《美国病理学杂志》。2017年8月；187(8): 1700–1716.
AKT过度激活和AKT靶向治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的潜力
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王金芬
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
†中国山西省山西省肿瘤医院病理科
子君Y.Xu-Monette
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
考萨尔·贾巴尔
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
戚慎
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
Ganiraju C.Manyam公司
‡德克萨斯大学生物信息学和计算生物学系，德克萨斯州休斯顿MD安德森癌症中心
王静（音译）
‡德克萨斯大学生物信息学和计算生物学系，德克萨斯州休斯顿MD安德森癌症中心
圣地亚哥蒙特斯-莫雷诺
‖西班牙桑坦德马尔克斯瓦尔德西拉大学医院病理科
戈文德·巴加特
‡‡哥伦比亚大学医学中心和纽约长老会医院病理和细胞生物学系
埃里克·D·西
§§俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所病理科
J.Han van Krieken先生
¶¶荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅根医学中心病理学系
Shi Wang先生
∗∗∗新加坡国立大学医院病理科
米盖尔·皮利斯
‖西班牙桑坦德马尔克斯瓦尔德西拉大学医院病理科
L.杰弗里·梅德罗斯
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
李勇
‡‡‡俄亥俄州克利夫兰勒纳研究所克利夫兰诊所癌症生物学系
兰·V·范
∗得克萨斯州休斯顿得克萨斯大学MD安德森癌症中心血液病理学系
肯·H·杨
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
§§§德克萨斯大学医学院，生物医学科学研究生院，德克萨斯州休斯顿
∗德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心血液病理学系，德克萨斯州休斯顿
‡德克萨斯大学生物信息学和计算生物学系，德克萨斯州休斯顿MD安德森癌症中心
†中国山西省山西省肿瘤医院病理科
§瑞士巴塞尔大学医院病理科
¶意大利维琴察圣博托罗医院血液科
‖西班牙桑坦德马尔克斯瓦尔德西拉大学医院病理科
∗∗丹麦奥尔堡奥尔堡大学医院血液科
††纽约康奈尔大学威尔医学院病理学系
‡‡哥伦比亚大学医学中心和纽约长老会医院病理和细胞生物学系
§§俄亥俄州克利夫兰克利夫兰诊所病理科
¶¶荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅根医学中心病理学系
‖‖意大利米兰圣拉斐尔科学研究所
∗∗∗新加坡国立大学医院病理科
†††丹麦欧登塞大学医院病理科
‡‡‡俄亥俄州克利夫兰勒纳研究所克利夫兰诊所癌症生物学系
§§§德克萨斯大学医学院，生物医学科学研究生院，德克萨斯州休斯顿
∗致德克萨斯大学安德森癌症中心血液病理学系Ken H.Young，医学博士，博士的通信，地址：1515 Holcombe Blvd.，Houston，TX 77030-4009。血液病理学系德克萨斯大学安德森癌症中心1515 Holcombe Blvd.Houston TX77030-4009gro.nosrednadm@gnuoyhk 版权©2017美国病理研究学会。爱思唯尔公司出版。保留所有权利。 摘要
AKT信号通路对肿瘤细胞的增殖和生存至关重要。AKT激活在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的临床意义尚未得到很好的分析。在此，我们评估了522例DLBCL患者磷酸化AKT（p-AKT）的表达。我们发现，在24.3%的研究队列中观察到高水平的p-AKT核表达与显著较差的无进展生存率以及Myc和Bcl-2过度表达相关。然而，多变量分析表明AKT过度激活不是一个独立的因素。miRNA谱分析表明，在p-AKT核高表达和低表达的DLBCL中，63个直接或间接与磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/雷帕霉素途径的机械靶点相关的miRNA表达存在差异。我们进一步在26个具有代表性的DLBCL细胞系中使用高选择性AKT抑制剂MK-2206靶向AKT信号，并使用反向蛋白阵列描绘信号改变。MK-2206治疗抑制淋巴瘤细胞活性，且MK-2207敏感性与DLBCL细胞中AKT激活状态相关。在MK-2206治疗中，p-AKT水平和AKT信号下游靶点显著降低，可能是因为反馈抑制减少；还诱导了Rictor和磷脂酰肌醇3-激酶的表达及其他代偿途径。本研究证明了DLBCL中AKT过度激活的临床和治疗意义，并建议AKT抑制剂需要与DLBCL的其他靶向药物结合，以实现最佳临床疗效。
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的B细胞淋巴瘤类型。DLBCL患者具有高度可变的临床表现和结果，最可能的解释是多种致癌途径的激活。1，2根据基因表达谱（GEP）或替代免疫组织化学算法，大多数DLBCL病例可分为两个主要的原细胞亚型：预后良好的生发中心类B细胞（GCB）和预后不良的活化类B细胞。1，三，4然而，即使在这两组患者中，也存在很大的预后和分子异质性。
丝氨酸苏氨酸蛋白激酶AKT（别名蛋白激酶B）在许多癌症的细胞生长和生存中起着重要作用。AKT有三种亚型（AKT1、AKT2和AKT3），由三种不同的基因以不同的表达模式编码。5，6在激活过程中，AKT通过磷脂酰肌醇三磷酸与其蛋白同源性（PH）结构域的结合被招募到细胞膜上[这是一个由磷脂酰肌糖3-激酶（PI3K）促进并由磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）负调控的过程]，7导致构象变化，促进Thr的磷酸化（激活）308PDK1和Ser的残留物473雷帕霉素复合物2的机械靶点残基[mTORC2；包括mTOR、Rictor、雷帕霉素复合体亚基LST8（mLST8）的靶点和mSin1]。6，8Ser下的磷酸化473和Thr308独立监管，其相互作用和重要性存在争议。8，9，10激活的AKT转位到细胞核并磷酸化许多靶点，导致抑制结节性硬化症复合物2（TSC2）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3b）、Bcl-2相关死亡启动子（BAD）、Bcl-2样蛋白11（Bim）和叉头盒（FOXO）蛋白和mTORC1的激活[包括mTOR、猛禽、mLST8和40kDa的脯氨酸风险Akt底物（PRAS40）、核糖体蛋白S6激酶（S6K）和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）]；这些变化反过来导致蛋白质合成、细胞周期进展和凋亡抑制。5，8AKT1的促增殖功能对于Ras和Myc过度表达引起的上皮性肿瘤的致癌转化非常重要，这依赖于mTORC1，但与p53失活和AKT的抗凋亡功能无关。11肿瘤发生后，AKT1消融和AKT的药物抑制体内通过调节细胞周期中Skp2活性（由p27介导）和凋亡（由FASL/FAS介导）导致胸腺淋巴瘤消退。12
