美国国家科学院院刊。2006年10月24日；103(43): 15927–15932.
淘汰Slc25a19系列导致线粒体焦磷酸硫胺耗竭、胚胎致死、中枢神经系统畸形和贫血
,*† ,‡ ,§ ,¶ ,‡ ,* ,* ,‡ ,¶ ,§ ,‡‖和*
马乔丽·林德赫斯特
*美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；
朱塞佩·菲尔蒙特
‡巴里大学生物化学和分子生物学实验室药物生物学系，意大利巴里70125；
宋世伟
§俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系，科罗瓦利斯，俄勒冈州97331；和
爱德华·斯特鲁伊斯
¶荷兰阿姆斯特丹1081 HV VU大学医学中心临床化学系
弗朗西斯科·德·莱昂纳迪斯
‡巴里大学生物化学和分子生物学实验室药物生物学系，意大利巴里70125；
帕梅拉·施瓦茨伯格
*美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；
岳梅樱博士
*美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；
亚历山德拉·卡斯特格纳
‡巴里大学生物化学和分子生物学实验室药物生物学系，意大利巴里70125；
南达·维尔霍文
¶荷兰阿姆斯特丹1081 HV VU大学医学中心临床化学系
克里斯托弗·马修斯
§俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系，科罗瓦利斯，俄勒冈州97331；和
费迪南多·帕尔米耶里
‡巴里大学生物化学和分子生物学实验室药物生物学系，意大利巴里70125；
莱斯利·比塞克
*美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；
*美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所，马里兰州贝塞斯达，邮编：20892；
‡巴里大学生物化学和分子生物学实验室药物生物学系，意大利巴里70125；
§俄勒冈州立大学生物化学和生物物理系，科罗瓦利斯，俄勒冈州97331；和
¶荷兰阿姆斯特丹1081 HV VU大学医学中心临床化学系
由马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院Victor A.McKusick于2006年9月5日传达。
作者贡献：M.J.L.和G.F.对这项工作做出了同等贡献。M.J.L、G.F.、E.S.、P.L.S.、N.V.、F.P.和L.G.B.设计了研究；M.J.L.、G.F.、S.S.、E.S.、F.D.L.、A.Chen和A.Castegna进行了研究；M.J.L.、G.F.、F.D.L.、A.Chen、A.Castegna和C.K.M.贡献了新的试剂/分析工具；M.J.L.、G.F.、S.S.、E.S.、F.D.L.、P.L.S.、A.Castegna、N.V.、C.K.M.、F.P.和L.G.B.分析数据；M.J.L.、G.F.、S.S.、F.P.和L.G.B.撰写了论文。
- 补充材料
支持性数字
GUID:9C19BB3B-7B3A-407B-831F-C4E790A777D9
GUID:3D017886-72E6-4934-8CD7-803B3D689885
GUID:22934F37-A364-41FD-A34A-1B3E3B4DAFE8
指南：03B1C10C-92CD-424A-AE93-5F39E11A9061
GUID:2CE2958D-181B-45FD-82D1-893D5FD5518E
GUID:9927AF5D-B112-4FF0-9453-1BDB74179E7A
GUID:95F5543E-FCCA-4E88-826A-5C60F7122C6A
摘要
SLC25A19型突变导致阿米什致死性小头畸形（MCPHA），显著延缓大脑发育并导致α-酮戊二酸尿。先前的数据表明，SLC25A19，也称为DNC，是一种线粒体脱氧核糖核苷酸转运体。我们生成了一个敲除小鼠模型Slc25a19系列到胚胎第12天，这些动物的产前死亡率为100%。胚胎第10.5天受影响的胚胎出现神经管闭合缺陷，神经折叠脊褶皱，卵黄囊红细胞生成失败，羊水中α-酮戊二酸升高。我们发现这些动物具有正常的线粒体核糖和脱氧核糖核苷三磷酸水平，表明这些分子的运输不是SLC25A19的主要作用。通过同源性搜索，我们确定焦磷酸硫胺（ThPP）转运是SLC25A19的候选功能，并通过重组蛋白的转运分析进行了确认。线粒体Slc25a19系列−/−和MCPHA细胞分别检测不到ThPP含量并显著降低。ThPP水平降低导致α-酮戊二酸脱氢酶复合物功能障碍，这解释了MCPHA中这种有机酸的高水平，并表明线粒体ThPP转运对中枢神经系统发育很重要。
关键词：发育、线粒体转运体、小鼠模型、焦磷酸硫胺缺乏症、神经管缺陷
小头畸形可由许多遗传和环境因素引起。阿米什致命小头畸形（MCPHA）[人类孟德尔在线遗传（OMIM）607196；www.ncbi.nlm.nih.gov/enterz/query.fcgi？db=OMIM（OMIM）]以常染色体隐性遗传，包括严重的先天性小头畸形（头围>平均值以下6 SD）、α-酮戊二酸（AKGuria）水平升高（10–100倍）以及通常在6个月大时死亡(1).
