Choroid plexus epithelial monolayers – a cell culture model from porcine brain

Carsten Baehr; Valeska Reichel; Gert Fricker

doi:10.1186/1743-8454-3-13

脑脊液研究。2006年；3: 13.

2006年12月21日在线发布。数字对象标识：10.1186/1743-8454-3-13

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PMID：17184532

猪脑脉络丛上皮单层细胞培养模型

卡斯滕·贝尔,¹ Valeska Reichel公司,¹和格特·弗里克¹

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摘要

背景

本研究的目的是开发一种在体外脉络丛上皮细胞培养模型用于研究蛋白质介导的药物分泌物从血液到脑脊液的转运反之亦然.

方法

通过机械和酶处理新鲜分离的猪神经丛组织来分离细胞。培养上皮细胞单层，测定CSF分泌和跨上皮阻力。评估f-actin和脉络丛标记蛋白穿甲素（TTR）的表达。采用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光技术研究出口蛋白p-糖蛋白（Pgp，Abcb1）和多药耐药蛋白1（Mrp1，Abcc1）的表达，并通过转运和摄取实验评估其功能活性。

结果

高纯度分离脉络丛上皮细胞并生长形成融合单层。滤过生长的单层膜显示了100至150Ωcm范围内的跨内皮电阻（TEER）值²形态学上，细胞表现出典型的f-actin网状结构，并高表达TTR。培养细胞能够以48.2±4.6μl/cm的速率分泌CSF²/超过2–3小时。ABC输出蛋白Mrp1在细胞单层和完整组织的基底外侧（面向血液）膜中表达。P-糖蛋白仅在心尖部（脑脊液导向）膜内低表达，但更多位于心尖下细胞室。这一发现与缺乏p-糖蛋白底物、维拉帕米和罗丹明123的直接排泄相平行。

结论

研究表明，CP上皮可以被分离和培养，细胞生长成完整的单层，完全分化，性质类似于组织体内因此，所建立的初级猪CP模型可用于研究复杂的转运过程，可作为分析跨血细胞脊髓液屏障（BCSFB）外源性转运的可靠工具。

背景

大脑是非常对周围环境的变化和体内平衡敏感是维持正常功能的关键。与血管系统，为了稳定性和保护，大多数水溶性化合物被排除在外。此外，内源性代谢物和外源性物质也被积极地从中枢神经系统中清除。从解剖学上讲，有三种结构将大脑和血流分隔开来：脑毛细血管网络或血脑屏障（BBB）、脉络丛（CP）或血CSF屏障（BCSFB）和蛛网膜。BBB和BCSFB都积极调节进出脑细胞外液、脑脊液和细胞内液的分子类型和浓度。

CP在上皮超微结构上与肾近端小管相似，与肾脏一样，在其上皮中运输近等渗液体[1]. CP与稳定血液化学成分的肾脏类似，负责CSF的稳定。然而，脑脊液不是作为过滤器，而是在脑脊液中积极产生，并富含血液中的营养物质。液体和分子从血液向脑脊液进行大量运动，穿过内陷的基底外侧膜和顶膜处紧密堆积的绒毛。然而，运动也可能发生在相反的方向，顶部绒毛通过分泌化合物和代谢物进入血管系统，最终被肝脏或肾脏清除，起到过滤器的作用。

脑脊液分泌是脑脊液最重要的功能之一[2]. 人类的脑脊液总体积每4至5小时更新一次，其中90%的脑脊素由脑脊液组织产生[三]. CP具有一系列代谢酶和偶联代谢产物的跨上皮矢量流出到血液中，是大脑中一个有效的解毒系统[4]. 事实上，CP是大脑中外源性代谢的主要部位之一[5].

许多化合物通过CP上皮进行转运，迄今为止，共有11个转运蛋白家族在CP中发现了近30个单独的转运蛋白，其中13个在中到高水平表达[6]. 然而，许多在低水平表达，只有八个定位于特定的膜。转运蛋白是溶质载体家族（SLC）和活性和能量消耗型ATP-结合盒（ABC）转运蛋白家族的成员。

几个体内和在体外技术和模型已被用于研究跨CP的运输[7].体内技术需要精心的实验程序和手术技巧。常用的方法包括CSF的连续采样、给药后的数据反褶积，以确定转运曲线。隔离组织用于体外灌注研究或就地CP室隔离。体外方法包括从不同物种分离的脉络丛上皮细胞（CPEC）的原代培养，或永生化上皮细胞的培养。原代和细胞系CPEC培养物均形成不渗透的单层，并显示出CPEC的特征体内.

已经制定了不同的方法来建立CPEC在体外模型。克鲁克等1981年，第一个发表了使用牛脑CP细胞分离和培养上皮细胞的协议[8]. 此后使用的其他物种包括兔子[9,10]，老鼠[11-13]和猪[14]. 通常，CP组织从侧脑室中取出并进行机械分离。使用蛋白水解酶，如胰蛋白酶、蛋白酶原、胶原酶和脱氧核糖核酸酶消化单个CP，产生上皮细胞的分离物。

这里，我们给出了在体外细胞培养模型，来源于猪CP上皮细胞。除了研究标记蛋白表达、脑脊液分泌和酶功能等特征外，还特别关注ABC转运蛋白p-糖蛋白（Pgp）和多功能耐药蛋白1（Mrp1）。

