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神经科学杂志。2007年1月3日；27(1): 84–92.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.4385-2007年6月
预防性维修识别码：PMC6672296型
PMID：17202475

冬眠中突触蛋白的动态变化

克里斯蒂娜·冯·德·奥赫,通讯作者1 克雷格·C·加纳,三 科琳娜·达里安·史密斯,2和H.克雷格·海勒1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

冬眠哺乳动物的神经元在休眠期间表现出一种戏剧性的可塑性，随着体温降低，树突树干收缩，然后随着体温升高迅速再生。在这项研究中，我们使用免疫组织化学成像和几个突触前和突触后蛋白的免疫印迹来确定伴随迟钝的突触变化，并研究这些变化背后的机制。我们发现，突触蛋白定位中的迟钝相关改变以温度依赖的方式快速、均匀地发生在大脑的几个区域。突触前和突触后标记物共定位程度的变化表明，进入迟钝状态与50-65%的突触丢失有关。我们还表明，在进入迟钝状态期间发生的突触蛋白簇的丢失不能归因于蛋白质丢失。这些发现表明，突触中与迟钝相关的变化源于蛋白质从细胞骨架活性区和突触后密度中分离出来，从而形成了一个蛋白质库，可以在恢复到恒温状态期间迅速动员起来，用于树突棘和突触的快速重建。基于蛋白质分解而非蛋白质分解的神经可塑性机制可以解释冬眠动物大范围、快速和重复微观结构变化的能力，与以蛋白质分解和细胞死亡为主的神经病理学形成了鲜明对比。

关键词：突触、蛋白质、冬眠、迟钝、温度、可塑性

介绍

冬眠哺乳动物能够在体温反复下降到接近冰点的极端情况下生存下来(斯特伦瓦瑟，1959年;王，1973;巴恩斯，1989年). 在深度睡眠期间，大脑中的神经活动实际上停止了(斯特伦瓦瑟，1959年;施塔克，1970年;Walker等人，1977年). 组织温度和神经活动的这些急剧变化与神经元微观结构的变化相平行，其中观察到细胞体面积、树突树干复杂性和脊椎密度的变化(波波夫等人，1992年;von der Ohe等人，2006年). 海马多唾液酸化神经细胞粘附分子、突触素和微管相关蛋白2（MAP2）的免疫组织化学分析显示，扭转相关的神经变化也在分子水平上得到证实(Arendt等人，2003年). 这些研究表明，冬眠哺乳动物的大脑是一种快速可逆的神经可塑性模型，其变化速度是自然界中最剧烈的变化之一，尤其是在成年哺乳动物中。冬眠动物有望成为成人大脑中神经重构的信息模型，有可能提高我们对低温、学习记忆和神经退化等过程的理解。为了测试冬眠动物对这些问题的解释能力，我们研究了温度对睡眠相关突触可塑性的影响、睡眠中突触丢失的程度以及突触蛋白丢失的机制。

在本研究中，我们通过分析几种突触前和突触后蛋白在突触失过程中的变化，研究了与突触失相关的突触蛋白定位和组成变化的动力学。为了证实突触蛋白动力学反映了我们所报道的树突状乔木和棘在冬眠期间的变化(von der Ohe等人，2006年)，我们评估了突触变化是否在不同的大脑区域发生类似的变化，以及它们是否以温度依赖的方式发生。为了确定唤醒过程中发生的突触重构程度，我们研究了突触蛋白免疫反应的变化与突触数量的关系，突触前和突触后标记物的共定位率定义了突触数量。我们还评估了免疫组织化学显示的突触蛋白簇的丢失是否归因于蛋白质的丢失或离散点状突起中蛋白质的分离。我们表明，冬眠动物的神经可塑性是温度的函数，似乎是蛋白质从突触快速分离的结果。这种突触蛋白池在休眠期的存在可能解释了树突棘和突触的快速重建，这种重建发生在返回到恒温期。