此前，我们在MCPHA患者中发现了一个致病突变（c.530G>c，预测p.G177A）SLC25A19型，编码线粒体膜载体超家族成员（OMIM 606521）(2). 这个SLC25A19型基因也被称为挪威船级社，代表脱氧核苷酸载体（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_021734”，“term_id”：“1890265749”，“term_text”：“NM_021733”}}NM_021734号) (三). SLC25A19包含三个典型的线粒体内线粒体膜载体基序(4). 252条控制染色体中没有p.G177A替代。此外，该甘氨酸在保守域数据库中275个序列中的272个序列中得到保守(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). 功能数据显示，SLC25A19在细胞膜上转运脱氧核苷酸在体外化验系统(三). 最后，我们发现G177A SLC25A19在该试验中没有活性(2)，表明MCPHA与SLC25A19功能缺失突变有关。这些数据并没有证明SLC25A19型突变导致MCPHA，因为突变的Amish MCPHA单倍型上的另一个基因可能发生突变。虽然已经证明SLC25A19可以运输核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸在体外，不知道这是否是它的主要功能。因此，我们设计了实验来解决因果关系问题和SLC25A19的功能。结果表明Slc25a19系列导致CNS缺陷和AKGuria，并且MCPHA中SLC25A19突变的致病机制可能是线粒体焦磷酸硫胺素（ThPP）水平的降低。
结果
用于生成的策略Slc25a19系列−/−小鼠如所示.靶向载体的同源重组替换了Slc25a19系列和Neo一起R（右）基因。如果该转录物稳定，则SLC25A19蛋白将缺失氨基酸97–258，并且应该是无功能的。Southern blot分析显示121个ES细胞系中有6个进行了适当的重组（数据未显示），1个被选作胚泡注射。三只嵌合体小鼠表现出突变等位基因的种系传递。嵌合体与黑色瑞士和129SvEv雌性小鼠交配。未发现遗传背景差异。
的示意图Slc25a19系列淘汰战略。将2.5kb的EcoRI（E）/BamHI（B）片段（5′）和3.9kb的SpeI（S）/EcoRI（3′）片段克隆到pPNT-far中。该结构缺失外显子4-6。用BamHI（B）（3′和neo探针）或NheI（N）（5′探针）消化转染的ES细胞克隆，以测试同源重组。粗线表示鼠标序列，细线表示矢量序列，箭头表示NeoR（右）磁带。点画框代表Southern blot分析探针。黑色数字框是外显子（翻译起始位置在外显子2中）。
Slc25a19系列+/负极动物表现正常。在来自第25页19+/负极交叉，表明胚胎致死。从定时交配中收集胚胎，并进行检查和基因分型。胚胎评估的最佳时间是胚胎第10.5天；然而，在E8.5可以识别突变。不Slc25a19系列−/−胚胎在E12.5后发现。大多数E11.5突变体坏死，表明E11导致死亡。不到四分之一的E10.5胚胎为−/−，这表明死亡率更早。
开放式神经管是Slc25a19系列−/−胚胎(图8，作为支持信息发布在PNAS网站上）。前脑畸形多种多样，但通常涉及整个大脑。开放的神经管的边缘在后脑被折皱并融合(和8）。在躯干中，融合的神经管呈盘旋状，表明神经组织与非神经组织的相对生长速率不规则。突变胚胎比未受影响的同窝婴儿小( A类和B类). 躯干或尾部未发现畸形。一些Slc25a19系列−/−胚胎在发育早期明显受阻，导致非晶胚胎，但这没有进一步评估(D类).