方法

组织

新鲜分离的猪脑取自当地屠宰场（Fleischversorgungszentrum Mannheim，FRG）。

猪CP上皮细胞的分离与培养

如前所述，用修饰物制备猪CP上皮细胞[14]：将新鲜分离的CP组织与0.25%（w/v）胰蛋白酶溶液（Biochrom，Berlin，FRG）在4°C下培养2.5小时，然后在37°C下再培养0.5小时。通过添加新生小牛血清（Biochrom，Berlin FRG）终止蛋白水解活性。去除剩余组织，以1000×g离心细胞悬液10 min。将细胞颗粒重新悬浮在补充有10%（v/v）胎牛血清（FCS）、4 mM L-谷氨酰胺、5μg/ml胰岛素、200 ng/ml氢化可的松、5 ng/ml亚硒酸钠、20μM阿糖胞苷的DMEM/HAM的F12（1:1）（Bioconcept、Freiburg、FRG）中，100 g/ml青霉素/链霉素和10 ng/ml表皮生长因子。细胞接种在层粘连蛋白涂层（50μg/ml水中）Transwell上^®滤膜（Costar，Cambridge MA，USA）或烧瓶。调整播种密度，使1克组织覆盖50厘米的面积².电镀后24小时，用PBS（1 mM Ca）清洗培养物²⁺，0.5 mM镁²⁺)去除红细胞。培养基每周更换三次。FCS在培养9天后被移除（DIC）。

总RNA提取

新鲜组织样本储存在冰冷的RNA中^®（Sigma、Steinheim、FRG）在RNAlate允许的时间范围内运输^®（最长1小时），到达后在-70°C下冷冻。在开始RNA分离程序之前，将培养的CPEC在37°C、pH 7.4的KRB中清洗三次，以去除所有剩余培养基。根据Qiagen RNeasy从新鲜和培养的CPEC中分离出总RNA^®（Qiagen、Mannheim、FRG）协议。根据Qiagen组织和细胞裂解协议，在含有RLT缓冲液的β-巯基乙醇中裂解烧瓶中培养的组织或细胞。添加等体积的70%EtOH，并将样品转移到提供的旋转柱中。按照Qiagen洗涤和旋转方案，总RNA在少量无核酸酶水中洗脱。用光度法定量分离RNA的数量，在260nm处测量OD，OD为1，对应于40μg单链RNA[15]. 通过采用260nm与280nm的OD比进一步确定纯度。仅使用比率为1.7至2.0的样品，因为低比率是蛋白质的特征，而高比率是残留的β-巯基乙醇污染。

猪脑毛细血管内皮细胞的分离培养

分离和培养脑毛细血管内皮细胞，并按照我们之前的出版物进行渗透性实验[16].

反向转录

根据Promega逆转录系统进行逆转录（RT）^®（Promega、Mannheim、FRG）。将1μg总RNA在70°C下孵育10分钟，然后添加反应混合物（在20μl:4μl 25 mM MgCl中₂，4μl 5X转录缓冲液，2μl 10 mM dNTP混合物，0.5μl RNAsin^®将含有5个单位的禽成髓细胞增多症病毒逆转录酶（AMV-RT）的核糖核酸酶抑制剂，0.5μg低聚（dT）15引物和无核酸酶的水）在42°C下进一步孵育60分钟。所得cDNA直接用于进一步反应或在-20°C下冷冻。

聚合酶链反应（PCR）

PCR反应用于扩增生成的cDNA的选择性区域。对于每个PCR反应，使用1μg总RNA产生的10~100%的cDNA。所有反应均采用热启动方案进行[17]以便最大限度地提高灵敏度和特异性。样品总共运行15至50个循环。最后，在1.5%溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中分离PCR产物，并在紫外线下观察。表中列出了使用的所有底漆表11.

表1

引物核苷酸序列。

目标*	加入号码	正向底漆反向底漆	产品（bp）
转甲状腺素（TTR，前白蛋白）	X87846型	TGGTCAAAGTTCCTGGATGCT公司 TTACATGCAAGCCTGTCCCT公司	371
β-肌动蛋白	U07786号机组	TTTGAGACCTTCAACAGCC公司 TGATCCACATCTGCTGGAAG公司	703
Mrp1型	L05628号	TTCGTTCTCAGGCACATCAATG公司 AACACAAGGATCTCGTCTCTCC	436
Pgp公司	AF016535型	GAGAGGGCCCAGTTGAGTG公司 CACAAGCCAAGACAGAAGC公司	468

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*如果可能的话，从猪序列中提取，如果不是人类序列（Mrp1，Pgp），则使用。

半定量RT-PCR

β-肌动蛋白表达作为内标。分离并转录总RNA，并如上所述扩增选择性区域。使用Scion Image软件（美国国家卫生研究院）获得溴化乙锭染色PCR产物的密度读数，并根据β-肌动蛋白进行归一化。为了确定线性放大的相位，以五个周期间隔进行了一系列放大。扩增了一系列浓度，以确保结果不受任何特定样本中mRNA和cDNA初始量的影响。

蛋白质测定

根据Bradford测定总蛋白浓度[18].

酶活性

根据Sigma（Munich，FRG）协议和Caspers和Diglio测量碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶活性[19]. 这两种酶都被用作CP上皮细胞顶端质膜的标记酶。

免疫细胞学染色

在室温下将CPEC在95%乙醇中固定15分钟。用0.1%Triton X-100渗透细胞15分钟。然后将样品在封闭缓冲液（1%BSA和1%奶粉）中封闭1小时，然后在室温下以1:10的稀释度在封闭缓冲溶液中与目标抗体孵育过夜。清洗后，将样品与FITC-标记的二级IgG（Dako，Glostrup，DK）在1:100的封闭缓冲液中孵育2 h，并添加10μM碘化丙啶（PI）。对于对照组，省略了一级抗体。F-肌动蛋白染色培养的CPEC分别与10μM卵磷脂-FITC和10μM PI孵育，或仅与PI孵养，用于治疗和对照。样品嵌入Aqua Polymount^®（Polysciences Inc.，Warrington，PA，USA），使用40×油浸物镜（NA 1.2）、488-nm氩离子激光激发和500-nm长通发射滤光片，通过倒置徕卡DM-IRB共焦显微镜观察。