材料和方法

动物。

所有程序均经斯坦福大学机构动物护理和使用委员会批准。金毛地松鼠(加利福尼亚金背黄鼠)被困在加利福尼亚州内华达山脉（获得加利福尼亚州渔猎部的许可）。为了精确监测麻痹发作，动物被植入腹部温度遥测仪（Mini-Mitter、Bend、OR）。这些20毫米的装置不会干扰动物的行为或健康。在冬季，环境温度降至5°C，照明变为恒定、暗淡的红光。这些条件允许所有动物冬眠。随后，将2月份的环境温度提高到15°C，然后再次降低到5°C。对每只动物的体温进行远程监测，以评估其迟钝的长度。所有动物在被杀前至少完成了两次完全的麻痹。

实验设计。

免疫组化研究使用了七个实验组，每组六只动物。其中五组在5°C下冬眠，其中两组在被杀前在15°C冬眠。在5°C下，各组分别在入睡后1、3和6天，以及唤醒诱导后2和12小时。这些时间点对应于该温度下迟钝和间歇恒温的开始和结束。进入睡眠状态被定义为体温下降到34°C以下。通过2分钟的轻柔处理，可在～2小时内将动物完全唤醒至34°C以上。对于处于该温度下的两个恒温组动物，在休眠6天时诱导唤醒，以确保恒温组中的所有动物在该周期内处于休眠状态的时间相同。两组动物在15°C下冬眠，分别是入睡后3d和唤醒诱导后12h。对于15°C的恒温组，在昏睡的第3天诱导觉醒，这是该温度下的近似昏睡长度。

免疫组织化学。

在昏睡比赛的特定时间收集脑组织(n个=每组6只动物）。将动物从笼子中取出，用氟烷深度麻醉1分钟，然后用肝素化PBS经心脏灌注，然后用pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛杀死动物。将大脑在同一固定液中取出并固定6-7小时，然后转移到PBS。在冷PBS中的振动棒上切割100μm冠状切片。切片取自大脑的两个区域：（1）丘脑前部，包括网状核和体感皮层，以及（2）丘脑后部，包括腹后丘脑和海马。从动物的同一区域切下切片。组织保存在4°C下PBS中4%的多聚甲醛中，直到免疫组织化学处理，约1周后进行。用PBS和0.1%Triton X-100冲洗游离切片四次，持续5分钟，用3%山羊血清封闭，在4°C的一级抗体中孵育过夜，并用二级抗体再孵育1小时。切片用Vectashield（Vector Laboratories，Burlingame，CA）固定在预处理的载玻片上。将载玻片平放在4°C下，直至成像，约1-2周后。对Piccolo和突触后密度95（PSD95）进行双重标记（见下文，使用抗体）。

切片在横山旋转圆盘共焦显微镜上成像，并使用Openlab 3.5.1软件（加州普莱森顿科学软件公司）进行分析。在63倍下拍摄图像，在图像采集期间保持所有曝光设置不变。三个625微米2在每张图片上画出方块。测量每个方块中的三个参数：（1）荧光强度，它估计方块中表达的突触蛋白分子的数量，（2）离散点的数量，以及（3）蛋白质簇覆盖的方块的比例。通过滑动强度条删除荧光背景水平后，测量点状突起的数量和蛋白质簇覆盖的面积，以便只保留离散的点状突触。在不减去背景的情况下测量荧光强度，以确定切片中的总荧光是否随条件变化。对于双标签图像，对50个随机选择的点子进行重叠分析。在所有分析中，研究者对动物的实验组视而不见。我们分析了未应用初级抗体的恒温动物和冬眠动物的切片，发现这两组动物的自然荧光没有差异。

使用抗体。

除非另有规定，否则本研究中使用了以下一级和二级抗体：MAP2（兔子，1:2000；克雷格·加纳，斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福）；短笛（兔子，1:500；克雷格·加纳）；PSD95（小鼠05-494，1:100；马萨诸塞州贝德福德Millipore）；突触素（小鼠VAM-SV011E，1:100；Stressgen Biotechnologies，加拿大不列颠哥伦比亚省维多利亚市）；和山羊抗兔Alexa 568、山羊抗鼠Alexa 588和山羊抗鼠Alexa 488（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）。对对照品进行了测试，以确保交叉反应性最小。结果中给出了选择所研究蛋白质的基本原理。