E10.5未受影响和突变胚胎的示例。(A类)未受影响Slc25a19系列+/负极胚胎。(B类)Slc25a19系列−/−胚胎的放大倍数与A类. (C类)胚胎放大倍数更高B类注意沿着开放的神经管（黄色箭头）、神经管融合点（绿色箭头）的褶皱，以及心脏和血管的颜色缺失。(D类)无定形胚胎发育早期受阻的例子。
连续切片显示Slc25a19系列主要影响前部结构。神经外胚层位于前脑和中脑区域的外边缘，没有心室形成的证据（图9，作为PNAS网站上的支持信息发布）。冠状切片显示神经管在心脏层面未完全融合(图10，作为支持信息发布在PNAS网站上）。我们的结论是Slc25a19系列功能丧失突变会导致严重的妊娠中期中枢神经系统缺陷，偶尔还会导致早期发育停滞。
未受影响的冠状面(左侧)和突变型(赖特)E10.5胚胎。这些图像是图10所示的最后一个连续截面的更高放大倍数（分别为154和130）。黄色箭头标记未受影响胚胎切片中心脏和血管中的红细胞。在突变胚胎中，吻侧神经管不是融合的（绿色箭头），而是尾端融合的（红色箭头）。
穿过心脏的部分()在Slc25a19系列−/−胚胎。E10.5胚胎卵黄囊的血液涂片显示，未受影响的胚胎有许多正常红细胞，而突变的胚胎只有很少的红细胞，其中很少是正常的（图11，作为PNAS网站上的支持信息发布）。
为了确定突变株是否在患有MCPHA的人类中发现α-酮戊二酸（AKG）升高，我们设计了从妊娠中期小鼠胚胎中采集羊水的技术。与对照组相比，突变体的羊水AKG升高了5倍(). 这一发现表明，人类MCPHA的两个主要发现，即CNS缺陷和AKGuria，是由以下基因的敲除突变引起的：Slc25a19系列.
E10.5时25个胚胎羊水中AKG水平。使用串联质谱和内标物测量AKG。五个胚胎Slc25a19系列+/+（三角形），13个胚胎Slc25a19系列+/负极（正方形），7个胚胎Slc25a19系列−/−（圆圈）。在同一实验中，对每种颜色代表的样品进行了测量。未受影响者的平均值为6.17±0.72μmol/L，突变体的平均值是30.8±9.91μmol/l(P（P）=0.0155 Mann–Whitney）。使用整个数据集（13.06）的平均值对数据进行二分，并用Fisher精确检验进行检验(P（P）= 0.0004). 这个t吨测试无法使用，因为数据不是正态分布的。
为了研究细胞表型，从E10.5胚胎中提取小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），并用线粒体HSP70抗体和细胞色素亚单位I染色c（c）氧化酶复合物测定线粒体数量是否有任何显著变化。未观察到差异（未显示数据）。
众所周知，SLC25A19可以运输脱氧核苷酸(三)，我们假设敲除将破坏线粒体核苷酸库并导致线粒体DNA耗竭或缺失。我们使用定量PCR检测整个胚胎、卵黄囊和MEF中的线粒体DNA缺失。线粒体与核DNA的比率没有发现一致性差异（数据未显示）。我们还使用Southern印迹分析来筛选线粒体缺失，但结果正常（数据未显示）。我们得出结论，没有证据表明Slc25a19系列−/−动物。
然后我们推测，核苷酸运输的中断可能会改变线粒体功能，而不会影响DNA合成或完整性。为了验证这一想法，直接对野生型和突变型MEF的线粒体进行dNTP水平的检测(). dATP、dCTP和dGTP水平无显著差异。令人惊讶的是，突变线粒体中的dTTP水平略高。从两名患有MCPHA的儿童和两名对照组的人类淋巴母细胞培养物中分离出的线粒体也获得了类似的结果。SLC25A19以前被证明可以运输核糖核苷酸(三)因此，还对这些淋巴母细胞的线粒体rNTP池进行了测量（图12，作为PNAS网站上的支持信息发布）。由于该试验的敏感性有限，仅获得了ATP和GTP水平。同样，与对照样品相比，患者样品中这些核苷酸的水平没有差异。我们得出结论，SLC25A19的功能丧失突变不会破坏小鼠或人类的线粒体脱氧核苷酸库。
野生型和突变型MEF和人类淋巴母细胞中的线粒体dNTP水平。对于MEF，线粒体两次从野生型（蓝条）或突变型（红条）培养物中分离出来。重复测量dNTP水平并取平均值（±SD）。从两个对照（黄条）或患者（绿条）培养物中分离的线粒体测定淋巴母细胞核苷酸水平，并根据病情平均（±SD）。
在这项研究进行中，一种新型线粒体转运体Tpc1p在酿酒酵母(5). 该蛋白将ThPP运输至线粒体，以交换一磷酸硫胺（ThMP），是与人类SLC25A19最相似的酵母蛋白。由于SLC25A19与该酵母蛋白相似（氨基酸同源性为28%，相似性为50%），因此使用重组野生型和G177A突变型人SLC25A19-重组磷脂囊泡来测试SLC25A19.转运ThPP和ThMP的能力。因为SLC25A19只催化底物的交换，而不催化单一转移(三)，并且由于ThPP和ThMP没有放射性形式，因此通过测量α-35S-dATP注入用SLC25A19重组的脂质体中，该脂质体已预先加载ThPP或ThMP(). 与野生型蛋白相似的α-35与内部dATP一样，内部ThPP也有S-dATP摄取。α-35S-dATP也与内部ThMP交换，尽管程度较低。相反，硫胺素没有被交换。与野生型相比，G177A突变体减少了约70%的运输量。G177A突变活性的部分降低，如，当使用在大肠杆菌25°C时（参见材料和方法)，在37°C下表达时观察到完全抑制（数据未显示，参考文献。2).
