SARS冠状病毒核衣壳蛋白在缺乏生长因子的情况下诱导COS-1细胞肌动蛋白重组和凋亡

摘要

简介

2003年，SARS（严重急性呼吸综合征）的病原体在世界不同地区引发了严重的非典型肺炎疫情[1]. 该病毒是冠状病毒家族的一个新成员[2,3]. SARS病毒（SARS-CoV）是一种包膜阳性RNA病毒，其基因组包含约30000个核苷酸，预计编码13-15个ORF（开放阅读框）[4]. 与其他已知冠状病毒ORF的序列比较显示出类似的基因组织模式，非结构基因聚集在5′端，结构基因位于基因组的3′端，与II类冠状病毒最为相似[3,4]. 病毒的高毒力导致感染患者的显著死亡率，这引起了人们对了解该病毒致病机制的广泛科学兴趣。

SARS-CoV核衣壳（N）蛋白是一种预测为46kDa的磷酸蛋白，它可以自我结合形成二聚体[5]与冠状病毒家族的其他成员具有同源性。然而，它独特的是一个短的富含丝氨酸的延伸，以及一个假定的二分核定位信号，因此表明它参与了病毒生命周期中除衣壳组装以外的其他重要功能。据报道，N蛋白可激活AP1（激活蛋白1）信号转导途径[6].

最近，SARS病毒已被证明能在细胞培养中诱导细胞凋亡[7]. 在本文中，我们描述了N蛋白在病毒诱导的凋亡中的可能作用。对表达N蛋白的COS-1细胞的实验导致了显著的程序性细胞死亡，尤其是在缺乏生长因子的情况下。N蛋白促凋亡性质的数据显示ERK（细胞外信号调节激酶）下调，但JNK（c-Jun N末端激酶）和p38 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）活性上调。这些观察结果与相应的下游效应器也一致。此外，p38 MAPK级联激活可诱导肌动蛋白重组。N的表达还可以下调磷酸化Akt和Bcl-2的水平，激活半胱氨酸蛋白酶3和7，导致细胞凋亡。这是首次报道SARS-CoV的N蛋白诱导哺乳动物细胞凋亡的能力。

材料和方法

结果和讨论

为了了解SARS-CoV的N蛋白在哺乳动物细胞环境中的作用，我们将N基因克隆到两个不同的真核表达载体中。为了避免SARS-CoV N蛋白的N端或C端区域被阻断，导致融合标签导致功能损伤，我们将N克隆到带有C端的pcDNA3.1中myc公司标记，并使用N端子HA标记将其插入pSGI。两种构建物均转染COS-1细胞，并在标记蛋白后用相应抗体进行免疫沉淀[³⁵S] 半胱氨酸/[³⁵S] 蛋氨酸Promix。两种结构都表达了约48 kDa的N蛋白迁移（图​（图1A，1A、 车道2和4）。在COS-1细胞中，pSGI构建体导致N蛋白的表达比pcDNA3.1 N构建体更强。这可能归因于SV40（猿病毒40）启动子在COS-1细胞中的高效性。排除由位置效应引起的任何功能变化myc公司使用两个转染克隆检查N过度表达的HA标记、p-ERK、p-Akt、Bcl-2和p-FAK的水平，发现所有病例都是相同的（结果未显示）。

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图1

SARS冠状病毒N诱导细胞死亡

(一个)通过免疫沉淀模拟转染（C）或pcDNA3.1分析N蛋白的表达myc公司-标记的N-（myc-N）或pSGI-HA-taged N-（HA-N）转染的细胞裂解物带有相应的抗体。车道2和4显示N表示，而车道1和3是各自的控制。(B类)TUNEL分析结果。泳道1和2分别显示存在血清（Ser）的模拟（C）或N-转染（N）细胞，而泳道3和4显示不存在血清的相同细胞。TUNEL阳性细胞从三组实验中的每一组共500个细胞中进行评分。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。这个P（P）车道1和2的值为0.17，车道3和4的值为0.02。不含血清的TUNEL阳性细胞约占总细胞数的30%。蛋白质。(C类)显微镜下观察到的具有代表性的TUNEL阳性细胞区域。

有趣的是，转染SARS-CoV N的细胞在血清饥饿诱导的应激条件下培养时表现出明显的细胞死亡。为了量化这些条件下的细胞死亡，我们进行了TUNEL分析。如图所示​图1（B），1（B） 在N（第4车道）存在的情况下，血清饥饿导致约30%的细胞死亡。然而，模拟转染细胞（仅用空载体转染）在没有血清的情况下没有表现出显著的细胞死亡（第3条车道），也没有表现出N转染细胞在有血清的情况（第2条车道）。此外，在类似条件下维持的人肝癌细胞（HuH7）未显示明显的细胞死亡（结果未显示）。在我们的实验中观察到的COS-1细胞相对中等的死亡率可能归因于瞬时转染方法的局限性。然而，在重复实验中，结果是可重复的。图​图1（C）1（C） 显示了无血清条件下TUNEL阳性N表达细胞的典型区域。