PI3K/AKT/mTOR通路中存在许多负反馈机制，包括来自S6K和PRAS40的负反馈机制。mTORC1-抑制剂治疗可增强mTORC2活性和AKT-Ser473由于反馈抑制的减少而导致的磷酸化。类似地，在PI3K抑制或双重PI3K/mTOR抑制后，癌细胞通过参与DNA损伤、几种生长因子受体酪氨酸激酶的表达和磷酸化的上调基因进行补偿。5，8，9，13反映营养和应激状态的细胞能量电荷（ATP/AMP比率）可能在调节PI3K/AKT/mTOR轴中发挥关键作用。10有人认为，靶向AKT而不是下游mTORC1可以在抑制增殖的同时避免抗凋亡作用。11一种高度选择性和有效的变构pan-AKT抑制剂，MK-2206，可诱导胸腺淋巴瘤的消退，模拟p53的恢复，即使这些肿瘤没有AKT过度激活。12MK-2206可有效阻断AKT信号传导，但作为单一药物用于实体瘤患者的1/2期临床试验时，其抗肿瘤活性有限。6，14，15在急性髓细胞白血病患者的临床试验中，MK-2206证明其临床抗白血病活性不足，并且在最大耐受剂量下仅适度抑制AKT信号。16AKT和mTOR的双重抑制在DLBCL细胞系中产生协同抗淋巴瘤细胞毒性。17
研究表明，磷酸化AKT（p-AKT）的过度表达与一些实体瘤患者的不良预后有关18，19还有一些血液恶性肿瘤，20，21包括DLBCL。22，23，24在本研究中，我们评估了p-AKT（Ser473)表达和AKT1型在一个大队列的从头开始用R-CHOP（利妥昔单抗加环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松）治疗DLBCL。我们还将p-AKT与上游和下游生物标记物的表达相关联，并分析相关基因和miRNA表达谱。此外，我们评估了MK-2206对26个人类DLBCL细胞株的细胞毒性作用，并综合分析了两个具有代表性的DLBCL肿瘤细胞株中MK-2026治疗过程中关键信号蛋白的表达变化和翻译后修饰。
材料和方法
免疫组织化学分析
在福尔马林固定石蜡包埋组织微阵列上进行免疫组织化学分析，以使用p-AKT（Ser473)抗体（LP18；莱卡，维斯塔，加利福尼亚州）、IL-6（诺夫斯生物制品公司，利特尔顿，科罗拉多州）、PI3K（610046；BD实验室，加利福尼亚州圣何塞市）以及上述组织微阵列上的其他生物标记物。4，25，26，27，28，29，30，31四位资深病理学家（K.J.J.、Q.S.、S.W.和K.H.Y.）独立评估免疫反应性肿瘤细胞的百分比，以5%的增量对抗原表达进行评分，一致性为99%。在多头显微镜下通过讨论解决了不一致的病例。
细胞系和AKT抑制剂在细胞系研究中的应用
DLBCL细胞系MS、DS、DBr、JM（McA）、FN、EJ、HF、HB、MZ、LR、CJ、LP、WP和RC在MD Anderson建立，并在前面进行了表征和描述。31，34Pfeifer DLBCL细胞系购自ATCC（弗吉尼亚州马纳萨斯）。DLBCL细胞系U-2932、OCI-LY19、DOHH2、Toledo、SUDHL-4、SUDHL-10、HBL-1、TMD-8、HT、OCI-L10和OCI-LY3均来自外部来源。对所有细胞系进行常规测试支原体使用Myco-Tect试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen），并在德克萨斯大学MD安德森癌症中心的特征细胞系核心设施通过短串联重复DNA指纹验证。经鉴定的细胞株储存在液氮中以备将来使用，此处所述研究中使用的所有细胞株均来自这些经鉴定的株。
AKT抑制剂MK-2206（Selleck Chemicals，Houston，TX）分别溶解在二甲基亚砜（Fisher Scientific，Hampton，NH）中至100 mmol/L和20 mmol/L.储备溶液中，使用时用培养基稀释。
细胞培养和细胞增殖测定
DLBCL细胞在37°C和5%CO中培养2RPMI-1640培养基（Gibco，ThermoFisher Scientific，Waltham，MA）中的空气，补充15%胎牛血清（Gibco100 U/mL青霉素G和100 mg/mL链霉素（CellGro）。
简单地说，细胞以每孔50000个细胞的速度接种到96个板子中，在板子中加入不同浓度的MK-2206。每口井的总体积为200μL。二甲基亚砜用作溶剂控制。使用CellTiter 96 AQ在酶联免疫吸附分析阅读器上450 nm处测量光密度尤斯孵育48小时后，使用Bio-Rad（Hercules，CA）基准微孔板读取器进行非放射性细胞增殖测定。每项分析均一式三份，平均值来自三项独立分析的结果。
Western Blot分析
使用放射免疫沉淀分析裂解缓冲液与磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物提取蛋白质。使用生物试剂盒（Bio-Rad）测定裂解产物的蛋白质浓度。用SDS-PAGE溶解等量的总蛋白（50μg），并用半干转移法转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下用封闭缓冲液封闭膜20分钟，然后与第一抗体[AKT（pan）no.4691和抗pAKT（Ser473)9271号抗体（细胞信号转导，丹佛，马萨诸塞州）；总AKT，稀释度1:1000；pAKT，稀释度1:500；肌动蛋白，稀释度1:10000（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）]在4°C下过夜。用三缓冲盐水和吐温20缓冲液（Bio-Rad）冲洗三次后，在室温下用二级抗体（羊抗兔，稀释1:2000；羊抗鼠，稀释1:10000）孵育膜1小时，然后用三缓冲液和吐温-20缓冲液进行大量冲洗。使用HyGLO快速喷雾增强化学发光系统（马萨诸塞州Holliston Denville Scientific）检测带状物。
RPPA分析
使用MD Anderson功能蛋白质组学RPPA核心的反相蛋白质阵列（RPPA）分析从DLBCL细胞系中提取的蛋白裂解物。简单地说，在24小时和48小时后，从对照组和MK-2206处理的DLBCL细胞培养物中收集蛋白裂解物。对于总蛋白裂解物的制备，去除培养基，并用含有完整蛋白酶和PhosSTOP磷酸酶抑制剂的冰镇磷酸盐缓冲盐水（德国曼海姆罗氏应用科学公司）和1 mmol/L Na清洗细胞两次三VO（旁白）4.溶解缓冲液（1%Triton X-100，50 mmol/L HEPES，pH 7.4，150 mmol/L.NaCl，1.5 mmol/L.MgCl2，1 mmol/L EGTA，100 mmol/L-NaF，10 mmol/L.NaPPi，10%甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mm醇/L钠三VO（旁白）4，并添加10μg/mL抑肽酶）。样品在冰上通过旋涡频繁混合，然后离心。蛋白裂解物的浓度调整为1μg/μL，打印5种浓度的系列稀释液，在含氮纤维素的载玻片上复制10%的样品用于质量控制（2470 Arrayer；Aushon Biosystems，Billerica，MA）（格雷斯生物实验室，本德，OR）。使用Dako细胞反应催化系统（Dako，Carpindia，CA）和二氨基联苯胺比色反应进行免疫染色。在平板扫描仪上扫描幻灯片，生成16位tiff图像。使用Array-Pro分析仪分析和量化光斑强度，以生成光斑信号强度。每个样品的相对蛋白质水平通过插入由R编写的生物信息学脚本构建的标准曲线中的每个稀释曲线来确定。所有数据点均针对蛋白质负荷进行了标准化，并转换为可用于条形图的线性值。将归一化线性值转换为log2值，然后以中位数为中心进行层次聚类分析和热图生成。热图是在集群3.0中生成的（东京大学人类基因组中心，日本东京；http://cluster2.software.informer.com/3.0上一次访问时间为2017年2月7日）。生成的热图在Treeview 3.0版中可视化(http://jtreeview.sourceforge.net，上次访问时间为2017年2月7日），并以高分辨率.bmp格式呈现。共分析了285种独特抗体和4种次级抗体阴性对照。
统计分析
使用Fisher精确或χ比较临床病理和分子特征2测试。使用Kaplan-Meier方法分析总生存率（OS）和无进展生存率（PFS），并使用对数秩检验比较各亚组之间的差异。使用Cox比例风险回归模型进行多变量分析。使用GraphPad Prism 6（GraphPad-Software，加利福尼亚州圣地亚哥）和SPSS软件版本19.0（IBM Corporation，Armonk，NY）。与的所有差异P（P）≤0.05被认为具有统计学意义。
结果
p-AKT（丝氨酸473)主要在DLBCL样本的细胞核中表达