野生型和突变型SLC25A19的转运分析。用重组野生型（灰条）和G177A突变型（白条）SLC25A19重组的蛋白脂质体内部预载200μM每个dATP、ThPP、ThMP或硫胺。传输开始于20μMα-35S-dATP并在2分钟终止。值为至少三个实验的平均值±SD。
为了测试SLC25A19的缺失是否导致ThPP和ThMP水平的变化，分离了野生型和突变型人类和小鼠细胞的线粒体和细胞溶质部分。通过MS测定ThPP和ThMP水平，并与总细胞蛋白进行比较(). 线粒体部分未检测到ThPP或ThMPSlc25a19系列−/−中小微企业。在细胞溶质部分，与野生型MEF相比，ThPP和ThMP分别增加2.5倍和3.7倍。与对照组相比，人淋巴母细胞线粒体部分的ThPP和ThMP水平分别降低了10倍和17倍。与对照组相比，细胞液中ThPP和ThMP分别增加1.4倍和1.8倍。
表1。
| 单元格类型 | 线粒体
| 线粒体后上清液
|
|---|
| ThPP公司* | ThMP公司* | ThPP公司* | ThMP公司* |
|---|
| 野生型MEF | 2.02 ± 0.25 | 0.19 ± 0.02 | 2.75 ± 0.91 | 0.28 ± 0.04 |
| 突变MEF | 无法检测到 | 无法检测到 | 6.88 ± 0.42† | 1.05 ± 0.05† |
| 控制淋巴母细胞 | 1.03 ± 0.25 | 0.37 ± 0.01 | 3.23 ± 0.26 | 0.22 ± 0.01 |
| 患者淋巴母细胞 | 0.10 ± 0.01† | 0.02 ± 0.01† | 4.63 ± 0.21† | 0.39 ± 0.12† |
为了评估线粒体中缺乏ThPP的后果，直接在一个细胞内测定突变型和野生型线粒体中ThPP需要酶复合体AKG脱氢酶（KGDH）和丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性在体外系统。突变成纤维细胞中KDGH和PDH复合物活性严重降低( A类和C类). 在分析中添加ThPP后，活性完全恢复。PDH复合物活性也通过乙酰肉碱的形成间接测量，这证实了直接测量的结果（数据未显示）。患者线粒体中的KGDH和PDH复合物活性也有所下降，但没有那么严重( B类和D类). 在MEF和淋巴母细胞中测量培养液中的乳酸水平。在突变MEF中，乳酸增加了6.3倍，在患者淋巴母细胞中，乳酸增长了1.6倍（图13，作为PNAS网站上的支持信息发布）。我们得出结论，SLC25A19运输ThPP。在来自Slc25a19系列−/−小鼠和人类细胞中的点突变显著减少。数据表明，ThPP线粒体水平降低导致人类MCPHA代谢异常。
KGDH和PDH复合物分析。KGDH公司(A类和B类)和PDH(C类和D类)通过测量在ThPP存在或不存在下形成的NADH来测定复合物活性。(A类和C类)野生型（白色条）和淘汰型（灰色条）MEF。(B类和D类)来自正常个体（白色条）和MCPHA患者（交叉阴影条）的人类淋巴母细胞。数据表示三个独立实验的平均值±SEM，一式两份。ANOVA分析（双向）用于比较有无ThPP的两组，**表示与对照组相比的显著性(P（P）< 0.05).