定量Western blot。

两组在5°C冬眠的动物在唤醒后12小时或进入休眠后1天被快速斩首处死(n个=每组3只动物）。立即取出大脑，在液氮中快速冷冻，并储存在−80°C下。随后，将包含体感皮层、海马体和丘脑的大脑切片在缓冲区[40 m米Tris，pH 7.5，0.3米蔗糖，1.6 mg/ml蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏应用科学公司，印第安纳波利斯），5 m米EDTA和磷酸酶抑制剂：1 m米氟化钠，1米米钼酸钠，1 m米酒石酸钠，1 m米纳三VO（旁白）4，100牛顿米氰戊菊酯和250 n米冈田酸（西格玛，密苏里州圣路易斯）（组织与缓冲液的比例，1:20）]。离心后（1000×克，15 min，4°C），收集上清液，并保存几个等分样品以分析全脑蛋白质含量。将剩余上清液与颗粒洗涤液中的额外上清液结合，以17300×克使用固定的50.2 Ti Beckman Coulter（加利福尼亚州富勒顿）转子（4°C），持续20分钟。将得到的颗粒轻轻地重新悬浮在6ml均质缓冲液中，装入从上到下堆叠的不连续蔗糖梯度中，其中7 ml为0.8、1.0和1.2米蔗糖溶液，在85000×克2小时（4°C），使用SW-28摆动式铲斗转子。1.0/1.2处的突触体层米收集、鉴定蔗糖界面，并将其储存在−80°C下。

使用Bradford试验测定蛋白质浓度。蛋白质提取物在4–12%Bis-Tris凝胶（用于分析突触素和MAP2）或3–8%Tris-醋酸盐凝胶（用于Piccolo和PSD95）（Invitrogen NuPAGE Novex凝胶）上分离。在每个孔中，装载50μg全脑蛋白或4μg突触体蛋白。随后，将蛋白质转移到硝化纤维素膜上（Hybond ECL；Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）。在TBS中清洗膜，在含有5%牛奶的TBS中封闭膜，并用兔抗MAP2（1:1500）、兔抗Piccolo（1:1000）、鼠抗PSD95（1:2000）和鼠抗突触素（1:4000）进行探测。用荧光缀合的山羊抗兔（Alexa Fluor 680，1:30000；Invitrogen）或山羊抗小鼠二级抗体（IRDye 800，1:5000；Rockland Immunocchemicals，Gilbertsville，PA）检测结合的一级抗体。然后使用奥德赛成像系统（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE）检测并分析免疫荧光。将所有动物的样品放在每个凝胶上，并将凝胶复制三到五次。将蛋白质浓度为一半和两倍的对照孔加载到每个凝胶上，以确保所有蛋白质条带的强度都在检测的线性范围内。

统计。

用方差分析比较免疫组化结果的组平均值(n个=每组6只动物）。A类事后（post-hoc）使用费希尔最小显著性差异法对多重比较进行修正。定量Western blot分析使用双尾t吨测试(n个=每组3只动物）。Western blot条带强度的精确度为±3%（SEM）。

结果

在四个大脑区域中，与扭转相关的突触蛋白簇丢失类似

我们研究了松鼠大脑四个区域中几种突触蛋白的免疫组织化学变化：体感皮层的皮层第4层、体感丘脑腹后中继核、丘脑网状核和海马CA3层。先前在海马CA3区观察到了麻痹状态下突触蛋白免疫反应的变化(Arendt等人，2003年). 我们调查了这些变化是否是更为全球性现象的一部分。

我们分析了四种蛋白质（MAP2、Piccolo、PSD95和突触素）中与迟钝相关的动态变化。MAP2是一种连接树突状微管的结构蛋白(Garner等人，1988年)并提供有关树状乔木状态的信息。Piccolo和突触素提供了有关突触前结构状况的信息：Piccola是突触前活动区的核心细胞基质蛋白(Cases-Langhoff等人，1996年)突触素是突触前囊泡糖蛋白(维登曼和弗兰克，1985年). PSD95是一种突触后密度蛋白，对谷氨酸受体的运输和稳定至关重要(Kornau等人，1995年)并提供有关突触后结构状况的信息。

为了比较上述大脑区域中突触蛋白簇的迟钝相关变化，我们使用了两组动物。第一组在5°C的温度下进行6天的静息训练，第二组在唤醒至恒温12小时后被处死。大脑四个区域的典型免疫组织化学图像如图1A类.