鉴于只有在缺乏生长因子的情况下才能观察到N诱导的细胞死亡，并且众所周知，配体与整合素受体的结合在生长因子介导的信号缺失的情况下通过PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）和MAPK途径维持主要的生存途径[8]因此，我们假设N可能干扰整合素信号通路。实验旨在监测N表达细胞中整合素受体和配体的表达水平。我们检查了最丰富的配体之一纤维连接蛋白的水平。在没有血清的情况下，N的表达明显下调了细胞外纤维连接蛋白的水平（图​（图2A，2A、 上部面板）。然而，由于免疫沉淀法只能检测到少量蛋白质，因此我们无法观察到血清中纤维连接蛋白水平的显著差异。这可能是由于纤连蛋白在血清因子存在下的稳定性较低。接下来，我们研究了N介导的细胞外纤维连接蛋白水平的下调是否是由于纤维连连接蛋白基因表达的抑制。为此，我们用brefeldin A处理限制蛋白质在内质网外的转运，并用抗纤维连接蛋白抗体免疫沉淀细胞裂解液，这表明细胞产生的新生纤维连接到蛋白总量。正如预期的那样，无论是否有血清，N表达细胞中的纤维连接蛋白水平都较低（图​（图2A，2A、 下图），表明N下调纤连蛋白基因表达。随后，我们分析了纤维连接蛋白受体（整合素α_V（V）)，但后者的水平没有变化（图​（图2B）。2B） ●●●●。然后我们分析了FAK的活性，FAK是一个主要的中间因子，协调整合素和下游效应器（如MAPK）之间的信号传递[9]. 在缺乏生长因子的情况下，N表达细胞中磷酸化FAK的水平显著下调（图​（图2C）。2C） ●●●●。这一结果进一步支持了我们的假设，即N诱导的细胞死亡是由于对整合素信号通路的干扰，而血清因子主要通过其他途径维持FAK的活性来抑制这一现象。图​图2（D）2（D） 显示了在存在和不存在血清的情况下N蛋白的表达模式。在所有的Western blot实验中使用两种不同浓度的DNA（1.5μg和3μg），以排除任何可能的实验伪影。

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图2

N下调纤维连接蛋白表达

(一个)Mock转染（C）或N转染（N）细胞保持在有（Ser+）或无（Ser-）血清的状态。对于细胞外纤维连接蛋白水平（上面板），使用相应抗体免疫沉淀生长介质。对于细胞内纤维连接蛋白水平，用brefeldin A（10μg/ml）处理细胞2h，在RIPA缓冲液中溶解，用抗纤维连蛋白抗体免疫沉淀，用SDS/6%PAGE溶解并免疫印迹。参考同一凝胶中的非特异性带（calnexin）对数值进行标准化（针对细胞外纤维连接蛋白或针对细胞内纤维连连接蛋白的calnexin水平）。(B类)在上述类似条件下生长的细胞在SDS缓冲液中溶解，用SDS/7%PAGE进行解析，并用抗整合素α进行免疫印迹_V（V）)或抗calnexin抗体（负荷控制）。(C类)p-FAK（Tyr）水平³⁹⁷). 下凝胶显示calnexin水平作为负荷控制。N（1.5）和N（3）分别表示转染1.5μg和3μg DNA的样品。用3μg空载体DNA转染模拟样品。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(D类)分别在有血清（1、2和3道）或无血清（4和5道）的情况下，用抗Myc抗体进行免疫沉淀，以不同浓度的DNA评估N的表达。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。

接下来，我们检查了不同MAPK的活性，因为它们是整合素信号级联的主要下游效应器。有趣的是，N的表达调节了所有三个主要的MAPK信号通路。在没有血清的情况下，N的表达下调了p-ERK的活性（图​（图3A，3A、 车道4–6）。此外，N表达上调了应激激活蛋白激酶的活性，即JNK和p38 MAPK通路。在没有血清的情况下，活性显著升高（图​（图3B，3B、 顶部面板，通道5和6）。p-Jun水平升高进一步反映了JNK活性的上调（图​（图3B，3B、 第三个面板，通道5和6）。此外，在没有血清的情况下，c-Jun的水平也增加了（图​（图3B，3B、 第四个面板，通道5和6）。这些数据与最近的一份报告一致[6]，这表明AP1在N的存在下上调。此外，p38 MAPK通路下游底物的磷酸化也被发现上调（图​（图3C，3C、 第三和第四面板，车道5和6）。