讨论
这些数据表明Slc25a19系列对小鼠的发育至关重要。该基因敲除突变的所有纯合小鼠在E12之前死亡。纯合子动物生长迟缓，中枢神经系统发育异常，神经管开放且盘绕。动物也表现出红细胞生成障碍，E9.5几乎没有红细胞。此外，与18个杂合和纯合野生型同卵双胞胎相比，7个受累胚胎中有5个的羊水AKG水平升高。MCPHA患者的羊水AKG升高幅度低于AKGuria，这是预期的，因为小鼠胚胎在肾脏形成之前死亡，因此不能集中代谢物。最后，由于未知的机制，一部分胚胎似乎经历了更早的妊娠死亡。
先前的数据表明，SLC25A19的功能是通过线粒体内膜转运脱氧核苷酸(三). 我们假设这种功能的丧失会导致线粒体基质脱氧核糖核苷酸水平异常低，线粒体DNA缺失或缺失(6)线粒体异常，呼吸功能下降(7,8). 然而，线粒体的数量或形态没有明显变化，我们也没有在基因敲除小鼠中检测到线粒体缺失，正如核苷酸水平异常所预期的那样。尽管SLC25A19可能能够传输dNTP体内该功能并不重要，因为该基因的缺失不会改变突变细胞线粒体中的dNTP水平。Lam最近的一篇文章进一步支持了SLC25A19的生理作用不是dNTP转运等. (9). 他们表明，SLC25A19与抗逆转录病毒治疗中使用的双脱氧核苷类似物引起的线粒体DNA耗竭或线粒体dNTP摄取无关。
Tpc1p基因的最新发现(5)酵母（瑞士-普罗特入口{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P53257”，“term_id”：“1723690”，“term_text”：“P53257“}}第53257页，YGR096W）提出了SLC25A19的另一个功能。Tpc1p将细胞溶质中产生的ThPP运输到线粒体，以交换线粒体生成的ThMP，然后ThMP被代谢并转化回ThPP(5). 在一个在体外交换试验，我们发现与野生型蛋白质相比，含有G177A突变的蛋白质使ThPP和ThMP转运减少约70%。在来自敲除小鼠的MEFs中未检测到线粒体ThPP，并且在来自MCPHA患者的淋巴母细胞中显著降低。我们还发现，SLC25A19突变细胞的线粒体ThPP依赖性酶复合物PDH和KGDH活性低于对照细胞。将ThPP添加到PDH和KGDH复合物分析混合物中，可恢复小鼠和人类细胞系的全部活性。
我们发现与小鼠相比存在差异Slc25a19系列敲除人类MCPHA表型。胚胎致死率Slc25a19系列−/−动物说明了小鼠模型的严重性增加。患有MCPHA的人类是可行的，并且出生时的比例（与未受影响的儿童相比）表明阿米什人SLC25A19型导致MCPHA的突变并不会以可观的速度导致妊娠损失。与MCPHA患者的小头畸形相比，小鼠的神经管缺陷和大脑形成停滞也说明了小鼠模型的严重性增加。小鼠红细胞生成缺陷没有反映出人类MCPHA的公认方面[MCPHA患者的血液计数正常（R.I.Kelley，个人通讯）]。
小鼠和人类表型差异的一个可能解释是，人类点突变保留了一些ThPP转运活性，而小鼠无突变则没有。与敲除MEF相比，MCPHA患者细胞中线粒体ThPP水平和线粒体ThPP请求酶活性的降低程度较小，并且G177A突变蛋白在25°C而非37°C下表达时保留了一些活性，这支持了这一假设。然而，必须考虑其他解释。首先，另一个转运蛋白可能与SLC25A19具有重叠功能，并且两个物种的功能重叠可能存在差异。除核苷酸和ThPP转运外，SLC25A19还可能具有未被识别的功能，这些功能在敲除小鼠中丢失，但在人类MCPHA突变中保留。最后，小鼠模型可能不适合这些实验。为了解决这些问题，未来的研究需要涉及模拟人类突变的敲除结构。