免疫组化检测522例DLBCL中371例（71%）有核p-AKT表达（可变水平，5%至100%）。A显示代表性的p-AKT阳性染色，并且B显示了该队列中p-AKT核表达的直方图。研究患者的核p-AKT表达平均水平为33.3%。GCB和ABC亚型之间的p-AKT水平无显著差异(C） ●●●●。
磷酸化AKT（p-AKT）在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的表达及预后分析。答：p-AKT的代表性免疫组织化学（IHC）染色。B类：DLBCL队列中p-AKT免疫组织化学评分直方图。抄送：DLBCL患者核p-AKT（Nuc-p-AKT）表达散点图。根据IHC分析，生发中心B细胞样（GCB）和活化B细胞样DLBCL亚型中Nuc-p-AKT表达的平均水平相似。医生：p-AKT公司高的DLBCL患者的总生存率（OS）和无进展生存率显著降低（≥70%的肿瘤细胞p-AKT核染色阳性）。电子：DLBCL患者磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）表达散点图。p-AKT高的组PI3K表达的平均水平显著高于p-AKT低的组。F–H：DLBCL患者IL-6、Myc和Bcl-2表达的IHC散点图。与p-AKT相比低的p-AKT小组高的该组的IL-6在ABC-DLBCL中的平均表达水平、Myc在GCB-DLBCL的表达水平以及Bcl-2在GCB-和ABC-DLBC中的表达水平均显著高于对照组。散点图中的每个点代表一名患者的表达水平。∗P（P） < 0.05,∗∗∗P（P） < 0.001. 原始放大倍数，×60。
细胞质p-AKT表达罕见，仅在10例DLBCL肿瘤中检测到（水平为3%至100%），包括8例同样具有100%p-AKT的患者+核表达和2例无p-AKT核表达。
p-AKT核过度表达与DLBCL患者预后不良相关
我们使用3.6.1版X tile软件（耶鲁大学医学院，纽黑文，CT）来确定与具有最大特异性和敏感性的显著预后影响相关的p-AKT过度表达的免疫组化界限。使用这种方法，p-AKT核过度表达的截止点（p-AKT高的)设定为≥70%；522名患者中127名（24.3%）患有p-AKT高的DLBCL。这些患者的PFS明显较差(P（P）=0.0027）和OS(P（P）=0.047）比其他p-AKT患者高低的DLBCL（DLBCL）(D） ●●●●。p-AKT患者的5年PFS率为45.8%高的DLBCL和61%的p-AKT患者低的DLBCL（危险比=1.54；95%CI，1.19–2.25）。p-AKT的频率高的GCB和ABC亚型之间相似。在GCB-DLBCL中，p-AKT过度表达与PFS显著降低相关(P（P）=0.015）但不是OS(P（P）=0.42）率。在ABC-DLBCL中，与p-AKT相关的不利影响高的未达到统计显著性（OS，P（P） = 0.10; PFS、，P（P） = 0.14).
p-AKT过度表达与Myc和Bcl-2过度表达相关
我们比较了p-AKT的临床和分子特征高的p-AKT患者低的病人(和).4，25，26，27，28，29，30，31，32与PI3K在AKT激活中的作用一致，p-AKT高的该组PI3K表达的平均水平显著高于p-AKT低的组(E） ●●●●。此外，p-AKT高的该组IL-6的频率较高+、Myc高的，Bcl-2型高的，p-STAT3型高的、FOXP1高的，野生型-p53高的和BLIMP-1+表达和低频率TP53型NF-κB亚单位p50、p52和c-Rel的突变和核表达().
表1
| 变量 | DLBCL（DLBCL）
| GCB-DLBCL公司
| ABC-DLBCL公司
|
|---|
| 对AKT高的(n个 = 127) | 对AKT低的(n个 = 395) | P（P） | p-AKT公司高的(n个=61） | p-AKT公司低的(n个 = 204) | P（P） | p-AKT公司高的(n个 = 66) | p-AKT公司低的(n个 = 184) | P（P） |
|---|
| 年龄，年 |
| <60 | 61 (48.0) | 163 (41.3) | 0.18 | 35 (57.4) | 99 (48.5) | 0.25 | 26 (39.4) | 59 (32.1) | 0.29 |
| ≥60 | 66 (52.0) | 232 (58.7) | 26 (42.6) | 105 (51.5) | 40 (60.6) | 125 (67.9) |
| 性别 |
| 男 | 73 (57.5) | 228 (57.7) | 1 | 37 (60.7) | 115 (56.4) | 0.66 | 36 (54.5) | 110 (59.8) | 0.47 |
| 女性 | 54 (42.5) | 167 (42.3) | 24 (39.3) | 89（43.6） | 30 (45.5) | 74（40.2） |
| 阶段 |
| 一/二 | 51 (42.1) | 186（48.4） | 0.25 | 27 (47.4) | 111 (56.1) | 0.29 | 24 (37.5) | 70 (39.1) | 0.88 |
| 三/四 | 70 (57.9) | 198 (51.6) | 30 (52.6) | 87 (43.9) | 40 (62.5) | 109 (60.9) |
| B-症状 |
| 缺席 | 75 (62.0) | 244 (65.2) | 0.51 | 43 (75.4) | 130 (67.7) | 0.33 | 32 (50.0) | 109 (62.3) | 0.1 |
| 存在 | 46 (38.0) | 130 (34.8) | 14 (24.6) | 62 (32.3) | 32 (50.0) | 66 (37.7) |
| LDH水平 |
| 正常 | 45 (38.8) | 143 (39.1) | 1 | 22 (39.3) | 79 (42.2) | 0.76 | 23（38.3） | 63 (36.6) | 0.88 |
| 高架 | 71 (61.2) | 223 (60.9) | 34（60.7） | 108 (57.8) | 37 (61.7) | 109 (63.4) |
| 节点外站点数量 |
| 0–1 | 84 (70.0) | 298 (78.2) | 0.085 | 42 (73.7) | 154 (79.4) | 0.37 | 42 (66.7) | 138 (76.7) | 0.13 |
| ≥2 | 36 (30.0) | 83 (21.8) | 15 (26.3) | 40 (20.6) | 21 (33.3) | 42 (23.3) |
| ECOG评分 |
| 0–1 | 92 (81.4) | 298 (84.2) | 0.47 | 44 (84.6) | 153 (86.0) | 0.82 | 48 (78.7) | 138 (81.7) | 0.7 |
| ≥2 | 21 (18.6) | 56 (15.8) | 8 (15.4) | 25 (14.0) | 13 (21.3) | 31（18.3） |
| 肿瘤大小，cm |
| <5 | 49 (57.6) | 173 (57.5) | 1 | 19（51.4） | 94 (60.3) | 0.36 | 30 (62.5) | 76 (54.3) | 0.4 |
| ≥5 | 36 (42.4) | 128 (42.5) | 18 (48.6) | 62 (39.7) | 18 (37.5) | 64 (45.7) |
| IPI得分 |
| 0–2 | 71 (57.3) | 243 (63.6) | 0.24 | 38 (63.3) | 136 (69.7) | 0.35 | 33 (51.6) | 100 (55.6) | 0.66 |
| 3–5 | 53 (42.7) | 139 (36.4) | 22 (36.7) | 59 (30.3) | 31 (48.4) | 80 (44.4) |
| 治疗反应 |
| CR公司 | 92 (72.4) | 303 (76.7) | 0.34 | 42 (68.9) | 155 (76.0) | 0.32 | 50 (75.8) | 141（76.6） | 0.87 |