顶端和基底外侧膜组分的分离

CPEC膜组分分离方法改编自肾膜方案[20]. 在均质溶液中（HS，mM：300甘露醇、0.1苯甲基磺酰基氟化物、1 EDTA和18 Tris HCl，pH 7.5），使用每50 ml HS 6 g CP组织对新分离的侧方CP进行均质。匀浆以3000 g离心_{（最大值）}10分钟MgCl₂将（1 M，体积1%）添加到所得上清液（S1）中，并在冰上搅拌20分钟。然后以2000 g离心分离溶液_{（最大值）}持续10分钟。所得上清液（S2）用于分离顶膜部分，所得颗粒（P2）用于隔离基底外侧膜部分。

为了分离顶膜部分，S2在33000 g下离心_{（最大值）}持续20分钟。将颗粒重新悬浮在原始HS体积的一半和1 M MgCl中₂添加以达到10 mM MgCl的浓度₂在冰上放置20分钟后，以4350 g离心分离溶液_{（最大值）}持续12分钟，然后丢弃颗粒。该程序重复了两次。最后，以6400 g离心分离溶液_{（最大值）}12分钟后，丢弃颗粒，并在32900 g下进一步离心上清液_{（最大值）}持续20分钟，得到的颗粒是心尖膜部分。通过在HS中重新悬浮P2并在48300 g离心，获得基底膜部分_{（最大值）}持续20分钟。该程序重复两次。然后将颗粒重悬在小体积的HS中，并与每10毫升2毫升Percoll混合。将混合物离心48300克_{（最大值）}30分钟后，两层变得明显。通过添加过量的PBS（不含镁和钙）并在48300 g下离心，去除上层并清洗剩余的Percoll_{（最大值）}持续30分钟。将颗粒置于HS中。对两种膜组分进行了表征，通过碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶活性的分析对顶端进行了表征；通过Western blot分析中Mrp1表达的测定对基底侧进行了表征。

西方印记

根据Sambrook的说法，通过Western blot分析对CPEC全细胞蛋白样品或浓缩膜组分进行了研究等[15]. 蛋白质在含有SDS的样品缓冲液（100 mM Tris-HCl（pH 6.8）、4%SDS、2%溴酚蓝、20%甘油）中变性，并使用β-巯基乙醇或D，L-二硫苏糖醇进行还原。将蛋白质样品加热至95°C或60°C 10分钟或5分钟，分别用于分析标记蛋白或ABC转运蛋白。在运行缓冲液（25 mM tris（pH 8.3），250 mM甘氨酸，0.1%十二烷基硫酸钠）中以80 V的电压进行SDS-PAGE（15至6%聚丙烯酰胺凝胶）2小时后，在250 mA的硝酸纤维素上在吸液缓冲液（39 mM甘宁，48 mM三碱（pH 8.3。阻断1小时后，样品在4°C的阻断缓冲液中以1:100的稀释度与目标抗体孵育过夜，然后在1:1000的稀释度的阻断缓冲溶液中以辣根过氧化物酶（HRP）标记的二级IgG（DakoCytomation）孵育2小时。用二氨基联苯胺和氯化镍对所得谱带进行可视化₂猪脑毛细血管内皮细胞、肝脏和肾脏样本作为阳性对照。

CPEC脑脊液分泌

为了通过培养的CPEC评估CSF分泌，将细胞培养在可渗透的聚酯六孔Transwell上^®滤板涂有5μg/ml层粘连蛋白，用于13至15 DIC。细胞在脑脊液分泌缓冲液（CSFB，mM:122 NaCl，4 KCl，1 CaCl）中清洗三次₂，1氯化镁₂，15 Na-HCO_三，15 HEPES，0.5钠₂高性能操作₄，0.5纳赫₂人事军官₄和17.5葡萄糖，pH 7.3，37°C，添加5μg/ml胰岛素[21])。与CSFB预孵育1小时后，将CSFB中1.0 ml 1.0μM 67 kDa荧光素（FITC-右旋糖酐）添加到心尖室和基底侧室，并分泌CSF体积（单位：μl/cm²)计算为FITC-右旋糖酐浓度变化的函数。67 kDa的右旋糖酐适用于这些测量，因为在单独的实验中显示，它对细胞单层是不渗透的。

过滤器在37°C、5%CO下培养₂在95%的相对湿度下保持8h。每小时从心尖室或基底侧室取200μl样品，用新鲜右旋糖酐溶液代替。样品在荧光板阅读器（Ascent Fluoroscan，Oy，芬兰）中进行分析。针对采样方案校正了分泌的脑脊液体积（有关采样方案校正的详细信息，请参阅Hakvoort等[21])然后根据方程式（1）计算：

$五_{CSF公司} = \frac{{C类}_{德克斯 (最初的)} - {C类}_{德克斯 (最终的)}}{{C类}_{德克斯 (最终的)}} \times 五_{0} (1)$

其中，V_CSF公司=脑脊液体积[μl]，CDex（初始）=初始FITC-右旋糖酐浓度[μM]，CDex（最终）=最终FITC-左旋糖酐含量[μM]，V₀=施加的初始体积[μl]。

跨上皮电阻（TEER）

测定了在可渗透聚酯Costar Transwell上生长的CPEC的TEER值^®膜，使用Millicell^®-ERS和STX-2电极系统（世界精密仪器公司，柏林，FRG）。减去从无电池（空白）的涂层过滤器中获得的控制值，所得值乘以过滤器表面积，得到的TEER值为Ωcm².