氧化磷酸化在早期胚胎发生中很重要(10–13). 通过靶向破坏小鼠二氢硫酰胺脱氢酶阻断三羧酸循环(Dld（数字）)基因[编码PDH、KGDH和分支链α-酮酸脱氢酶（BCKDH）复合物的E3成分]，或PDH E1α亚单位的基因(普达1)分别导致发育迟缓和E8.5或E12.5致死(14,15). 我们推测Slc25a19系列−/−胚胎是由PDH和KGDH复合反应的通量减少引起的。大脑结构畸形Slc25a19系列−/−胚胎支持这样的假设，即发育中的大脑比其他器官更需要氧化代谢(16). 除了减少体内氧化代谢产生的能量外Slc25a19系列−/−由PDH和KGDH复合物活性降低引起的胚胎和MCPHA患者，Krebs循环中间产物减少也可能在突变体的表型中发挥作用。事实上，线粒体中作为KGDH复合物产物的琥珀酰辅酶a水平较低，可能是红细胞生成失败的原因，因为血红素生物合成需要琥珀酰辅酶a和甘氨酸的缩合。红系细胞中该酶的小鼠基因断裂导致血红素缺乏(ALAS-E公司)E11.5引起贫血和死亡(17). 相比之下Slc25a19系列−/−突变，ALAS-E缺失的胚胎有一些未成熟的原始非血红蛋白化红细胞，这表明血红素合成的减少不能仅仅是红细胞发育不足的原因Slc25a19系列−/−胚胎。这一问题需要通过未来的研究加以解决。
总之，我们通过敲除小鼠，制作了人类阿米什小头畸形的小鼠模型Slc25a19系列基因，人类的直系亲属SLC25A19型或挪威船级社突变体具有类似于人类疾病的CNS和代谢表型。如前所述，小鼠SLC25A19功能丧失不会导致线粒体dNTP池减少，而是降低线粒体ThPP。ThPP的减少抑制了关键代谢酶的活性，包括KGDH复合物，这解释了MCPHA中AKGuria的原因，并强调了氧化代谢在早期胚胎发生中的作用。
材料和方法
的生成Slc25a19系列−/−动物。
pPNTDNC目标构造()用NotI线性化。TC1细胞（2×107)用基因脉冲器（Bio-Rad，Hercules，CA）在1 ml PBS中转染25μg线性DNA。24小时后将细胞换成含有G418和5-碘-2′-氟-2′脱氧-1-β的培养基-d日-阿拉伯-呋喃糖基-乌拉西尔（FIAU）。七天后，选择菌落进行冷冻和DNA分析。将大约15个靶向ES细胞注射到每个C57B6/J囊胚中。将囊胚植入出生后2.5天的NIH Swiss–Webster假孕小鼠体内。嵌合体在6周龄时与黑瑞士小鼠交配，以评估种系传播。
胚胎程序。
在E8.5–E13.5收获胚胎，收集卵黄囊进行基因分型。大多数胚胎在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜，转移到100%甲醇中，并在−20°C下储存。Histoserve（Germantown，MD）对胚胎进行石蜡包埋、切片、苏木精和伊红染色。
为了采集胎儿血液，将卵黄囊中的胚胎放入含有1 ml PBS的24孔培养皿中。取出卵黄囊和羊膜，使卵黄囊血管血溢出PBS。离心细胞，在玻片上扩散，用Wright–Giemsa染色，并用显微镜检查。
为了收集羊水，在卵黄囊完整的情况下解剖E10.5胚胎。将胚胎转移到一个干燥的盘子中，滚动去除PBS，以避免稀释羊水。羊水用1毫升注射器和32号针头收集。为了尽量减少堵塞，将针头插入羊膜腔，使开口远离胚胎，然后将液体缓慢地吸入注射器。
细胞培养。
从E10.5胚胎中收集MEF，并使用卵黄囊进行基因分型。用镊子将胚胎切碎，并将其放入含有10%FBS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的DMEM的12孔细胞培养皿中。通过使用标准技术扩增粘附细胞。定期分离DNA并进行基因分型。来自两名MCPHA患者的淋巴细胞（由马里兰州巴尔的摩肯尼迪克里格研究所R.I.Kelley提供）在含有10%FBS、青霉素/链霉素和谷氨酰胺的RPMI培养基1640中生长。
AKG含量测定。
用移液管将等分（2–5μl）的小鼠羊水移到玻璃管中，然后用0.5 ml水和0.05 nmol的2H（H）4-AKG（Eurisotop，Saint-Aubin Cedex，法国），用于内部标准。通过在60°C下添加10μl 6 M HCl和60μl 10 mg/ml五氟苄基羟胺30分钟来衍生AKG。使用固相萃取筒萃取衍生物，并在HPLC小瓶中用0.6 ml甲醇洗脱。用C18分析柱，用二元线性梯度洗脱。串联质谱用于阴性模式，AKG和内标物在多反应模式下测量。
核苷酸水平。