| 公关 | 19 | 48 | 8 | 24 | 11 | 24 |
| 标准偏差 | 7 | 15 | 4 | 10 | 三 | 5 |
| PD公司 | 9 | 29 | 7 | 15 | 2 | 14 |
表2
p-AKT高表达与低表达DLBCL患者的分子特征比较
| 变量 | DLBCL（DLBCL）
| GCB-DLBCL公司
| ABC-DLBCL公司
|
|---|
| p-AKT公司高的 | p-AKT公司低的 | P（P） | p-AKT公司高的 | p-AKT公司低的 | P（P） | p-AKT公司高的 | p-AKT公司低的 | P（P） |
|---|
| IL-6表达 |
| 积极的 | 24 (20.7) | 40 (10.9) | 0.011 | 8 (15.1) | 21 (11.2) | 0.48 | 16（25.4） | 19 (10.9) | 0.011 |
| PI3K表达 |
| ≥70% | 40 (36.4) | 98（27.8） | 0.095 | 16 (31.4) | 44 (24.3) | 0.22 | 24 (40.7) | 52 (30.8) | 0.2 |
| p-STAT3表达 |
| >40% | 25 (25.8) | 45 (13.7) | 0.008 | 7 (14.6) | 17 (10.2) | 0.44 | 18 (36.7) | 28 (17.4) | 0.006 |
| Myc表达 |
| ≥70% | 59 (46.8) | 111 (28.9) | <0.0001 | 31（51.7） | 41 (20.9) | <0.0001 | 28 (42.4) | 69 (37.5) | 0.56 |
| Bcl-2表达 |
| ≥70% | 82 (65.6) | 160 (41.6) | <0.0001 | 35 (59.3) | 66 (33.2) | <0.0001 | 47 (71.2) | 94 (51.6) | 0.006 |
| Myc公司高的/Bcl-2型高的 |
| + | 36（28.8） | 58 (15.1) | 0.0006 | 15 (25.4) | 17 (8.7) | 0.0007 | 21 (31.8) | 41 (22.3) | 0.12 |
| MYC公司易位 |
| + | 13 (15.7) | 25 (10.1) | 0.17 | 10 (27.8) | 15 (12.4) | 0.037 | 3 (6.4) | 10 (7.9) | 1 |
| BCL2级易位 |
| 积极的 | 23 (22.3) | 50 (15.9) | 0.14 | 20 (41.7) | 44 (28.2) | 0.11 | 3 (5.5) | 6 (3.8) | 0.7 |
| TP53型突变 |
| 积极的 | 15 (13.8) | 87 (24.6) | 0.017 | 10 (19.2) | 53 (29.0) | 0.21 | 5 (8.8) | 34 (20.6) | 0.045 |
| WT-p53表达 |
| ≥20% | 32 (34.4) | 57 (22.5) | 0.027 | 14 (34.1) | 29 (23.4) | 0.22 | 18 (34.6) | 28（21.7） | 0.089 |
| Bcl-6表达 |
| >30% | 103 (83.1) | 284（74.3） | 0.05 | 54 (91.5) | 170 (85.0) | 0.28 | 49 (75.4) | 114 (62.6) | 0.069 |
| CD10表达 |
| ≥30% | 59 (46.5) | 146 (37.9) | 0.095 | 51 (83.6) | 132 (65.7) | 0.007 | 8 (12.1) | 14 (7.6) | 0.31 |
| FOXP1表达式 |
| ≥60% | 93 (73.8) | 208 (54.3) | <0.0001 | 37 (61.7) | 58 (29.1) | <0.0001 | 56 (84.8) | 150 (81.5) | 0.16 |
| BLIMP-1表达 |
| ≥10% | 42 (35.0) | 83 (22.1) | 0.008 | 10 (17.5) | 25 (12.9) | 0.39 | 32 (50.8) | 57 (31.8) | 0.01 |
| NF-κB1/p50核表达 |
| 积极的 | 40（38.1） | 199 (56.7) | 0.001 | 13（25.0） | 85 (47.5) | 0.004 | 27 (50.9) | 113（66.1） | 0.053 |
| NF-κB2/p52核表达 |
| 积极的 | 16 (14.0) | 123 (34.4) | <0.0001 | 7 (13.2) | 64 (35.2) | 0.002 | 9 (14.8) | 58 (33.3) | 0.005 |
| c-Rel核表达 |
| 积极的 | 14 (13.0) | 122 (35.5) | <0.0001 | 5（9.6） | 61 (35.3) | <0.0001 | 9 (16.1) | 60 (35.3) | 0.007 |
p-AKT之间的正相关高的和Bcl-2高的在GCB和ABC亚群中，NF-κB（p50、p52和c-Rel）的表达和阴性核表达均显著。Myc公司高的在p-AKT中更常见高的GCB-DLBCL患者，可能是由于MYC公司易位。p-AKT的相关性高的具有IL-6、p-STAT3高的和BLIMP-1+表达与TP53型突变仅在ABC亚型中显著(和，F–H）。
评估Bcl-2、Myc和p-STAT3过度表达对p-AKT相关生存率降低的影响高的DLBCL，我们比较了p-AKT的存活率高的和p-AKT低的有或无Bcl-2、Myc和p-STAT3过度表达的DLBCL患者。我们发现p-AKT之间的生存率没有差异高的和p-AKT低的Bcl-2患者高的、Myc高的、Myc高的Bcl-2型高的（双正，DP）和p-STAT3高的DLBCL子集。然而，在Bcl-2中低的、Myc低的、非DP和p-STAT3低的子集，p-AKT高的患者的PFS明显低于p-AKT低的病人(). 然而，在这四个子集（即Bcl-2低的、Myc低的、非DP和p-STAT3低的)、p-AKT高的各组Myc的平均表达水平均显著高于p-AKT低的组；在Myc低的、非DP和p-STAT3低的子集，p-AKT高的各组的Bcl-2平均表达水平也显著高于对照组().
磷酸化AKT（pAKT）过表达的预后和表达分析高的)如Kaplan-Meier曲线和散点图所示，弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中Myc、Bcl-2和磷酸化STAT3（pSTAT3）的过度表达与否。Bcl-2的临界值高的、Myc高的和pSTAT3高的分别为≥70%、≥70%和≥50%。答：在Bcl-2中低的子集，但不是Bcl-2高的子集，pAKT高的与显著恶化的无进展生存期（PFS）相关。然而，在Bcl-2中低的和Bcl-2高的亚群，Myc在pAKT中的表达显著增高高的组比pAKT中的组低的组。Bcl-2内低的和Bcl-2高的亚群，Bcl-2表达在pAKT之间没有太大差异高的和pAKT低的组。B类：在Myc低的但不是Myc高的子集，pAKT高的与严重恶化的PFS相关。然而，在Myc低的亚型，在pAKT中Myc和Bcl-2水平显著升高高的组比pAKT中的组低的组。抄送：在pSTAT3中低的子集，但不是pSTAT3高的子集，pAKT高的与严重恶化的PFS相关。然而，在pSTAT3中低的亚型，在pAKT中Myc和Bcl-2水平显著升高高的组比pAKT中的组低的组。医生：在非双阳性（DP）子集中，但不在Myc中高的/Bcl-2型高的（DP）子集，pAKT高的与严重恶化的PFS相关。然而，在非DP亚群中，pAKT中Myc和Bcl-2水平均显著升高高的组比pAKT中的组低的组。在散点图中，每个点表示一名患者的表达水平。pAKT中的平均表达水平低的组由蓝线表示；pAKT中的平均表达水平低的该组用粉色线表示。*P（P） < 0.05,∗∗P（P） < 0.01,∗∗∗P（P） < 0.001.