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免疫组织化学染色的样本图像。对冠状脑切片进行免疫染色，并用共焦显微镜成像。A类，显示的四种蛋白质是MAP2、Piccolo、PSD95和突触素。图像来自四个区域：海马CA3层、丘脑网状核、丘脑腹后核和体感皮层第4层。免疫组织化学染色来自唤醒诱导12小时后的恒温动物（顶行）和冬眠6天后的休眠动物（底行）。比例尺，10μm。B类,C类，来自海马体的MAP2染色的放大图像如下所示，用于一只吸热动物(B类)还有一只冬眠的动物(C类).

所有四个区域都显示出突触蛋白簇所覆盖的区域出现了与迟钝相关的减少，如图2(第页除丘脑腹后区的突触素和大脑皮层和腹后区丘脑的Piccolo外，晚期正常体温和晚期睡眠之间的所有比较均<0.05。这四个地区的下降幅度相似，这是由两个下降幅度决定的(第页>所有比较均为0.05）(图2)和百分比下降(第页>所有比较均为0.05）(图3)点状覆盖。这些发现表明，松鼠大脑中与迟钝相关的结构变化也以类似的方式发生。

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突触蛋白聚集变化的时间进程。A–D，MAP2显示了蛋白质簇覆盖区域的扭转相关动力学(A类)、短笛(B类)，PSD95(C类)和突触素(D类)（平均值+SEM；n个= 6).E类，所调查的时间点对应于迟钝周期中的特定时间。平均值来自被调查的四个区域的图像：第4层体感皮层、腹后（VP）丘脑、丘脑网状（RT）核和海马CA3（见图例）。突触蛋白聚集在第1天进入阶段显著降低(第页所有区域的MAP2、丘脑网状核的Piccolo、皮质、丘脑和海马的PSD95以及海马的突触素均<0.05）。在这段时间之后，这些蛋白质中任何一个区域在迟钝状态下的点状覆盖都不会减少。50%以上的恢复发生在2小时的唤醒窗口中，所有区域的MAP2和丘脑网状核的PSD95显著增加（α=0.05）。

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突触蛋白动力学的温度依赖性。A类在5°C和15°C冬眠动物的体温曲线图中，用箭头指示实验组，以比较温度对突触蛋白聚集的影响。MAP2显示了突触蛋白簇覆盖的区域与静止体温的关系(B类)、短笛(C类)，PSD95(D类)和突触素(E类)（平均值+SEM；n个= 6). 平均值来自被调查的四个区域的图像：第4层体感皮层、腹后（VP）丘脑、丘脑网状（RT）核和海马CA3（见图例）。大脑区域中与睡眠相关的下降斜率相似(第页=0.495），以及在所研究的蛋白质中(第页= 0.518).

我们分析了突触蛋白簇覆盖面积的迟钝相关减少是否主要归因于泪点数量或这些泪点大小的变化。对于所分析的三种点状蛋白（Piccolo、PSD95和突触素），所有大脑区域的点状点数量和大小都在休眠状态下减少。突触素（皮质，第页= 0.002; 丘脑腹后，第页= 0.016; 丘脑网状核，第页= 0.004; 海马体，第页=0.011）和PSD95（皮层，第页= 0.015; 丘脑腹后，第页= 0.039). 因此，突触蛋白簇所覆盖区域的麻痹相关丢失似乎是由于单个突触点的蛋白质丢失所致。

突触蛋白簇随体温变化的扭曲相关变化

我们通过检查动物在5°C下5个不同时间点的免疫组织化学图像，研究了突触蛋白簇中与迟钝相关的变化的时间进程：进入迟钝后的1、3和6天，以及唤醒诱导后的2和12小时。这些时间点对应着冬眠和间歇安乐死的开始和结束：一只在5°C冬眠的金毛地松鼠的冬眠周期包括1天的进入阶段、在～7°C的体温下5至7天的深度冬眠间隔、2小时的自发返回安乐死和8至12小时的间歇安乐死生间隔，然后是迟钝的重返大气层。中提供了冬眠松鼠的体温图样本图2E类.