线粒体核苷酸库按照Song进行制备等. (6). 简单地说，通过胰蛋白酶化在20个150毫米的培养皿中收获MEF。从五个T100烧瓶中的悬浮培养中收集人类淋巴母细胞。线粒体分离和提取物的制备如参考文献所述。6.rNTP池使用Hewlett-Packard 1050系统（260-nm检测）通过HPLC测定。将提取物注入在75 mM NH中平衡的Altex Partisil 10 SAX离子交换柱中4人事军官4（pH 3.6）。rNTP用NH洗脱4人事军官4梯度缓冲液范围为0.075 M至1.0 M（pH 3.6），速度为1.2 ml/min。核糖核苷酸通过保留时间进行鉴定，并通过峰面积与真实标准品进行定量。
SLC25A19和SLC25A19-突变体的过度表达和纯化。
野生型和G177A突变型SLC25A19作为包涵体产生于E类.大肠杆菌参考文献中所述的BL21（DE3）。18，但在25°C下诱导20小时除外。如参考文献所述，纯化包涵体。5，但Triton®声波风廓线仪缓冲液中含有pH值为7.2的Hepes（而非Pipes）。
SLC25A19蛋白质重组为脂质体和转运测量。
如参考文献所述，在底物存在下将重组蛋白重组为脂质体。19在Sephadex G-75柱上去除蛋白质脂质体的外部底物，并用50 mM NaCl和10 mM Pipes在pH 6.8下进行预平衡。已通过添加启动传输35S-dATP（PerkinElmer，Wellesley，MA）到蛋白质脂质体并通过添加0.1 mM终止第页-氯汞磺酸盐（“抑制剂-停止”方法；参见参考。18). 脂质体中加入的野生型和SLC25A19突变蛋白的数量从添加到重组混合物中的蛋白质的16%到27%不等。
质谱法测定ThPP和ThMP。
从线粒体和线粒体后上清液中提取ThPP和ThMP基本上按照Pontarin的描述进行等. (20). 细胞悬浮在0.2 M甘露醇/0.07 M蔗糖/0.2 mM EGTA/0.5%BSA/10 mM Tris·HCl（pH 7.4）中，并按照参考文献中的描述进行均质和离心。19线粒体提取物冻干过夜并冷冻。线粒体后上清液用100%甲醇处理，离心，冻干过夜，冷冻。样品溶解在水中，过滤，并进行液相色谱-质谱分析。
使用带有Alliance 2695 HPLC系统（Waters，Milford，MA）的Quattro Premier质谱仪在正离子模式下对ThPP和ThMP进行电致电离液相色谱串联质谱分析。ThPP监测的多重反应监测转变为米/z（z）425.2>122.1，ThMP为米/z（z）345.2 > 122.1. ThPP和ThMP的色谱分离是通过使用Hypercarb多孔石墨碳柱（4.6×100 mm，5-μm粒径；Thermo Electron，Waltham，MA）以线性梯度从含0.1%TFA的100%水（初始相）洗脱到含0.1%TFA/90%乙腈的10%水来实现的。HPLC流量为1 ml/min，在进入MS源之前分流至200μl/min。使用在与样品相同的条件下处理的标准溶液，在四种浓度下设置校准曲线。通过对峰分析物面积的回归分析确定最佳拟合。
PDH和KGDH复合物分析。
根据制造商的说明，使用带有停止蛋白酶抑制剂混合物（Pierce，产品编号78415）的试剂盒（伊利诺伊州Rockford Pierce）从人类淋巴母细胞和小鼠成纤维细胞中分离线粒体。PDH和KGDH复合物的活性基本上由Munujos测定等. (21). 淋巴母细胞和成纤维细胞线粒体在pH 7.2的10 mM Tris·HCl中在30°C下预孵育30 min，用0.1%（wt/vol）Triton X-100溶解，并在10000×克将70微升上清液（180–200μg蛋白质）添加到430μl含有100 mM Tris·HCl的混合物中，pH值7.6，4 mM CoA，4 mM-NAD+和40μM鱼藤酮，含或不含4 mM ThPP。用8 mM AKG或8 mM丙酮酸开始检测，然后在340 nm处形成NADH。
细胞外培养基中的乳酸释放。
总计2×106人淋巴母细胞在10ml培养基中培养72h，然后在1500×克10分钟，然后，1×106小鼠胚胎成纤维细胞在75℃培养2烧瓶72h（接近汇流处）；收集培养基并离心以清除细胞碎片。根据古特曼和瓦赫菲尔德的规定，对两种细胞类型上清液中的乳酸进行测定(22).