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图3

N蛋白表达调节细胞MAPK活性

(一个)Mock转染或Myc–N克隆转染细胞在血清（Ser+）中保持48小时（1–3道）或在血清中饥饿24小时（Ser−，4–6道）；用SDS裂解缓冲液采集，用SDS/12%聚丙烯酰胺凝胶电泳解析，并用相应抗体进行免疫印迹。图中显示了p-ERK和总ERK的水平。直方图显示了平均值±S。三组独立实验的E.M。(B类)p-JNK、p-Jun和总c-Jun水平。Calnexin用于确保载荷相等。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。黑色条代表p-JNK，深灰色条代表p-c-Jun，浅灰色条代表c-Jun(C类)p-p38 MAPK、p-MAPKAPK2（MAPK-activated protein kinase 2）和p-HSP27水平。p38 MAPK总水平作为p-p38 MAPK的负荷控制。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。黑色条表示p-p38 MAPK，深灰色条表示p-MAPKAPK2，浅灰色条表示p-HSP27。

由于HSP27磷酸化上调，我们质疑肌动蛋白组织在N表达细胞中是否受到影响。为了解决这个问题，我们使用罗丹明结合的卵磷脂来分析N存在时肌动蛋白的分布。在血清存在时，N的表达对肌动蛋白分布没有明显影响（图​（图4A，4A、 比较N蛋白转染细胞和非转染细胞）。图​图4（C）4（C） 显示了在没有生长因子的情况下，肌动蛋白在N表达细胞中的分布，即肌动蛋白丝集中在核膜周围，形成环状结构。相反，肌动蛋白广泛分布在未转染细胞的细胞质中。为了证明这种环状结构确实是肌动蛋白，我们使用了特定的肌动蛋白解聚剂细胞松弛素D，它在低至5 nM的浓度下有效地阻止了肌动蛋白环的形成（图​（图4E）。4E） ●●●●。此外，使用SB203580验证肌动蛋白重组是否依赖于p38 MAPK通路。如图所示​图4（G），4（G） ，SB203580抑制N-转染细胞中肌动蛋白的重新分布。数字​图4（B），4（B） ，​（B） ，4（D），4（D） ，​（D） ，4（F）4（F） 和​和4（H）4（H） 在各细胞中显示N表达（FITC-染色图像与罗丹明染色图像重叠）。因此，我们得出结论，在缺乏生长因子的情况下，N诱导的p38 MAPK通路激活导致肌动蛋白重组。

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图4

SARS冠状病毒N蛋白诱导肌动蛋白重组

用罗丹明结合的指骨肽和HA标记的N进行免疫荧光研究(一个)肌动蛋白在血清中的分布。黄色箭头表示N-转染的细胞，绿色箭头表示未转染的细胞。(B类)用FITC-偶联抗鼠抗体染色相同的N表达区（合并图像）。(C类)肌动蛋白在无血清时的分布。箭头如中所示(一个). (E类)细胞松弛素D（5 nM）存在时肌动蛋白的再分配。(G公司)SB203580（10μg/ml）的影响。(D类,F类和H（H）)将FITC-染色图像叠加在罗丹明染色图像上，分别显示在无血清、细胞松弛素D或SB203580的情况下N的表达。

此外，我们还研究了PI3K通路的主要中间产物Akt的活性，这是细胞中主要的生存途径。Akt在Thr下的磷酸化³⁰⁸by PDK（磷脂酰肌醇依赖性激酶）是激活Akt下游靶点的关键事件[10]. 发现在无血清的情况下，p-Akt水平显著下调（图​（图5A，5A、 车道4–6）。使用PI3K的p110α（pCDNA3 PI3K caax 110 HA；德国埃尔兰根大学的A.S.Baur博士）亚基的表达构建物进一步证实了这一观察结果，该亚基被证明是PI3K组成活性突变体。通过抑制caspase 3的激活（图​（图5E，5E、 车道1）。然后我们分析了存在N时Bcl-2的表达水平。在没有血清的情况下，Bcl-2免疫沉淀显示出强烈的下调（图​（图5B，5B、 车道4–6）。然而，Bcl-X的水平_L（左）在N表达细胞中不受影响，无论是否存在生长因子（结果未显示）。