p-AKT过度表达的多变量生存分析与临床参数调整导致临界值P（P）DLBCL队列中PFS的不良影响值(). 然而，对Myc/Bcl-2过度表达和TP53型突变状态显示p-AKT高的在总体DLBCL中不是一个重要的独立预后因素（对于OS，P（P） = 0.64; 对于PFS，P（P）=0.33）或在GCB-和ABC-DLBCL子组中（数据未显示）。
表3
DLBCL、GCB-DLBCL和ABC-DLBCL核p-AKT过度表达的多元分析
| 变量 | 总体生存率
| 无进展生存
|
|---|
| 心率（95%置信区间） | P（P） | 心率（95%置信区间） | P（P） |
|---|
| DLBCL（DLBCL） |
| IPI>2 | 2.47 (1.76–3.47) | <0.001 | 2.27 (1.65–3.14) | <0.001 |
| 女性 | 1.00 (0.71–1.40) | 1 | 0.98 (0.71–1.35) | 0.89 |
| 肿瘤大小>5 cm | 1.33 (0.96–1.86) | 0.09 | 1.27 (0.93–1.75) | 0.13 |
| B-症状 | 1.37 (0.97–1.94) | 0.075 | 1.37 (0.99–1.91) | 0.061 |
| 核p-AKT高的 | 1.30（0.89–1.90） | 0.18 | 1.40 (0.98–2.00) | 0.068 |
| GCB-DLBCL公司 |
| IPI>2 | 3.51（2.08–5.92） | <0.001 | 3.40 (2.09–5.55) | <0.001 |
| 女性 | 0.96 (0.57–1.61) | 0.87 | 1.04 (0.64–1.685) | 0.88 |
| 肿瘤大小>5 cm | 1.50 (0.90–2.50) | 0.12 | 1.45 (0.90–2.34) | 0.13 |
| B-症状 | 1.38 (0.82–2.33) | 0.23 | 1.27 (0.77–2.10) | 0.35 |
| 核p-AKT高的 | 1.15 (0.61–2.17) | 0.67 | 1.39 (0.78–2.48) | 0.27 |
| ABC-DLBCL公司 |
| IPI>2 | 2.36 (1.52–3.66) | <0.001 | 2.337 (1.50–3.62) | <0.001 |
| 女性 | 1.01 (0.64–1.59) | 0.96 | 1.00 (0.64–1.58) | 1 |
| 肿瘤大小>5 cm | 1.40 (0.90–2.17) | 0.14 | 1.41 (0.90–2.20) | 0.13 |
| B-症状 | 1.24 (0.78–1.96) | 0.37 | 1.25 (0.79–2.00) | 0.34 |
| 核p-AKT高的 | 1.43 (0.88–2.30) | 0.15 | 1.45 (0.90–2.34) | 0.13 |
AKT1型和AKT2型mRNA表达与不同预后相关
p-AKT高的和p-AKT低的各组在AKT1/2型mRNA水平(P（P） = 0.56). 此外，我们分析了与AKT1型/2/三mRNA表达。高水平的AKT1型mRNA与明显较差的生存率（OS，P（P） = 0.0032; PFS、，P（P）=0.0062）。类似的预后影响AKT3型观察到mRNA表达，但无显著性P（P）值。相反，高AKT2型mRNA水平与DLBCL临界生存率相关P（P）值（OS，P（P） = 0.09; PFS、，P（P） = 0.078) ().
AKT1/2/3 mRNA表达对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者总生存率和无进展生存率的预后影响。
GEP分析
为了更好地了解AKT过度激活的分子机制及其预后影响，我们进一步比较了p-AKT的基因表达谱高的和p-AKT低的发现29个转录本差异表达，错误发现率<0.01(A） 251个有意义的转录本，错误发现率阈值为0.05。当分别分析GCB和ABC亚型时，仅在GCB-DLBCL中显著识别基因签名（174个转录本，错误发现率<0.05）(B和). 许多基因参与免疫反应(C1S公司，IL1R1型，C3类，指挥与控制，CCL5号机组，IFNGR1，化学当量/日，人类白细胞抗原基因，以及百万美元)p-AKT中细胞外基质、细胞粘附、胶原、细胞骨架和代谢下调高的患者。相反，MDM2型和MAP2K（地图2K）上调。分析时PD-1/PD-L1/L2特别是基因，我们发现p-AKT高的与…相关PD-L2型GCB-DLBCL中的下调(C） ●●●●。
磷酸化AKT（p-AKT）表达的基因表达谱和miRNA谱分析。A类和B类：p-AKT高表达和低表达（p-AKT高的和p-AKT低的)在整个弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）队列中（假发现率<0.01）(A类)生发中心B细胞样（GCB）亚组（假发现率<0.05，折叠变化>1.68）(B类).抄送：p-AKT高的组的PDCD1L2系列mRNA表达高于p-AKT低的GCB-DLBCL中的组。医生：平均水平在p-AKT之间存在显著差异的miRNAs高的和p-AKT低的组。∗∗P（P） < 0.01. ABC，活化B细胞样。
表4
p-AKT间差异表达的基因高的和p-AKT低的总体DLBCL和GCB-DLBCL案例
| 功能类别 | 在DLBCL中（FDR<0.01）
| 在GCB-DLBCL中（FDR<0.05）
|
|---|
| 下调基因 | 下调基因 | 上调基因 |
|---|
| 免疫反应、细胞因子受体、趋化因子 | C1S公司，IL1R1型 | 立方英尺/立方英尺1英寸，C3类，C1S公司，CCL5号机组，如果ngr1，CEBPD公司，HLA-B型，百万美元，HLA-F型，指挥与控制，人类白细胞抗原-A，人类白细胞抗原-E，人类白细胞抗原-G | 定义126 |
| 细胞凋亡 | | CARD16/CASP1，VDAC3型，TMBIM6型 | MDM2型 |
| 信号 | 国家一级 | CD63型，销售1L，PRKAR1A公司，西部数据26，EFHD2型，国家一级 | MAP2K5（地图2K5），TSSK3型 |
| 基因表达，细胞生长 | ZNF583型，6月，DUSP1型，CALD1（校准1） | DUSP1型，AEBP1型，6月，荷兰皇家空军9，澳大利亚皇家银行，NR3C1号机组，GRN公司，LMNA公司，运行NX1，HNRNPU公司 | RPL37A型，ANAPC13公司，SNAI3公司，MRTO4型，CEP97公司，HNRNPR公司，TTF2型 |