突触蛋白簇所覆盖区域中与迟钝相关的变化的时间过程如所示图2。大多数减少发生在第1天，这一发现在所调查的大脑区域中也是一致的。在第1天，所有区域的MAP2、丘脑网状核中的Piccolo、皮层、丘脑网核和海马中的PSD95以及海马中的突触素的下降都具有统计学意义（α=0.05）。进入迟钝状态后，在深度迟钝的几天内，没有出现统计上显著的变化。总的来说，睡眠状态下的突触蛋白免疫反应性比正常状态下低37-55%；突触素在恒温条件下下降的百分比最大，而短笛霉素下降的百分比最小。我们的结论是，随着大脑在进入睡眠状态期间冷却，而不是在低温下持续几天逐渐冷却，突触蛋白簇会显著丢失。

突触蛋白聚集的大部分恢复发生在短暂的2小时唤醒窗口内，在整个大脑区域进行。这种增加在所有区域的MAP2和丘脑网状核的PSD95中达到了统计学意义。2 h的恢复范围为突触素的52%和MAP2的86%。由于迟钝值远低于恒温值，因此要在2小时内实现大部分恢复需要较高的增长率。例如，MAP2的量在2小时的唤醒窗口中几乎翻了一番。我们得出的结论是，当身体在觉醒过程中变暖时，大部分突触蛋白从睡眠中恢复过来。

蛋白质簇随最低静止体温线性减少

睡眠期间的环境温度决定了最低体温(斯特伦瓦瑟，1959年). 最低体温反过来又决定了许多生理和行为参数，包括麻木时间(Buck和Barnes，2000年)和神经活动(Krilowicz等人，1988年). 冬眠期间的环境温度也会影响神经结构在睡眠期间的可塑性程度(von der Ohe等人，2006年). 在这个实验中，我们评估了冬眠时突触蛋白簇的可塑性是否也依赖于温度。

我们分析了动物在5°C和15°C温度下3 d至1周的免疫组织化学图像(图3A类)评估蛋白质簇覆盖区域是否存在温度依赖性差异。在所有四个大脑区域中，蛋白质聚集呈温度依赖性趋势：5°C冬眠动物的突触蛋白热点所覆盖的区域始终低于15°C冬睡动物的突触蛋白热点所涵盖的区域(图3). 通过分析安乐死后免疫反应性下降的百分比与昏睡体温的关系，得出了一个线性关系(第页<0.05，用于所研究的每个蛋白质和大脑区域的线性回归），如所示图3对蛋白质和大脑区域中与睡眠相关的下降斜率的分析表明，蛋白质之间没有差异(第页=0.518），以及大脑区域之间(第页= 0.495). 我们的结论是，突触聚集随着温度的升高而线性减少，其速度在所有被研究的蛋白质和大脑区域中都是相似的。

为了评估突触蛋白簇覆盖的区域是否恢复到固定值，无论之前的昏睡发作中点状缺失的程度如何，我们在唤醒后12小时比较了5和15°C组的免疫荧光。这两组动物在所有突触蛋白和所有分析的大脑区域之间没有显著差异（α=0.05）。这一发现表明存在一种机制，它决定了从迟钝状态恢复过程中的最终突触蛋白密度。

抽搐相关的突触前和突触后点状突起丢失

我们研究了突触蛋白簇的缺失是否会影响突触数量，这是由突触前和突触后蛋白点的共定位所定义的。我们对两组动物进行了分析：第一组动物在5°C的温度下被杀死6天，进入一场昏睡状态，第二组动物在唤醒至常温12小时后被杀死。用突触前蛋白Piccolo和突触后蛋白PSD95对上述四个脑区的切片进行双重标记。与温热动物相比，温热动物的可乐状斑点减少了50-65%(第页<0.001适用于所有地区），如所示图4.