渗透率实验

为了进行细胞旁渗透性分析，在Transwell上生长了CPEC^®在含血清介质中过滤9个DIC，然后在无血清介质中再过滤5个DIC。标记化合物从顶部或基底外侧室施用，并在相对室中测量累积。所有标记物均以10μM的浓度使用。仅显示TEER高于100Ωcm的过滤系统²（≈600Ωcm²跟随阻抗分析[22])用于渗透率实验。测量了在10μM厚、0.4μM孔径和4×10的聚酯膜上生长的CPEC 14 DIC单层中，5-羧基荧光素（0.4 kDa）和荧光标记右旋糖酐（4.4 kDa至500 kDa之间）的表观渗透系数⁶每厘米生长面积的气孔数。将培养基与Krebs-Ringer缓冲液（KRB）交换，在顶部0.5 ml，在基底侧室1.5 ml，并以所需浓度将试验化合物添加到供体室。以100 rpm摇动平板，在15、30、45和60 min后从受体室中取出100μl样品，并用新鲜缓冲液替换。对于抑制剂治疗，细胞预先与抑制剂单独孵育。对于预孵育和转运测量，将抑制剂添加到心尖和基底外侧隔室。

渗透系数P（P）根据方程式（2）计算试验化合物的含量：

$P（P） = \frac{d日 c（c）}{d日 t吨} \times \frac{五_{一 c（c） c（c） e（电子）第页 t吨 o（o）第页}}{一个 \times {c（c）}_{0}} (2)$

具有直流/直流表示受体浓度随时间的变化，V_受体受体体积，一个膜表面积和c（c）₀初始供体浓度。通过荧光板阅读器（Ascent Fluoroscan）中荧光标记化合物的分析来评估浓度。当使用维拉帕米时[^三H] 添加维拉帕米（NEN/Perkin-Elmer，Rodgau–Jügesheim，FRG），并通过液体闪烁计数分析样品。

CP摄入分析

利用96-well平板中培养的CPEC进行摄取分析。在所有实验中，CPEC培养为13至15 DIC。细胞清洗三次，然后在37°C、pH 7.4的KRB中预培养30分钟，不添加（对照）和抑制剂。分别用底物或底物和抑制剂培养对照样品和处理样品90分钟后，用KRB（pH 7.4，37°C）清洗细胞五次，在1%Triton X-100中溶解，并在荧光板阅读器（Ascent Fluoroscan）中分析微孔。含有CPEC和KRB孵育的微孔仅作为空白。表观摄取是通过从荧光值中减去空白来计算的。使用适当的标准曲线量化荧光值。

统计

所有数值均为平均值±SEM。对照组和治疗组通过学生t检验或单向方差分析进行比较，然后进行Bonferroni或Dunnett事后检验。在*P<0.05和**P<0.01时差异显著。进行回归分析，以分析所用标准曲线的适当性，以及仅与R的线性关系²-大于0.95的值用于转换。

结果

细胞分离和培养

猪脑侧脑脊液经冷胰蛋白酶消化后得6.5×10⁶± 5.2 × 10⁵活细胞/g组织（n=25），每种制剂使用约4.2 g组织。分离后，将细胞接种在任一Transwell上^®过滤系统，96-well板或培养瓶中，种子密度至少为每50厘米1克²或1.2×10⁵每厘米细胞数²总的来说，CPEC生长缓慢，增殖率低。添加阿糖胞苷抑制污染细胞的生长，上皮细胞培养物在9个DIC内发育成单层，显示典型的鹅卵石样外观。在9次DIC后，从培养基中取出血清，CPEC单层再进行4-5天的完全分化。

CP上皮细胞F-actin

肌动蛋白在真核细胞中含量最丰富，且高度保守。肌动蛋白丝与紧密连接（TJ）有关，而周连接肌动蛋白直接参与控制细胞旁通透性[23]. 为了可视化肌动蛋白在培养细胞中的分布，用荧光标记的指骨样蛋白（FITC-指骨样肽）对该蛋白进行染色，该蛋白与f-actin特异结合。碘化丙啶（PI）也被添加到渗透的细胞中，对细胞核进行染色。图图11显示了用FITC-鬼臼肽和PI孵育后的CPEC 14 DIC图像，通过共焦激光扫描显微镜进行可视化。总的来说，培养的上皮细胞呈融合单层。没有出现不需要的和污染的细胞（如成纤维细胞或巨噬细胞）。所有CPEC都大量表达f-actin，正如预期的那样，在完全分化的细胞中，染色显示肌动蛋白丝呈网状和束状，其中一些横跨整个细胞。

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图1

细胞培养14天后，FITC-Phalloidin染色的猪脉络丛上皮细胞单层（f-actin染色为绿色，碘化丙啶染色的细胞核为红色）。

标记蛋白前白蛋白（转甲状腺素，TTR）

在哺乳动物的大脑中，TTR特地定位于CP[24]因此，TTR是CPEC的一个方便标记。猪特异性TTR的未发表mRNA序列，登录号X87846型，由Archibald提交至核苷酸Entrez数据库等[25]. 对于TTR mRNA表达分析，细胞在含血清培养基中生长九个DIC，并允许在无血清培养基上再分化五天。图图2A2安培在溴化乙锭凝胶中显示了猪肝脏（对照）、新鲜CP、CP 9 DIC和CP 14 DIC的扩增cDNA，该凝胶在紫外线下可见。TTR在371 bp处扩增，对TTR mRNA表达具有特异性，并在顶部显示。新鲜的CP（0 DIC）TTR扩增在15个扩增周期后产生凝胶带。培养的CPEC信号强度较低，25个扩增周期后信号可见。β-肌动蛋白在所有CPEC样品中以相似的强度扩增。因此，与培养的CPEC中表达的TTR相比，新鲜CP组织中TTR mRNA的表达更高。