| 细胞粘附、细胞骨架、细胞外基质、胞吐、迁移、转移、血管生成 | 定音鼓2，COL6A1系列，COL1A2公司，分布式控制网络，COL1A1公司，COL3A1系列，COL5A2系列，PDPN公司 | MXRA5型，FN1型，COL5A2系列，CD44细胞，TIMP2公司，COL1A1公司，BGN公司，SRGN公司，帕尔瓦，ITGB2标准，DPYSL3型，基质金属蛋白酶2，灯2，夏令时，SPARC公司，西部数据1，TLN1型，PDLIM5项目，PSAP公司，SERPINF1系列，MIR21公司/TMEM49型，机长1，ANXA7公司，行动1，EXOC4公司，SH3PXD2A型，DYNLL2公司，ABHD2型，ACTB公司 | 日元1 |
| 新陈代谢 | 自由贸易区 | SOD2标准，NNMT公司，胶水，ALDH2型，FTH1（飞行时间1），PIGY公司，B4镀锌1，自由贸易区，APOE公司，CYBRD1年，序列1，RNASEK公司，CSGALNACT2号机组，GLRX公司，PPP1CA公司，GPX4型，通用程序设计2，镓酸镓，5R3日历年，TATD2型 | 数据3b，FXN公司，AGPAT5公司 |
| 降解、蛋白质折叠、分类、运输、贩运 | CTSB公司，ZFAND5公司 | SLC1A3型，RAB31型，ZFAND5公司，加利福尼亚州，美国药典36，UBE2L6型，ATP6V0E1型，ARNT公司，RAB35型，第23b页，DNAJC3公司，序列3，皮卡姆，STX4型，第53页，AP2S1传感器 | FKBP6型，KCNK1公司，FBXO38型，CACYBP公司 |
| 区别 | | 阿纳克，SLFN5型 | |
| 未知函数 | 阿基林1 | LOC100288387号，LOC100129500，阿克林1，行进1，TMEM140型 | C3或53，C6或f58，61的CX，位置100129069，C18或18，PDZK1P1，位置440957，RNFT2号机组 |
miRNAs可能在p-AKT过度激活中起重要作用
与p-AKT和AKT1 mRNA水平之间缺乏相关性相反，我们发现63个与PI3K/AKT/mTOR通路相关的miRNAs在p-AKT与AKT1之间有显著差异表达高的和p-AKT低的DLBCL组(D） ●●●●。例如，miR-22-3p、miR-23a-5p、let-7c-5p、let-7b-5p、miR143-3p、miR-99a-5p，miR-125b-5p，miR-125b-1-3p、miR 27a-5p和miR-320a/b/c/d/e、miR-204-3p和miR 425-3p的平均表达水平，P（P）<0.0001），miR-29c-5p(P（P）=0.0001），miR-214-5p(P（P）=0.0005），miR-7-5p(P（P）=0.0008）和miR-222-5p(P（P）=0.0092）显著低于p-AKT高的组，而miR-17-5p的平均表达水平(P（P）<0.0001），miR-20a-5p(P（P）=0.0018）和miR-20b-5p(P（P）=0.0038）显著高于p-AKT高的在整个DLBCL队列以及GCB和ABC子组中。
AKT公司DLBCL中的突变似乎没有病理意义
我们对AKT1型192个DLBCL（103个GCB和86个ABC）样本中的基因。非同义词AKT1型突变(n个=36）在192个样本中的32个（16.7%）中检测到，包括8个PH域突变、22个催化（蛋白激酶）域突变和5个C末端延伸域突变(A） ●●●●。未观察到两者之间的相关性AKT1型患者的突变状态和p-AKT表达，无明显预后差异AKT1型突变（整体或区域特异性突变）和无突变的DLBCL（OS，P（P） = 0.82; PFS，P（P）=0.94）或在GCB和ABC子集内。在p-AKT过度表达的患者中，四例突变AKT患者的OS和PFS似乎比野生型AKT患者差，尤其是在GCB-DLBCL患者中（一例在PH结构域发生突变，两例在催化结构域发生突变）(、B和C）。然而，这四个突变的p-AKT高的这些病例也有Myc和Bcl-2过度表达。对于三例GCB-DLBCL病例，其中一例MYC公司移位，其中一个BCL2级移位，其中一个同时有TP53型删除和BCL6号机组易位。
AKT1型突变分析。答：AKT1蛋白结构域和AKT1型弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中观察到的突变。B类和抄送：在高水平磷酸化AKT（p-AKT）患者中高的)，名患者AKT1型突变（MUT）患者的无进展生存率往往低于野生型（WT）患者AKT1型在整个DLBCL队列中(B类)生发中心B细胞样（GCB）亚群(C类). ABC，活化B细胞样；PH、pleckstrin同源性；UC，不可分类。
MK-2206降低AKT磷酸化并损害DLBCL细胞活性
作为揭示p-AKT在DLBCL中的调节和作用以及评估靶向AKT治疗潜力的另一种方法，我们研究了AKT抑制剂MK-2206在人类DLBCL细胞系（17个GCB-DLBCL和9个ABC-DLBCL）中的抗淋巴瘤活性。用增加剂量的MK-2206（0至25μmol/L）处理细胞48小时，并评估细胞活力。与其他细胞系的先前研究类似，16，35暴露于MK-2206以剂量依赖性的方式损害细胞活性。在大多数IC细胞系中，细胞活力的降低是适度的50值范围为0.5至20μmol/L(A） ●●●●。MK-2206处理降低了AKT磷酸化，但不影响大多数DLBCL株系的总AKT水平(B） ●●●●。MK-2206敏感细胞表达的p-AKT水平显著高于MK-2206-耐药细胞(C） 。在具有代表性的DLBCL细胞系中，MK-2206敏感性和p-AKT活性之间的Spearman秩相关显著(D） ●●●●。
MK-2206对弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞株中AKT的药理抑制作用。答：MK-2206治疗48小时对人类患者衍生DLBCL细胞系相对于二甲基亚砜对照细胞的活性的影响。B类：与20μmol/L MK-2206孵育48小时后，LP、MS、DOHH2和Toledo细胞系中磷酸化AKT（p-AKT）和总AKT蛋白表达的Western blot分析结果。抄送：MK-2206敏感与耐药细胞系中p-AKT表达的比较。MK-2206集成电路50≤10μmol/L视为敏感，IC50>10μmol/L被认为具有耐药性。医生：根据相应的MK-2206 IC绘制RPPA评估的p-AKT50在26个具有代表性的DLBCL细胞系中。瀑布图显示IC50每个细胞系的MK-2206值(A类). 相关系数由Spearman秩相关和双尾t吨-测试。∗∗P（P） < 0.01. PC，阳性对照；反相蛋白阵列。
MK-2206抑制AKT信号，但也诱导mTORC2和补偿信号通路
为了了解MK-2206的作用机制，我们在两个对MK-2207敏感的代表性DLBCL细胞系DOHH2（GCB）和LP（ABC）中，使用RPPA全面分析了AKT抑制后信号转导级联的变化。在MK-2206处理后（在IC75)24或48小时。质量控制后，共有285个蛋白质的表达数据可用于进一步分析。监督分层聚类检测到MK-2206治疗后每个细胞系中都有一组上调和下调蛋白(A） ●●●●。选择显著上调和下调的蛋白质为每个细胞系生成一个热图(B） 和在中分类.