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突触前和突触后蛋白质的克隆。使用Piccolo和PSD95进行双重标记。分别显示这些蛋白质中每一种的染色图像，并对在5°C下冬眠的温热动物（唤醒诱导后12小时）和迟钝动物（进入迟钝状态后6天）进行分类。被colabeled的泪点的百分比显示在右边（平均值+SEM；n个= 6). 这些图像和图形来自被调查的四个区域：第4层体感皮层、腹后（VP）丘脑、丘脑网状（RT）核和海马CA3。比例尺，1μm*第页<0.005，统计学上显著下降。

我们测试了是否仅仅是Piccolo和PSD95 punta数量的停滞相关减少就可以解释这种带有可乐标签的punta的大幅减少，或者可乐标签punta是否是针对性的。对旋转90°的PSD95图像重复相同的分析，而Piccolo图像保持其原始方向。该分析确保突触前和突触后点状突起在功能上无关，从而可以分析随机重叠的交叉点状突触中与迟钝相关的百分比减少。有26%的随机标记的点状突起消失，这表明迟钝会导致突触显著消失。

突触蛋白免疫荧光的总水平不随迟钝而改变

我们分析了突触蛋白簇覆盖区域的丢失是否归因于迟钝动物切片中免疫荧光的整体丢失。免疫荧光簇覆盖面积的测量是在减去免疫荧光的背景水平后进行的，免疫荧光的背景水平留下了被认为对应于突触的离散荧光热点。当我们在不减去免疫荧光背景水平的情况下分析免疫荧光强度时，我们发现恒温动物和冬眠动物之间没有差异(表1)，表明荧光的总体水平，以及这些突触蛋白的总量，在这些组之间没有变化。这些数据加上在休眠期间离散蛋白簇覆盖的区域的丢失，表明Piccolo、PSD95和突触素在恒温期间从点状或突触组织转变为在休眠期间更分散的非突触蛋白池。MAP2（一种非突触蛋白）的分布在睡眠期间也发生了显著变化，如图1.MAP2在恒温动物中从有组织的丝状模式转变(图1B类)变成麻木动物的点状和不太有组织的图案(图1C类). 这些蛋白质分布的改变可能导致冬眠期间高强度免疫荧光的丧失。

表1。

免疫组织化学图像的荧光强度

恒温休眠
地图21577.06 ± 203.531518.22 ± 169.66
短笛1233.39 ± 131.871181.89 ± 137.66
PSD95型1728.56 ± 200.901870.78 ± 191.83
突触素1072.22 ± 95.871151.17 ± 82.56

免疫组织化学图像的荧光强度，不减去荧光背景水平。平均值±SEM来自六只恒温动物（唤醒后12小时）和六只冬眠动物（进入休眠后6天）。研究的蛋白质包括MAP2、Piccolo、PSD95和突触素。荧光强度从三个625μm平均2每组六只动物的每幅图像的正方形。

与Torpor相关的突触蛋白簇损失不能归因于蛋白质损失

为了证实突触蛋白簇在进入睡眠状态期间的丢失不能归因于进入睡眠状态时的净蛋白丢失，我们在动物进入睡眠状态的第1天，在5°C和唤醒后12小时，对MAP2、Piccolo、PSD95和突触素进行了定量Western blot。对含有全脑蛋白和突触体蛋白的组分进行独立分析。此外，还分析了MAP2的分解产物，以确定进入休眠期时蛋白水解过程是否活跃。

在全脑和突触体组分中，这些蛋白质的主带蛋白浓度没有发现显著差异，如图5(第页>所有比较均为0.05）。这表明免疫组化显示的突触蛋白簇的丢失不能归因于净蛋白丢失。

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蛋白质的蛋白质印迹。显示了来自突触体和整个大脑部分的蛋白质条带。印迹由四种蛋白质组成：MAP2、Piccolo、PSD95和突触素。前三条谱带来自于吸热动物（唤醒后12小时），后三条谱带来自于冬眠动物（进入冬眠状态后1天）。蛋白质阶梯显示在最左边。每套印迹的右侧是三种凝胶（平均值+扫描电镜）中恒温动物和冬眠动物带的归一化强度值图。对于MAP2，显示了主频带（MB）的数据以及180 kDa时的击穿产物（BP）*第页<0.05，冬眠动物与恒温动物的差异具有统计学意义。