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图2

A）在溴化乙锭凝胶中扩增肝脏（对照）、新鲜CP、CP 9 DIC和14 DIC的cDNA。TTR扩增为371 bp（顶行），β-actin用作内部标准扩增为703 bp（底行）。对于每个样品，通道1至5显示了15至35个周期的扩增结果，通道对应于PCR产物，有5个附加扩增周期（通道1，15；通道2，20，通道3，25；通道4，30；通道5，35）。B）脉络丛上皮细胞单层14 DIC的共焦图像。在左侧，TTR在细胞与抗TTR和二级抗体孵育后显示为绿色。细胞核显示为红色（碘化丙啶染色）。当细胞仅与二级抗体孵育时，在对照图像（右侧）中未发现TTR染色。C）肝脏的TTR Western blot（第1和第2道）、新分离的CP（第3和第4道）和脉络丛上皮细胞14 DIC（第5和第6道）。无一级抗体的样本作为对照（1、3和5道）。

用新鲜和培养的CPEC 14 DIC进行免疫染色和Western blot分析，研究TTR蛋白的表达。图图2B2B型显示了用抗TTR和PI染色的培养CPEC单层的共焦图像。在培养的CPEC中，TTR定位于细胞质，在细胞核周围染色最强烈。细胞膜信号较少。

图图2C2摄氏度显示了在新鲜CPEC和培养的细胞14DIC中变性为15kDa TTR片段（单体亚基）的55kDa TTR的蛋白质印迹。以猪肝为阳性对照。未经初级抗体孵育的样本作为阴性对照。所有添加一级抗体的样本均显示TTR染色。

酶分析

两种酶，碱性磷酸酶（AP；EC 3.1.3.1）和γ-谷氨酰转移酶（γ-GT；EC 2.3.2.1）用于鉴定培养的CPEC。这两种膜结合酶都存在于不同物种（包括猪）的BCSFB中，以前曾用于表征CP膜制剂[26,27]. 在9个DIC时，从培养基中取出血清之前，以及在细胞完全分化后的14个DIC，测定培养CPEC的活性。将测得的酶活性与新分离的CPEC（0 DIC）进行比较。AP活动（图（图3A）3A级)与细胞分离后测定的活性相比，从11.9 mU/mg下降到1.5 mU/mg/mg，从0 DIC下降到9 DIC和14 DIC，分别下降了87.4%和88.2%。γ-GT的减少（图（图3B）3B公司)更为缓慢，数值从11.4 mU/mg降至9.5 mU/mg/mg，从0 DIC降至9和14 DIC，14 DIC后分别下降16.7%和56.1%。

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图3

新分离的脉络丛上皮细胞和细胞9 DIC和细胞14 DIC中的碱性磷酸酶（A）和γ-谷氨酰转移酶（B）活性（平均值±SEM，n=6）。

培养的上皮细胞脑脊液分泌

脑脊液分泌率高体内通过血管供应到神经丛的快速血流（5ml/g/min）为其提供了动力，这大约是平均脑血流量的十倍[28].体外，从6孔Transwell培养的细胞中测量CSF分泌^®过滤系统。将FITC-葡聚糖添加到CSFB中，并分泌CSF体积（单位：μl/cm²)计算为FITC-右旋糖酐浓度变化的函数。

图图44显示培养的CPEC在长达8小时的时间内每小时分泌的CSF量。单层分泌的CSV量以线性方式增加，5小时后达到约150μl/cm的稳定值²此后，每一时间间隔的脑脊液分泌量没有进一步增加。使用线性脑脊液分泌的前4小时内进行的测量，脑脊液产生率测量为48.2±4.6μl/cm²/小时。该模型系统中产生的脑脊液体积与以前的研究结果相似[21]当分泌率约为45μl/cm时²/使用稍微不同的计算方法，在孵育4h后测量h。在另一项研究中，脑脊液生成在6小时后达到饱和，12%的基底外侧室容积分泌到心尖室[29]. 在我们的研究中，5小时后达到饱和，心尖体积增加约15%。体液分泌达到平台的一个可能原因可能是培养系统施加的限制，如果随着时间的推移，基底外侧室中的质子浓度增加，这会抑制钠⁺/H（H）⁺交换，从而分泌液体（因为基底外侧液没有被替换），如Hakvoort所述等. [21].

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图4

14次DIC后脉络丛上皮细胞的分泌量。每小时测量一次，直到8小时（平均值±SEM，n=6）。

培养的CP单层跨上皮阻力（TEER）值

TEER值已被广泛用作细胞屏障泄漏的测量方法。在本研究中，CPEC单层显示的TEER值范围为100至150Ωcm²在>100Ωcm时被判定为融合².由于CP的解剖位置，没有关于TEER的数据体内对于哺乳动物可用，对于任何物种，没有关于侧面CP TEER的TEER信息。在牛蛙中进行了第四脑室CP TEER测量，测量值约为170Ωcm²[30]. Elasmobranch电阻值的测量值为70至107Ωcm²[31]. 在大鼠CPEC的原代培养中，TEER值在100–500Ωcm范围内²[11,12]. 猪CPEC模型显示的电阻值范围为100至170Ωcm²[14,21]. 一组报告的TEER值超过1500Ωcm²对于在无血清培养基中生长的细胞，特定的阻抗分析方法会产生更高的值[22,32]. 然而，这些电阻测量是用与这里使用的不同的设备进行的。当通过阻抗分析量化时，本研究中获得的值等于>600的值。

渗透率标记分析

对于BCSFB的单元在体外，实验条件影响细胞分化，包括紧密连接（TJ）的表达。尽管在体外模型是评估上皮转运的好工具，测量往往会高估体内药物流动和这两类数据之间的相关性是必要的。广泛的化合物被用于表征BBB和BCSFB膜，包括零渗透性标记PEG-4000（FDA，生物药物分类系统：工业指南，2000年）。在这些实验中，P_应用程序（表观渗透系数）值范围为4.56±0.26×10^-5最小值为1.42±0.13×10时为cm/s^-5最大分子的cm/s（图（图5A）。5A级). 值得注意的是，渗透率在大约40 kDa时下降到一个平台，P_应用程序42kDa右旋糖酐的值与P无显著差异_应用程序500 kDa右旋糖酐。