MK-2206处理的DOHH2和LP细胞系的反向蛋白质阵列分析。答：监测DOHH2和LP细胞系中分析的285个蛋白质的层次聚类热图。对于每个热图前三行是一式三份的控件底部六排是MK-2206（IC75)分别治疗24小时和48小时。B类：MK-2206治疗后DOHH2和LP细胞系中显著上调和下调蛋白质的热图。红色和绿色条分别表示上调和下调。抄送：MK-2206治疗后AKT信号通路改变的示意图。详细说明见正文。绿色箭头和钝线显示抑瘤效果；红色箭头和钝线表明有促进肿瘤的作用。医生：MK-2206治疗后，下调磷酸化AKT（pAKT）和AKT靶蛋白在DOHH2和LP细胞系中均显著。ABC，活化的B细胞样；GCB，生发中心B细胞样；PTK，蛋白酪氨酸激酶。
表5
MK-2206治疗后DOHH2和LP细胞系上调和下调蛋白
| 功能类别 | DOHH2（GCB-DLBCL）中
| 在LP（ABC-DLBCL）中
|
|---|
| 增加 | 降低 | 增加 | 降低 |
|---|
| 细胞周期、检查点、DNA损伤反应、DNA复制、基因表达 | 组蛋白H3，eEF2K，p27-Kip-1，∗p16INK4a，53BP1，p21，∗†细胞周期蛋白E1，†自动取款机，†PARP-开裂† | Chk1、Rb_pS807_S811、PLK1、Cyclin-B1、，∗福克斯M1，∗Rad51、Chk1_pS296、PCNA、Rb、ATR、UBAC1、GCN5L2、CDK1、MSH2、MSH6、Chk1_pS345、CDC2-p34、Chk2、Aurora-B | Pdcd4，∗细胞周期蛋白E1，PARP裂解† | 细胞周期蛋白B1，∗PLK1、Rb_pS807_S811、福克斯M1、，∗Chk1、Aurora-B、MSH2、ATR、CDC2-p34、Rb、MSH6、UBAC1、CDK1、PCNA、Chk1_pS296、ADAR1、ARID1A、Cyclin-D1∗ |
| 细胞凋亡，自噬 | Bcl-2、Mcl-1、Puma、Bim、，∗Bad_pS112，∗半胱氨酸蛋白酶-7裂解，*半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3，*Bax公司，∗Beclin，∗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9裂解，∗福克斯O3a∗ | 福克斯O3a_pS318_S321，∗p53，投标，XIAP∗ | Mcl-1、Bim、，∗彪马、Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶-7、，∗Smac、Bak、p53、Bad、，∗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9∗ | Bcl2A1公司 |
| 信号传递、细胞生长、免疫反应 | S6_pS235_S236，∗p38_pT180_Y182、MEK1_pS217_S221、NF-kB-65_pS536、Rictor、，∗PAR、PDGFR-β、，∗MAPK_pT202_Y204，Lck，PKC-α，PI3K-p110-α-R，∗PI3K-p85，∗管蛋白（TSC2），∗PTEN公司，∗Axl，∗Caveolin-1、PREX1、PKC-β-II_pS660、PKC-α_pS657、，†传真_pY397，∗†IGFBP5，∗†SHP-2_pY542，∗†石笼2，∗†阿克特∗† | Akt_pS473，∗Akt_pT308，∗eIF4G，∗TTF1、4E-BP1_pS65、，∗FAK、mTOR、，∗MEK1、c-Myc、，∗HER3_pY1289，∗c-Met公司，∗S6_pS240_S244系列∗† | PAR、Lck、c-Myc、，∗YAP_pS127，∗缺口1，Pdcd-1L1，∗PKC-α_pS657，Axl，∗Caveolin-1、PDGFR-β，∗Notch3、NF-κB-p65_pS536、PKC-δ_pS664、PKC-β-II_pS660 | Akt_pS473，∗eIF4G中，∗p70-S6K_pT389，∗MEK1、4E-BP1_pS65、，∗PRAS40_pT246，∗C-Raf，mTOR公司∗ |
| 细胞粘附、缝隙连接、细胞外基质、胞吐、内吞、血管生成 | 纤维连接蛋白、连接蛋白-43、连接蛋白-I、连接蛋白-7、Claudin-7、，†CD44-M型† | TFRC、VEGFR-2∗ | 连接蛋白-43、E-Cacherin、，∗Claudin-7、Annexin-VII、CD44、Annessin-I† | |
| 代谢，缺氧 | LDHA公司† | Hif-1α，∗GSK-3b_pS9，∗GSK-3ab_pS21_S9，∗己糖激酶-II，∗ACC1、ACC_pS79、GSK-3ab∗ | G6PD、ATP5A | GSK-3b_pS9，∗GSK-3ab_ pS21_，∗SDHA、Gys、己糖激酶II、，∗GSK-3ab公司* |
| 蛋白质折叠 | HSP27_pS82，亲环素，HSP27 | 热休克蛋白70 | 热休克蛋白27 | |
p-AKT（序列号473)MK-2206处理后，两种细胞系的水平均显著下降；p-AKT（Thr308)DOHH2细胞中的水平也下调。AKT磷酸化的下游靶点，如p-GSK-3b、p-FoxO3a、p-真核翻译起始因子4E-结合蛋白1（4E-BP1）、p-PRAS40、mTOR、真核翻译启动因子4G（eIF4G）、p-p70-S6K、细胞周期蛋白B1/D1、FoxM1、XIAP、己糖激酶-II、低氧诱导因子（HIF）-1α、，DOHH2/LP细胞中血管内皮生长因子受体（VEGFR）-2也下调(而TSC-2、p27-Kip-1、Bim、BAD、bcl2-associated X protein（Bax）、FoxO3a、裂解半胱天冬酶和E-Cadherin表达上调（但不上调GSK-3ab）。除了参与细胞周期进展的蛋白质（如细胞周期蛋白B1/D1、CDK1、FoxM1和Aurora B）的下调外，参与DNA修复的蛋白质[如检查点激酶1（ChK1）、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关、MutS蛋白同源物2、MutS-蛋白同源物6、Rad51和增殖细胞核抗原（PCNA）MK-2206治疗后，肿瘤抑制因子视网膜母细胞瘤蛋白和polo-like kinase 1在DOHH2和/或LP细胞中也下调()].
然而，与在使用mTOR抑制剂时观察到的一种常见现象类似，这种现象是由负反馈回路的丢失引起的，8，9激活p-AKT的Rictor（mTORC2）和PI3K；激活PI3K的蛋白酪氨酸激酶p-FAK和衔接蛋白GRB2相关结合蛋白2；MK-2206处理后，DOHH2细胞中p-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶1（MEK1）、p-p38（MAPK14）和p-MAPK（ERK2）上调，提示代偿信号的激活；酪氨酸激酶受体血小板衍生生长因子受体（PDGFR）β和Axl（激活PI3K和AKT信号）、蛋白激酶Cs（PKCs）（PDGFR-PI3K下游，受mTORC2调节）、蛋白酪氨酸激酶Lck、支架蛋白Caveolin-1、受体蛋白酶激活受体、，DOHH2和LP细胞中p-NF-κB-65上调；MK-2206处理后，LP细胞中Notch1和Notch3上调。相反，DOHH2和/或LP细胞中p-HER3、黏着斑激酶（FAK）、MEK1和C-Raf表达下调。MK-2206处理后，负调节PI3K信号的PTEN和Src同源区-2在DOHH2细胞中上调().
可能是因为mTORC2活性增强，代偿途径激活，GSK-3ab表达降低(),10，36，37MK-2206治疗后，抗凋亡Bcl-2和Mcl-1在DOHH2和LP细胞中均上调。MK-2206处理后，p53和Myc在LP细胞中上调，但在DOHH2细胞中下调。Beclin（自噬必需）在DOHH2细胞中上调。此外，MK-2206治疗后，LP细胞中介导免疫抑制的程序性细胞死亡蛋白1配体1（PD-L1）表达显著增加().
讨论
在这里，我们探讨了AKT激活在DLBCL中的作用和调节，以及AKT靶向治疗的潜力。我们发现核p-AKT（Ser473)（≥70%，p-AKT高的)与接受R-CHOP治疗的DLBCL患者的PFS显著降低相关。然而，p-AKT高的与Bcl-2和Myc过度表达相关，多变量分析表明p-AKT高的不是生存率较低的独立预后因素。早期在较小患者队列中的研究也观察到p-AKT的这种预后影响（在单变量分析中显著，但在多变量分析中不显著）(n个 = 97).23这些数据表明AKT激活的不利影响是间接的，并且取决于下游效应器。11由于利妥昔单抗可以抑制AKT信号传导，AKT对接受R-CHOP治疗的患者的不良预后影响也可能得到缓解，38而AKT信号上调CD20水平。39p-AKT（Ser473)和p-AKT（Thr308)可能也混淆了分析。虽然Ser处磷酸化473通常认为对p-AKT的充分激活是必要的，9，10，40p-AKT（Thr308)在缺乏磷酸化-Ser的情况下473可以有部分功能。41此外，尚不清楚p-AKT（Ser473)我们使用的抗体与p-AKT2（Ser474)和p-AKT3（血清472)亚型。值得注意的是AKT1型和AKT2型在DLBCL队列中，这两种常见表达的亚型与相反的预后影响相关(). 尽管其预后影响有限，但p-AKT过度激活可能在Myc和Bcl-2进行预后分层后提供重要信息，因为在Myc或Bcl-2表达水平低的患者中，它与显著较差的PFS相关().