为了确定进入休眠期时是否发生蛋白水解，我们分析了170、180和200 kDa下的三种MAP2分解产物。这些分解产物的增加表明，蛋白质水解过程在进入休眠期时是活跃的，尽管这可以通过蛋白质合成来平衡，因为主带强度保持不变。三种MAP2分解产物中的每一种在突触体部分进入休眠期时都显示出10-20%的密度增加(第页所有三种分解产品均<0.05）。在全脑部分中，分解产物增加了5-10%的趋势，但这并没有达到统计显著性。为了解释主带密度的微小差异，我们分析了击穿产物与主带密度之比，发现在所有三种击穿产物的突触体部分中，这一比率显著增加了5-15%(第页<0.05（每个分解产品）。全脑蛋白质组分中这一比率与睡眠相关的增加没有达到统计学意义。我们得出的结论是，在进入迟钝期的部分时间内，蛋白质继续分解，但通过蛋白质合成进行平衡，导致没有蛋白质净损失。

讨论

我们的发现增强了我们对冬眠动物作为成人神经可塑性模型的理解。我们发现，突触蛋白簇覆盖的区域在不同的大脑区域中的变化幅度相似，突触前和突触后结构中的变化也类似，这表明这种现象普遍存在于大脑中。我们的研究表明，这些变化是以温度依赖的方式发生的，在较低的冬眠温度下，突触蛋白簇的损失更大。我们证明了在昏睡期间，突触蛋白共簇的丢失，这不仅意味着突触的丢失，而且意味着每次从昏睡中醒来都需要对神经连接进行大规模重组。最后，我们表明，进入迟钝状态期间发生的突触蛋白簇的丢失并不是由于蛋白质降解。我们的结果表明，突触蛋白在进入睡眠状态时从突触分离到轴突、胞体或树突，在睡眠发作期间保持这种状态，然后在从睡眠中唤醒时迅速重新组装。

我们的发现表明，在昏睡期间，突触群聚的丢失是一种全球性现象，这表明一个共同的触发因素在整个大脑中起作用。这种常见的触发因素可能是温度。我们的数据表明，突触蛋白聚集紧密跟踪体温，这与Arendt等人（2003）欧洲地松鼠。我们还表明，点刺覆盖范围的丧失程度取决于睡眠期间的最低体温。总之，这些发现强烈地表明了一个温度驱动的模型。温度可能直接通过某种未知机制或间接通过温度依赖性树突回缩引起突触蛋白的解离von der Ohe等人（2006年）支持间接机制存在的证据来自一项急性海马切片制备的研究，在该研究中，冷却导致树突中出现浮动的突触后密度(基洛夫等人，2004年). 因此，冷却引起的微观结构变化可能会导致突触蛋白移位。这项研究的一个应用领域是人体低温损伤。从体温过低中恢复的患者已被证明患有认知障碍(Walpoth等人，1997年). 我们的结果表明，这些损伤可能是温度依赖性神经连接丧失的结果，这突出表明需要在这一领域进行研究。

本文提供的数据表明，在迟钝过程中突触蛋白簇的广泛损失并不是由于这些蛋白质的损失造成的。相反，这似乎归因于蛋白质从突触分离到轴突、树突或细胞体的机制。这一结论是基于免疫组织化学和蛋白质印迹分析的结果。首先，尽管失去了蛋白质簇覆盖的区域，但在温热动物和迟钝动物之间，整体免疫荧光强度没有差异。这表明这些蛋白质在休眠期间仍然存在，但不再组织成簇。这些变化可以在免疫组织化学图像中看到，在这些图像中，麻木动物表现出点状蛋白的背景染色增加，MAP2的丝状组织丢失。其次，所有四种蛋白质的蛋白质印迹表明，它们的浓度不会随着进入休眠期而改变。虽然来自MAP2分解产物分析的数据表明，蛋白质水解过程在进入阶段的某些部分继续活跃，但蛋白质分解似乎通过蛋白质合成来平衡，因为主要蛋白质的浓度保持不变。因此，这些蛋白质似乎在休眠期间仍然存在，但它们具有不同的、不太聚集的组织。