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图5

A） 5-羧基荧光素和右旋糖酐0.4 kDa至500 kDa的表观渗透系数（平均值±SEM，n=6）。B）通过添加EDTA（平均值±SEM，n=6），5-羧基荧光素在无或有开-紧连接的情况下的渗透性。

通过比较单层与完整或开放TJ的通透性，进一步证明CPEC TJ表达。打开TJ的一种方法是从周围介质中除去游离钙。在不向培养基中添加0.25%EDTA和向培养基添加0.25%的EDTA的情况下，测量了5-羧基荧光素（10μM）在CPEC 14 DIC中的转运。通过具有开放TJ的单层，细胞旁标志物的渗透性显著更高，P_应用程序值几乎翻倍（图（图5B5亿)。

ABC-Transport蛋白基因表达

ABC外排转运体的主动排泄不仅清除大脑中的内源性代谢物和废物，而且限制许多治疗化合物的吸收和渗透[33]. ABC转运体的表达在BBB已经被广泛研究。随着整个CP的交付变得越来越重要，且BCSFB中关于ABC运输公司的信息有限，进一步调查这些运输公司在CPEC中的作用至关重要。由于所运输化合物的数量和多样性，导致多药耐药的两种蛋白质尤其重要：MDR表型Pgp，ABCB亚家族的一部分，和Mrp1，ABCC亚家族的部分。与BBB相比，对CP中ABC转运蛋白Pgp和Mrp1的基因表达知之甚少，CPEC Pgp及Mrp1 mRNA的数据仅适用于大鼠[6,34].

对BCSFB中Pgp和Mrp1基因的表达进行定性和定量分析，并确定这两种蛋白在极化CPEC膜上的分布和定位。为了进行Pgp和Mrp1基因表达分析，从新鲜CP、培养的CPEC 14 DIC和肝组织（阳性对照）中分离出猪RNA。为了解释样本间的差异，同时进行β-肌动蛋白扩增。

CP组织和培养的上皮细胞单层的比较RT-PCR实验表明存在Pgp，从而证实了在完整的啮齿动物组织中的最新发现[35]. 图图6A6A级显示了在紫外光下放大的468 bp Pgp DNA产物和703 bpβ-肌动蛋白产物。Pgp扩增50个周期，β-actin扩增35个周期。肝mRNA作为阳性对照。新鲜和培养的CPEC表达低水平的Pgp mRNA。在以前的研究中，在表达水平方面也得到了类似的结果[6]. 然而，必须注意的是，与新鲜组织相比，培养的上皮细胞中Pgp的信号较弱（图（图6A）。6A级). 作为对照，肝组织中Pgp/β-肌动蛋白密度比为1.26，而新鲜Cp组织为1.14，但在14DIC时细胞仅为0.33。培养的上皮细胞中信号较弱，与之前在新鲜分离和培养的微血管内皮细胞中所见的减少相当[16].

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图6

A） Pgp（468bp）和β-肌动蛋白（703bp）的RT-PCR；从左至右：肝脏（1和2道）、新鲜CP组织（3和4道）和CPEC 14 DIC（5和6道）。B） CPEC 14 DIC中Mrp1（436 bp）和β-肌动蛋白（703 bp）的RT-PCR（1和4道）、新鲜CP组织（2和5道）和肝脏（3和6道）。

图图6B6亿显示扩增的436 bp Mrp1 DNA产物和703 bp处的β-肌动蛋白产物。Mrp1扩增50个周期，β-actin（内标）扩增35个周期。分析显示新鲜和培养的CPEC中Mrp1 mRNA表达。肝脏mRNA再次用作阳性对照。为了进行半定量分析，在30个周期中扩增Mrp1，并将培养的CPEC 14 DIC的mRNA与新分离的CPEC进行比较。在β-actin RNA标准化后，培养的CPEC 14 DIC和新分离的CPEC中的Mrp1基因表达没有显著差异（图（图6B）。6亿). 肝组织中MRP1/β-肌动蛋白密度比为1.00，而新鲜CP组织为1.19，细胞14 DIC为0.93。

免疫染色证实了Pgp和Mrp1表达的差异：单克隆抗体C219（Alexis，Grünberg，FRG）被用作Pgp免疫荧光的一级抗体。Pgp蛋白呈绿色，显示出亚顶端和可能的细胞内定位，而不是在完整组织和培养的上皮细胞中明确的膜相关分布（图（图7A）。第7章). 这表明Pgp在CP中的定位可能不同于其他上皮细胞。

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图7

A）脉络丛上皮细胞单层（右侧）和新鲜分离的完整组织（左侧）的共焦图像。Pgp（免疫染色显示为绿色）位于根尖下（细胞内），而不是根尖膜。B） 14天龄细胞单层（右侧）和新鲜分离的完整组织（左侧）中Mrp1的免疫染色。免疫染色（绿色）主要发生在腋下（基底外侧）侧。

在新分离的CP和培养的CPEC中也观察到Mrp1蛋白（图（图7B）。7亿). 用MRPr1抗体（Alexis，Grünberg，FRG）对上皮细胞进行染色，先前显示其与抗原特异结合[36]. 这张图像描绘了一条巨大的单根CP血管，由单层上皮细胞包围。焦平面内的所有上皮细胞核显示为红色。CP血管内部显示为黑色。Mrp1在CP上皮中明显存在。上皮基底外侧血侧染色最强烈。因此，Mrp1表达并定位于基底外侧膜。在CPEC 14 DIC中还分析了Mrp1的表达。图图7B，7亿，右侧，显示一个xy公司-截面和20的数字重组构造xy公司-以1μm间隔采集的切片。与新鲜CP组织一样，Mrp1在培养的CPEC中高度表达，并集中在基底外侧膜。