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图5

N表达下调促生存因子并在缺乏生长因子的情况下诱导凋亡

(一个)p-Akt（Thr）水平³⁰⁸)存在（Ser+）和不存在（Ser-）血清。较低的凝胶显示了在相同条件下总Akt的水平。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(B类)分别在有血清（Ser+）或无血清（Ser-）的情况下，从模拟（C）或N转染（N）细胞裂解液中免疫沉淀Bcl-2，并通过Western blotting检测。calnexin水平显示为底部凝胶中的负载控制。直方图显示平均值±S。三组独立实验的E.M。(C类)N-表达细胞（通道4）中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和7的激活。抗（caspase 3）抗体检测前体和裂解产物。(D类)抗（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7）抗体仅对裂解产物具有特异性。(E类)在PI3K（110，第1条通道）、10μg/ml SB203580（SB，第2条通道）或100μM Z-VAD-FMK（Z，第3条通道）的p110α亚单位过表达的情况下，对血清缺乏的N表达细胞中caspase 3进行Western blot。

最后，我们分析了有无血清时两种主要下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的状态。胱天蛋白酶3的激活产生17kDa的产物，该产物仅在不存在生长因子的情况下存在于N-表达细胞中。使用检测前体和裂解产物的抗体检测该激活（图​（图5C，5C、 车道4）。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶7激活产生20 kDa的主要产物。与caspase 3一样，caspase 7也仅在N表达细胞中缺乏生长因子的情况下被激活。这是由一种仅针对裂解半胱天冬酶7的抗体检测到的（图​（图5D，5D、 车道4）。半胱天冬酶3的激活被Z-VAD-FMK进一步证实，Z-VAD-VMK阻断了其激活（图​（图5E，5E、 车道3）。然而，SB203580阻断p38 MAPK通路不能抑制caspase 3的激活。因此，我们认为p38 MAPK依赖的肌动蛋白重组和caspase激活可能是N的两个独立的功能特性。此外，发现N介导的凋亡独立于Fas或Fas-l介导的途径，不涉及p53和Bax的调节（结果未显示）。从这些实验中，我们得出结论，SARS-CoV的N蛋白在缺乏生长因子诱导的细胞应激期间通过干扰整合素信号通路诱导细胞凋亡和肌动蛋白重组。

报告强烈表明，大多数SARS患者早期的细胞因子风暴有助于SIRS（全身炎症反应综合征）的进展。SARS非典型肺炎的主要组织病理学损害是大多数肺泡的浆液性、纤维蛋白性和出血性炎症，肺泡增厚伴间质单核炎性浸润，弥漫性肺泡损伤，肺细胞脱屑，形成透明膜和多核肺细胞，毛细血管充血和微血栓形成。SARS患者还表现出淋巴减少，以及淋巴结和脾脏结构异常，包括出血性坏死、淋巴细胞数量减少、淋巴结滤泡耗竭和脾结节萎缩。肺细胞是感染的主要目标。SARS-CoV感染对肺、淋巴造血、肝和其他组织造成严重和类似的损害是SARS临床特征的原因，并可能导致患者死亡[11,12]. SARS N蛋白已被证明具有高度免疫原性。患者对N有显著的抗体反应[13]. 这一过程可能反过来触发细胞因子的产生，而细胞因子实际上可能会诱导宿主细胞凋亡。我们的结果还表明，SARS的N蛋白能够诱导肌动蛋白重组。因此，具有改变的细胞因子环境和细胞骨架重组的感染焦点可能会改变参与对抗感染的宿主细胞之间相互作用的持续时间，降低这种持续时间将导致免疫起始事件失败，病毒持续存在和复制。

尽管我们的研究清楚地表明N的表达会导致程序性细胞死亡，但死亡程序的近端启动子仍有待确定。此外，我们观察到的细胞死亡是组织类型特异性的。我们无法在上皮细胞系的人肝癌细胞中检测到显著的细胞死亡。然而，我们不能排除这样的可能性，即观察到的HuH7细胞的应激耐受性是该特定细胞系的特异性，而不是组织特异性，因为COS-1细胞和Huh7细胞的转化机制不同，因此可能是由于这两个细胞系中不同调控网络的放松，导致最终反应的改变。在N表达过程中识别这两种细胞系中的差异调节因子可能为解决与病毒感染相关的问题提供线索。此外，识别COS-1细胞凋亡的上游效应器将揭示触发细胞死亡的机制。这些方向的未来工作将帮助我们评估N蛋白在诱导凋亡中的特定作用，并将其分为宿主反应或因N表达的细胞病变效应而产生的反应。沿着这些路线进行的研究为设计治疗方法以减轻SARS病毒感染早期的组织损伤提供了巨大的希望。

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