干扰素合成。在感染后24小时收集细胞并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶。仙台病毒感染激活了空载体转染细胞中的55-CIB启动子（图。​（图4A）。4A级). 阳性对照，流感病毒NS1蛋白，抑制55-CIB启动子的表达。所有三种SARS-CoV蛋白ORF3b、ORF6和N也抑制55-CIB启动子的表达，表明它们阻止需要IRF-3结合的启动子的激活，如干扰素。

为了使IRF-3与启动子结合，必须通过磷酸化激活IRF-3。通过使用抗磷酸化IRF-3抗体的Western blotting，分析转染表达IRF-3质粒和表达SARS-CoV蛋白的对照质粒或质粒的细胞中IRF-3的磷酸化。转染后24小时，细胞感染仙台病毒6小时，以刺激IRF-3磷酸化。ORF3b、ORF6和N蛋白均有效抑制IRF-3的磷酸化（图。​（图4B）。4B类). Western blot定量显示，磷酸化被SARS-CoV蛋白抑制，但IRF-3没有降解。

活性IRF-3从细胞质转移到细胞核，以发挥转录因子的作用。在用对照质粒或表达SARS-CoV蛋白和IRF-3-GFP的质粒转染的细胞中分析IRF-3的易位。在转染后24小时，用仙台病毒感染细胞8小时以刺激IRF-3易位（图。​（图4C）。4摄氏度). IRF-3存在于模拟感染细胞的细胞质中，而存在于仙台病毒感染细胞的细胞核中。所有三种SARS-CoV蛋白都抑制IRF-3易位。因此，图中的数据。​图44表明SARS-CoV蛋白抑制IRF-3功能。

干扰素合成所必需的另一种细胞成分是NF-κB。NF-κB和IRF-3一样，是病毒感染后激活的转录因子，与干扰素启动子结合并激活干扰素。使用萤火虫荧光素酶构建物，在含有两个核因子-κB结合位点的核因子-кB反应启动子的控制下，检测核因子-kb B的激活。细胞与对照质粒或表达SARS-CoV蛋白的质粒、pNF-κB-萤火虫荧光素酶质粒以及雷尼利亚质粒。在转染后24小时，细胞感染仙台病毒，在感染后24小时收集细胞并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶。正如预期的那样，仙台感染激活了空载体转染细胞中包含NF-κB结合位点的启动子，流感病毒NS1蛋白抑制了该启动子的表达（图。​（图5）。5). SARS-CoV N蛋白有效地抑制启动子的激活，而ORF 6蛋白能够降低NF-κB应答启动子的表达，其程度低于N蛋白(P（P）<0.05）。ORF3b蛋白对NF-κB应答启动子的影响不大。

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图5：。

N蛋白抑制NF-κB活化。293T细胞与表达萤火虫荧光素酶的质粒共转染，该质粒受包含两个NF-κB结合位点的NFκB应答启动子控制雷尼利亚荧光素酶质粒和指示质粒。转染后24小时，细胞感染仙台病毒。感染后24小时，收集细胞并分析萤火虫和雷尼利亚荧光素酶活性。将单元格归一化为雷尼利亚萤光素酶控制。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。100%的值代表大约8000000个萤火虫荧光素酶单位和600000个雷尼利亚荧光素酶单位。这个P（P）N和ORF6蛋白的值小于0.05。

ORF3b和ORF6蛋白抑制ISRE启动子的表达。

虽然我们的数据表明SARS-CoV ORF 3b、ORF 6和N蛋白抑制干扰素的合成，但我们也测试了这些蛋白是否可以抑制细胞对干扰素（干扰素信号）的反应。一旦干扰素从细胞中释放出来，它就会与干扰素受体结合，并通过JAK/STAT途径进行信号传递，从而激活启动子中包含ISRE的基因。为了确定ORF 3b、ORF 6和N蛋白是否抑制含有ISRE的基因的表达，在ISRE启动子（干扰素刺激基因54启动子）的控制下，用SARS-CoV蛋白和含有GFP的质粒共同转染细胞。在转染后24小时，用仙台病毒感染细胞或用IFN-β处理细胞。仙台病毒感染后ISRE启动子的表达需要干扰素合成和干扰素信号传导，而干扰素治疗后ISRE启动子的表达只需要干扰素信号传导。典型图像如图所示。6A和C，三个实验的定量如图所示。6B和D感染仙台病毒后，ORF3b、ORF6和N蛋白均有效抑制ISRE启动子的表达（图。6A和B)，表明这些蛋白抑制干扰素反应。用IFN-β、ORF3b和ORF6蛋白治疗后，抑制了ISRE启动子的表达，但N蛋白没有（图。6C和D). 结合图中的数据。​图3，三这些数据表明，N蛋白仅抑制干扰素合成，而ORF3b和ORF6蛋白同时抑制干扰物合成和干扰素信号。

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图6。

SARS-CoV蛋白对含有ISRE的启动子的抑制。将293T细胞与ISRE-GFP和所示质粒共转染24 h。然后用仙台病毒（A和B）感染细胞或用干扰素-β（C和D）处理细胞24 h，然后用10倍显微镜进行分析。使用ImageJ软件（B和D）对图像进行量化。数据是三个实验的平均值加上标准偏差。

我们感谢Domenico Tortorella提供PDI抗体，感谢Takashi Fujita提供p55-CIB质粒。我们感谢Claire Coupillaud对p55-CIB实验的帮助。

这项工作得到了NIH的部分资助（PO1 AI059443-01A1）。共聚焦激光扫描显微镜在MSSM-Micropy共享资源设施进行，由NIH-NCI共享资源拨款5R24 CA095823-04、NSF主要研究仪器拨款DBI-9724504和NIH共享仪器拨款1 S10 RR0 9145-01资助。P.P.是埃里森医学基金会的高级学者。S.A.K.-B部分得到了NIH培训拨款T32 A1007645的支持。M.B.F.得到了NIH研究金F32 AI66542的支持。