据我们所知，一个基于蛋白质分离的大规模神经收缩和突触丢失模型之前还没有得到证实。其他突触可塑性模型通常涉及通过蛋白质体或溶酶体降解对大蛋白复合物的调节性分解(DiAntonio等人，2001年;Burbea等人，2002年;Watts等人，2003年). 选择的突触蛋白确实存在于神经元的移动池中，并且在突触组装过程中可用，尽管还不知道这些蛋白是否被合成从头开始或从其他突触重新激活。例如，在轴突中，通过含有一些突触囊泡蛋白和活性区成分（包括Piccolo、Bassoon和N-cadherin）的移动运输包，预先组装的突触成分被快速招募到突触(Ahmari等人，2000年;翟等，2001). 在树突中，PSD95簇和AMPA受体都可以从弥漫的细胞质池中招募(Bresler等人，2001年;Marrs等人，2001年;Borgdorff和Choquet，2002年)和NMDA受体亚单位存在于离散的树突状转运包中(Washbourne等人，2002年). 类似的非突触池也有助于成熟突触中突触蛋白的动态交换率(Tsuriel等人，2006年). 然而，以前从未有人证明突触蛋白可以快速重复地分解和重组，从而引起大规模的微观结构和突触变化。

这些离解的突触蛋白可能是从睡眠中唤醒时重建突触的储存库。这一发现可以解释恢复过程的速度，其中大部分发生在恢复到常温的2小时内。此外，蛋白质水解和蛋白质合成不是冬眠时神经可塑性的主要机制，这一事实与已知的冬眠能量需求一致。冬眠是一种能量利用率极低的状态(汉弗莱斯等人，2003年); 因此，不必惊讶的是，冬眠动物可以在不需要耗费能量的蛋白质分解和蛋白质合成过程的情况下，完成重复的大规模神经结构改变。基于蛋白质分解而非蛋白质分解的神经可塑性机制可以解释冬眠动物快速有效的微观结构变化的能力。

这一发现表明，在迟钝状态下，突触连接的丧失不能归因于蛋白质的丢失，这一过程不是退化或细胞应激途径的结果。尽管经历程序性细胞死亡的神经元表现出与冬眠期神经元相似的树突收缩(Nuydens等人，1997年;佩纳和皮拉尔，2000年)，细胞死亡过程与多种蛋白质分解途径的激活有关(Chan和Mattson，1999年). 这些途径中的一些导致结构蛋白的分解，可能导致细胞骨架紊乱和某些退化条件下的功能丧失（有关综述，请参阅王2000). 目前的研究揭示了一种机制，将冬眠动物的神经变化与神经病理学中的神经变化区分开来，在神经病理学上，蛋白质分解和细胞死亡似乎是不可逆的过程。了解可逆蛋白质解离的机制可以为神经退行性疾病的潜在治疗干预提供见解。

我们的研究结果表明，冬眠时的神经可塑性导致明显的突触显著丢失，可能导致每次从休眠中唤醒时，神经连接发生大规模重组。这些发现可能会为以往关于冬眠长期记忆的研究提供线索。与不冬眠的松鼠相比，冬眠的地松鼠在海马依赖性记忆任务中表现出降低的表现(Millesi等人，2001年). 地松鼠在冬眠后也表现出识别以前熟悉的松鼠的能力减弱，尽管它们仍然能够识别同窝的松鼠(马特奥和约翰斯顿，2000年). 与冬眠有关的记忆丧失可能与大规模的神经改变有关。这表明突触簇迅速恢复到一组固定值并不一定意味着突触中的所有类型的信息都会被保留。这里显示的突触的温度依赖性丢失为研究记忆存储在哪里以及如何存储、哪种类型的记忆对结构丢失最敏感，以及突触连接是否可以恢复到以前的配置打开了大门。

总之，我们已经表明，冬眠动物所表现出的巨大而广泛的神经可塑性是突触蛋白质从突触中分离出来的结果，这些蛋白质可能是这些突触快速高效重建的储存库。我们还证明，这种神经可塑性模型可以通过改变环境温度进行操纵，从而导致在速度和幅度上都很大的可预测的突触丢失程度。我们的研究结果提高了我们对冬眠期成人神经可塑性的理解，并促进了该模型系统在学习低温、学习记忆和神经退化等过程中的潜在应用。

脚注

这项工作得到了综合与比较生物学学会和国家卫生研究院拨款R21 NS051128-01A1的支持。我们感谢F.Fernandez、V.Torres和M.Grole对蛋白质印迹和免疫组织化学的帮助；M.Lopez执行遥测植入手术；N.Ruby、S.Ortiz、C.Specht和C.Brüderle提供技术援助；R.Sapolsky、R.Fernald、P.Bourgin和P.Gratzinger批判性阅读本手稿；以及许多同事的建议和讨论。

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