GEP分析显示p-AKT中许多免疫相关基因表达下调高的尤其是在GCB-DLBCL中，而MDM2型和MAP2K（地图2K）保护细胞免受凋亡的基因上调。令人惊讶的是，许多参与代谢和细胞骨架的基因在p-AKT中也被下调高的组，与AKT和mTOR的功能相反。AKT的主要功能可能是通过翻译后修饰介导的，而不是在转录水平上。此外，确定的p-AKT高的签名显示与Myc相似高的和p50低的GEP特征（未显示数据），可能由p-AKT的正/负相关性引起高的有这两种转录因子。
关于AKT过度激活机制，AKT1型在DLBCL中很少被放大，5，42但是一些上游基因的改变已经被证实，例如PTEN公司43，44和PIK3CA公司突变。45AKT PH结构域E17K中的激活突变已在实体瘤中显示，对AKT抑制剂产生耐药性。46在本研究中，我们没有观察到激活的E17K突变或AKT突变对预后的显著影响。尽管四名AKT突变体核过度表达的患者预后较差，但患者人数较少，生存率较低可归因于其他遗传损伤(MYC公司，BCL2级，或BCL6号机组重新安排，或TP53型删除）。
相反，我们的分析表明，IL-6/PI3K信号通路和miRNAs的表观遗传调控在DLBCL AKT过度激活中起着重要作用。我们发现63个miRNAs在p-AKT之间有显著差异表达高的和p-AKT低的组。p-AKT中下调的miRNAs高的miR-143组通过抑制PI3K/AKT和MAPK通路而具有抗肿瘤功能。47相反，miR-17-5p靶向负调控PI3K/AKT通路的PTEN，48p-AKT上调高的组。
AKT被认为是PI3K/AKT/mTOR激活的癌症的有效治疗靶点49以及不受AKT激活驱动的肿瘤。12MK-2206的抗肿瘤活性在PTEN缺失或PIK3CA突变的部分但不是全部乳腺癌细胞系中更强。50我们的数据表明，MK-2206在DLBCL细胞系中的敏感性与AKT激活状态相关，表明MK-2208在DLBCL细胞中的靶向作用。有趣的是，DOHH2细胞（GCB-DLBCLMYC公司/BCL2级重排和野生型p53）和LP（带有突变p53的ABC-DLBCL）细胞表现出较高的MK-2206敏感性。体外研究表明，由于GSK-3的抑制，AKT激活增加了Myc蛋白的稳定性。51在小鼠模型中，AKT激活和Myc表达在侵袭性B细胞淋巴瘤中表现出协同作用。52肿瘤发病后第53页−/−小鼠，AKT1消融导致胸腺淋巴瘤消退，并延长其寿命第53页−/−老鼠。12在DOHH2和LP DLBCL细胞系中观察到MK-2206的抗淋巴瘤活性，以及p-AKT过度表达与MYC公司在这个DLBCL队列中观察到的重排和Myc/Bcl-2过度表达，可能提示对具有侵袭性致癌因素的DLBCL采取间接靶向策略。
我们进一步使用RPPA分析AKT信号，RPPA是一种用于蛋白质组学研究的高通量抗体技术。根据受损细胞活性，在MK-2206治疗后，p-AKT（Ser473)磷酸化靶标被下调，如p-GSK-3b、p-FoxO3a、p-4E-BP1、p-p70-S6K、p-S6、p-PRAS40和p-yes相关蛋白的下调所示。mTOR、HIF-1α、XIAP、VEGFR-2、Cyclin-B1、FoxM1、Cycrin-D1、eIF4G和Hexokinase-II，而p27-Kip-1、BAD、p53凋亡上调调节剂、Bim、Bax、Bak、E-Caddherin、FoxO3a、Beclin和caspases（裂解）上调。然而，一些上游蛋白也被上调，如Rictor（mTORC2）、PI3K、PDGFRβ、Caveolin-1、Lck、p-FAK和Axl（因此是p-PKC/PKC），并且MEK1、p38和MAPK在药物抑制后被激活，可能作为AKT功能的补偿途径。NF-κB-65-pS536（也被PI3K抑制剂上调）53还诱导了Notch1/3。MK-2206的有限疗效也可以通过Bcl-2和Mcl-1的上调以及GSK-3ab和参与DNA损伤和修复的蛋白质的下调来解释。然而，DNA修复减少可能表明MK-2206和放射治疗之间存在协同作用。42值得注意的是，AKT抑制后，LP细胞（ABC-DLBCL和突变的p53）中的p53、Myc和PD-L2表达上调。在这个DLBCL队列中，p-AKT高的与显著降低PD-L2型GCB-DLBCL中mRNA的表达(C） ，并有下降趋势PD-L1型ABC-DLBCL中mRNA的表达(P（P） = 0.16). 这些结果为MK-2206作为单一药物的疗效提供了见解，并表明当与PI3K/mTORC2/1/Bcl-2/Mcl-1/PD-L1抑制剂联合使用时，MK-2206可能更有效。
结论
这项研究表明，大约四分之一的DLBCL患者AKT过度激活与显著较差的PFS相关。尽管这种预后影响可能取决于其他相关致癌事件，但对p-AKT表达的评估有助于预后分层和治疗选择。AKT受损的AKT信号和淋巴瘤细胞活性的药物抑制在体外然而，由于上游和代偿信号通路的诱导，将AKT作为单一治疗的目标疗效有限，需要联合治疗。这些结果对AKT过度激活的DLBCL具有临床和治疗意义，也可能对AKT激活的DLBC具有潜在意义MYC公司/TP53型异常。
致谢
J.W.、Z.Y.X.-M.和K.H.Y.设计并进行了研究，并进行了统计分析；J.W.、Z.Y.X.-M.、K.J.J.、Q.S.、G.C.M.、A.T.、C.V.、J.W.，S.M.-M、K.D.、W.T.、G.B.、E.D.H.、J.H.V.K.、M.P.、A.J.M.F.、S.W.、M.B.M.、M.A.P.、L.J.M.、Y.L.V.P.和K.H.Y.贡献了重要的新试剂、资源、技术和分析工具；J.W.、Z.Y.X.-M.、K.J.J.、Q.S.、A.T.、C.V.、S.M.-M、K.D.、W.T.、G.B.、E.D.H.、J.H.V.K.、M.P.、A.J.M.F.、M.B.M.、M.A.P.和K.H.Y.收集了机构审查委员会和材料转移协议批准的临床和随访数据；J.W.、Z.Y.X.-M.和K.H.Y.撰写了手稿；所有作者都贡献了重要的策略，参与了讨论，提供了科学投入，并编辑了手稿。
脚注
由NIH/国家癌症研究所资助的R01CA138688（Y.L.和K.H.Y.）、1RC1CA146299、P50CA136411和P50CA142509，以及MD Anderson癌症中心资助的CA016672。J.W.是高级教授奖的获得者。K.H.Y.得到了德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构研究与发展基金、机构研究奖、MD安德逊癌症中心淋巴瘤专业项目卓越研究（SPORE）研究发展项目奖、，得克萨斯大学安德森癌症中心骨髓瘤SPORE研究发展计划奖、安德森骨髓瘤SPERE研究发展项目奖和得克萨斯州大学安德森肿瘤中心姐妹机构网络基金会的大学癌症基金会。
J.W.、Z.Y.X.-M.、K.J.J.和Q.S.为这项工作做出了同等贡献。
披露：未声明。
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