为了进一步阐明Pgp在上皮细胞中的定位，用分离的膜组分进行了Pgp的Western blots。分离出顶端和基外侧部分。基于碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转移酶的活性，顶膜（CSF取向）匀浆的富集度分别为27.3±0.8倍和27.7±1.0倍。蛋白质印迹分析显示，Mrp1仅定位于基底外侧（面向血液）膜（图（图8）。8). 对于Pgp，这些膜组分的蛋白质印迹排除了基底外侧定位，但在顶膜组分中发现微弱信号（图（图88)。

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图8

Mrp1（左侧；一抗MRPR1）和Pgp（右侧；一抗：Alexis C219）的Western blot。左侧：通道1，心尖部CP膜；通道2，基底外侧CP膜；右侧：通道1，脑毛细血管内皮细胞（20μg）；2巷，基底外侧脉络丛上皮细胞膜（10μg）；3道，心尖膜（10μg）；车道4，基底外侧膜（25μg）；5道，心尖膜（25μg）。

Pgp的功能研究

使用Pgp底物罗丹明123和维拉帕米在CPEC 14 DIC中对Pgp进行功能表征。测量了在96孔板中培养的CPEC 14 DIC对不同浓度的若丹明123的吸收，并评估了对Pgp具有已知亲和力的转运抑制剂的作用。

Pgp的主要胞内定位为推测化合物是否以及如何被排除在CPEC之外留下了空间。如果Pgp插入上皮细胞的顶膜，Pgp底物将被输送回培养基。与抑制剂同时孵育将减少外排并导致细胞底物摄取增加。如果Pgp定位于细胞质小泡，底物将被困在细胞小泡中。底物填充囊泡的胞吐会降低底物浓度。如果发生基底外侧胞吐，抑制剂对胞内囊泡化Pgp的影响只会改变细胞浓度，导致细胞底物浓度增加。

为了从功能上表征Pgp活性，用2μM罗丹明123与Pgp-底物或不与Pgp底物孵育细胞1小时（对照）。脯氨酸被用作次要对照。在培养的CPEC中，包括环孢霉素A（CSA）及其类似物PSC883在内的所有效应物均未在1小时内引起2μM罗丹明123摄取量的显著变化（图（图9），9)表明Pgp在该细胞培养模型的膜中没有功能活性。

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图9

在无（对照）和有ABC-转运蛋白底物的情况下摄入2μM罗丹明123。所有化合物均未对Pgp底物罗丹明123的摄取产生显著影响（CSA=环孢霉素a，PSC=PSC-833；LTC4=白三烯C₄; 指±SEM，n=6）。

除了对罗丹明123的研究外，还对生长在可渗透滤膜支架上的CP上皮细胞中维拉帕米的转运进行了测量。从心尖到基底外侧测定渗透率（a→b）从基外侧到顶端（b→a）个单元格。作为对照，还测量了维拉帕米通过脑毛细血管内皮细胞的转运。与毛细血管内皮细胞相反，在这里可以看到从肺泡（al）到肺泡（l）室的优先净转运（比率al→升/升→铝：8.27；在10μM Pgp阻滞剂PSC-833:1.25的存在下，CP上皮细胞在顶端（a）或基底外侧方向（b）（比率a）均未观察到优先转运→b/b→a： 1.22）。这一结果证实了罗丹明123的发现，并可能表明Pgp在培养的CP细胞中没有功能活性（表（表22)。

表2

维拉帕米对单层培养的分离脑毛细血管内皮细胞和分离脉络丛上皮细胞的渗透性。

		平均渗透系数（×10^-5厘米/秒）	比率
脑毛细血管内皮细胞	勒明（l）→清白（al）	4.68	铝→升/升→al（大脑→血液/血液→大脑）8.27
	花坛的→管腔的	38.70
CP上皮细胞	顶点（a）→基底外侧（b）	11.65	一→b/b→a（CSF→血液/血液→CSF）1.22
	基底外侧的→顶端的	9.55

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Mrp1的功能研究

在培养的CPEC中分析基质荧光素甲氨蝶呤的分泌，并在14DIC下完全分化。因此，FL-MTX通过在Transwell上生长的CPEC的传输^®确定了过滤系统，允许直接接触CPEC的血腥面。代谢抑制剂NaCN将2μM FL-MTX从心尖到基底外侧室的转运减少了50%以上（图10年)，如中所示离体组织[37]. 用有机阴离子白三烯C培养₄（LTC）₄)、MK571和长春碱显著降低FL-MTX从顶端到基底外侧的转运。

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图10

A）荧光素甲氨蝶呤在培养的脉络丛上皮细胞中的转运（14驾驶员信息中心）在没有或存在有机阴离子转运修饰物的情况下，从顶部到基底外侧，以对照组的百分比表示（平均值±SEM，n=6）。B）在有机阴离子转运调节剂存在和不存在的情况下，荧光素甲氨蝶呤通过培养的脉络丛上皮细胞从基底外侧向顶端侧的转运。所有化合物均未对Fl-MTX渗透性产生显著影响（平均值±SEM，n=6）。

2μM FL-MTX从基底侧到心尖腔的转运与心尖到基底侧分泌物的转运无显著差异（图10亿). 与其他有机阴离子培养，包括第页-氨基马尿酸和丙磺舒对FL-MTX的转运没有显著影响。因此，FL-MTX从顶腔向基底外侧腔的转运受到抑制剂的影响，但不受影响反之亦然关于分子和免疫组织化学数据，抑制剂NaCN、LTC₄和MK571最有可能靶向Mrp1，在CPEC基底外侧膜表达。因此，FL-MTX的转运可能由于Mrp1的流出减少而减少。