致谢
我们感谢G.Elliot、C.Rivas、R.Nussbaum、D.Bodine、L.Wheeler、W.Pavan、C.Yang、S.Loftus、D.Larson、J.Fekecs和R.I.Kelley的技术专长、建议和鼓励。这项工作得到了来自陆军研究办公室LS-45039国家人类基因组研究所校内研究计划拨款（发给C.K.M.）、利塞尔卡大学部长、礼炮部长、利塞尔卡大学部长L.488/92（集群03）、，和欧盟委员会合同LSHM-CT-2004-503116。
词汇表
缩写
| MCPHA公司 | 阿米什致命小头畸形 |
| E类n个 | 胚胎期n个 |
| AKG公司 | α-酮戊二酸 |
| ThPP公司 | 焦磷酸硫胺 |
| 阿克古里亚 | 酮戊二酸 |
| MEF公司 | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| ThMP公司 | 一磷酸硫胺 |
| 千克/小时 | AKG脱氢酶 |
| PDH公司 | 丙酮酸脱氢酶。 |
工具书类
1Kelley RI、Robinson D、Puffenberger EG、Strauss KA、Morton DH。美国医学遗传学杂志。2002;112:318–326.[公共医学][谷歌学者] 2Rosenberg MJ、Agarwala R、Bouffard G、Davis J、Fiermonte G、Hilliard MS、Koch T、Kalikin LM、Makalowska I、Morton DH等。Nat Genet。2002;32:175–179.[公共医学][谷歌学者] 三。Dolce V、Fiermonte G、Runswick MJ、Palmieri F、Walker JE。美国国家科学院程序。2001;98:2284–2288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4帕尔米耶里·F·。Pflügers拱门。2004;447:689–709.[公共医学][谷歌学者] 5Marobbio CM、Vozza A、Harding M、Bisaccia F、Palmieri F、Walker JE。EMBO J。2002;21:5653–5661. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Song S、Wheeler LJ、Mathews CK。生物化学杂志。2003;278:43893–43896.[公共医学][谷歌学者] 7Holmuhamedov E、Jahangir A、Bienengraeber M、Lewis LD、Terzic A。线粒体。2003;三:13–19.[公共医学][谷歌学者] 8Miranda S、Foncea R、Guerrero J、Leighton F。生物化学与生物物理研究委员会。1999;258:44–49.[公共医学][谷歌学者] 9Lam W、Chen C、Ruan S、Leung CH、Cheng YC。摩尔药理学。2005;67:408–416.[公共医学][谷歌学者] 10Johnson MT、Mahmood S、Patel MS。生物化学杂志。2003;278:31457–31460.[公共医学][谷歌学者] 11Hance N、Ekstrand MI、Trifunovic A。人类分子遗传学。2005;14:1775–1783.[公共医学][谷歌学者] 12Larsson NG、Wang J、Wilhelmsson H、Oldfors A、Rustin P、Lewandoski M、Barsh GS、Clayton DA。Nat Genet。1998;18:231–236.[公共医学][谷歌学者] 13Li K、Li Y、Shelton JM、Richardson JA、Spencer E、Chen ZJ、Wang X、Williams RS。细胞。2000;101:389–399.[公共医学][谷歌学者] 14Johnson MT、Yang HS、Magnuson T、Patel MS。美国国家科学院程序。1997;94:14512–14517. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Johnson MT、Mahmood S、Hyatt SL、Yang HS、Soloway PD、Hanson RW、Patel MS。分子遗传学。2001;74:293–302.[公共医学][谷歌学者] 16Brown GK、Otero LJ、LeGris M、Brown RM。医学遗传学杂志。1994;31:875–879. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Nakajima O、Takahashi S、Harigae H、Furuyama K、Hayashi N、Sassa S、Yamamoto M。EMBO J。1999;18：6282–6289。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Fiermonte G、Walker JE、Palmieri F。生物化学杂志。1993;294:293–299. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Palmieri F、Indiveri C、Bisaccia F、Iacobazzi V。方法酶制剂。1995;260:349–369.[公共医学][谷歌学者] 20Pontarin G、Gallinaro L、Ferraro P、Reichard P、Bianchi V。美国国家科学院程序。2003;100:12159–12164. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Munujos P、Coll-Canti J、Beleta J、Gonzalez-Sastre F、Gella FJ。临床化学学报。1996;255:13–25.[公共医学][谷歌学者] 22Gutmann I，Wahlefeld A.在：酶分析方法。Bergmeyer HU，编辑。纽约：学术；1974年，第1464–1468页。[谷歌学者] 