讨论

本研究的目标是建立一种CP上皮细胞培养模型，该模型允许药物从血液运输到CSF和反之亦然有待研究在体外这种模型的形态和功能特征是估计其预测特性的必要前提。已经证明，猪CP上皮细胞可以被分离和培养，细胞生长成完整的单层，完全分化，性质类似于组织体内。单层大约在电镀后第9天形成，这比之前描述的更快[38]在12-14天用大鼠CPEC观察到单层形成，但与在第8天用大白鼠CPEC测量单层形成类似[12]. 在另一项关于绵羊CPEC的研究中[39]培养细胞在接种后第2～3天出现光学汇合，第4～6天TEER值显著增加，稳态TEER值为85±9Ωcm²在第8天达到。在我们的系统中，TEER值为100–150Ωcm²在汇合处测定，5-羧基荧光素的表观渗透系数为4.5×^-5cm/s，而绵羊CPEC的表观渗透系数为[¹⁴C] 蔗糖约为0.8×10^-5个已测量厘米/秒[39]表明单层膜更紧密。大鼠CPEC单层的蔗糖渗透系数相似，为0.7×10^-5在第8天测定厘米/秒[12].

标记酶AP和γ-GT的活性随着培养时间的延长而降低。然而，酶活性通常随着在体外与组织相比的制剂体内，因为文化条件和周围环境不同。例如，在原代脑毛细血管内皮细胞（BCEC）培养物中观察到AP和γ-GT活性降低，在细胞增殖过程中活性降低，即使在细胞生长为融合单层并完全分化后，活性仍然很低[40].

模型评估中最有趣的方面是Mdr1基因产物p-糖蛋白的功能降低。最近，ABC转运体，尤其是p-糖蛋白，作为血脑屏障的主要防御机制之一，成为人们关注的焦点，它保护CNS免受外来物质的侵害，并维持大脑内平衡的体内平衡[41-44]. Pgp也在CP上皮细胞中表达[35,45]. Pgp功能的缺乏与其他器官（如肝、肾、小肠或血脑屏障）形成对比，在这些器官中，Pgp被证明在化合物流出和/或转运到血流中起着重要作用。然而，在该细胞培养模型中，未观察到Pgp底物维拉帕米和罗丹明123的定向转运，这与毛细血管内皮细胞单层的通透性不同。

没有数据比较CPEC ABC-transporter表达体内和在体外关于BBB，有一项比较研究调查了新鲜大脑和培养的BCEC中的表达水平[16]. 对全脑组织、分离的脑毛细血管和培养细胞中Pgp和Mrp1的分析表明，毛细血管分离后，基因表达水平变化达7倍，培养细胞中的表达可能减少至5倍。本研究首次提供了猪CPEC中Pgp和Mrp1 mRNA表达的数据，并首次在半定量基础上对新分离和培养的CPEC中Mrp1的mRNA表达进行了比较。

Pgp表达的下调可能取决于培养条件。对于缺少Pgp功能，有几种其他解释[33]. 除了Pgp表达水平太低而不影响CP上皮药物分泌外，该蛋白没有以足够高的速率插入培养CPEC的膜中。相反，Pgp可能聚集在囊泡中，囊泡在培养的CPEC中不被转运和/或胞吐功能无效。

我们对亚尖端或细胞内定位的发现与先前研究者的观察一致[35]，他们通过在细胞质中点状或颗粒状染色的间接免疫荧光法在9至12天龄大鼠脉络丛上皮细胞培养物中检测到Pgp。仅偶尔观察到质膜表达模式，但并不一致。然而，在该研究中，Pgp的功能活性可以用紫杉醇和Tc-sestamibi作为底物来证明。

体内关于Pgp在BCSFB中的功能作用的数据是矛盾的：最近一项针对脑肿瘤患者的试验表明，当与三苯氧胺合用时，脑脊液中的紫杉醇浓度有降低的趋势[46]. 作者得出结论，抑制Pgp的药物，如三苯氧胺，可能会降低Pgp底物的CSF浓度。然而，另一项对豚鼠完整脉络丛组织的研究表明，长春碱、维拉帕米或其他HIV蛋白酶抑制剂不影响Pgp底物利托那韦的摄取，因此得出结论，Pgp不影响该药物的处置[47]. 因此，Pgp在完整脉络丛组织中的功能作用尚待阐明。

相反，Mrp1在培养的CP细胞中功能活跃。使用模型化合物FL-MTX进行的对比实验表明，这些复杂过程在培养细胞中完全起作用，模型化合物通过几种转运蛋白的复杂相互作用进行转运。获得的结果在体外模拟观察到的分布体内[37,48]. 这一发现得到了小鼠研究的支持，研究表明缺乏Mrp1的动物脑脊液中Mrp1底物足叶乙甙的积累增加[49]. 这表明，在CP上皮细胞中，Mrp1可能对来自血液的某些药物起屏障作用。

结论

我们已经建立了一个猪脑原发性脉络丛上皮细胞的模型，这使得研究运输过程成为可能。它可以作为一种可靠的工具，用于分析通过血-脑-脊髓液屏障的外源性转运。Pgp的表达在该模型中下调，而Mrp1保持表达水平和功能活性。Pgp主要在细胞内定位，这与完整组织中的发现相一致，并提出了该蛋白在脉络丛中的功能作用的问题

缩写

碱性磷酸酶；脑毛细血管内皮细胞；BCSFB，血-CSF屏障；CNS、中枢神经系统、CP、脉络丛；脑脊液；脉络丛上皮细胞；DIC，培养天数；γ-GT，γ-谷氨酸转肽酶；KRB，Krebs-Ringer缓冲器；TEER，跨上皮电阻；TTR，转甲状腺素；

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

CB进行了细胞分离、PCR研究、酶特性、Western Blot实验和液体分泌研究。VR利用ABC转运蛋白和渗透性标记分析进行功能研究。GF构思了这项研究，并参与了其设计和协调。所有作者阅读并批准了最终手稿。

致谢

该研究得到了瑞士3R基金会的研究资助

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文章来自脑脊液研究由以下人员提供BMC公司