AXIN1和AXIN2在Tankyrase抑制剂诱导降解体形成和β-连环蛋白降解中的差异作用

siRNA转染

siRNA寡核苷酸来自GE Healthcare Dharmacon。所有siRNA转染均根据制造商的方案使用RNAiMax（Invitrogen）进行，每孔50 nM siRNA寡核苷酸。用作阴性对照的非靶向siRNA来自Dharmacon（D-001810-01）。对于siRNA介导的AXIN1和AXIN2缺失，使用了以下靶向序列：AXIN1：5’-GGTGTGGCATTAAAGGTG-3’[12]; AXIN2：5’-GAGATGGCATCAAGAA-3’[13].

基于细胞的分析

SW480细胞系购自美国型培养物收集中心（ATCC）。收到细胞后，将其冷冻，并将单个等分样品放入细胞培养中，通常在15代内进行分析。细胞在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基中生长。每六周进行一次支原体污染检测。为了抑制TNKS活性，在指定的时间点用0.5μM G007-LK处理细胞。使用二甲基亚砜（DMSO）作为对照。为了抑制蛋白酶体活性，用10μM MG132单独或与G007-LK联合处理细胞6小时。通过添加25μg/ml环己酰亚胺（CHX）长达6小时来抑制mRNA翻译，无论是单独还是与G007-LK联合。之前已经描述过稳定表达GFP-TNKS1的SW480细胞系[10].

蛋白质印迹分析

在PBS中冲洗细胞并在Laemmli裂解缓冲液中裂解（65.8 mM Tris-HCl，pH 6.8，2.1%SDS，26.3%（w/v）甘油，0.01%溴酚蓝，二硫苏糖醇（DTT））。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（Bio-Rad Laboratories）分离等量的全细胞裂解物，并将其印在PVDF膜（Millipore）上。使用IRDye-conjugated二级抗体（LI-COR Biosciences）进行免疫检测。奥德赛^®使用成像系统（LI-COR Biosciences）扫描所有斑点。使用Odyssey软件量化蛋白质带。

时变实时细胞成像

用G007-LK或G007-LK和MG132的组合处理稳定表达GFP-TNKS1的SW480细胞，然后在Deltavision活细胞显微镜（Applied Precision，GE Healthcare）上成像。为了覆盖整个细胞体积，采集了堆栈。在添加抑制剂之前采集一个堆栈（时间点“0”），然后每10分钟采集一次图像，持续6小时。反褶积后，进行总强度投影。图像分析在ImageJ/Fiji完成[14]计算GFP-TNKS1点的数量。

ScanR高通量显微镜

细胞生长在盖玻片上并固定在多聚甲醛中。图像是使用带有UPLSAPO 40×/0.95物镜的Olympus ScanR系统自动拍摄的。所有图像都是在相同的设置和低于像素饱和度的情况下拍摄的。使用Olympus ScanR分析程序测量G007-LK诱导的GFP-TNKS1点的平均数量。在每次实验中，每个条件下通常分析2000到10000个细胞。

G007 LK诱导的降解体形成需要持续的蛋白质翻译

β-catenin是Wnt信号传导的关键介质，可启动靶基因的转录，包括AXIN2型主要与TCF/LEF转录因子家族复合[23]。重要的是AXIN2型Wnt通路激活后启动负调控反馈环[22]。因此，AXIN2蛋白水平通过β-catenin介导的转录进行正调控，通过TNKS介导的PARsylation和蛋白酶体降解进行负调控。TNKS抑制一方面导致β-catenin降解，从而减少AXIN2型mRNA转录，但另一方面介导AXIN2蛋白的帕尔糖基化和降解减少，我们试图进一步研究AXIN蛋白稳定性对TNKS抑制的微妙调节。为了阐明AXIN2新合成的贡献，我们研究了用环己酰亚胺（CHX）抑制mRNA翻译后，G007-LK处理的细胞在多大程度上形成降解体。表达GFP-TNKS1的SW480细胞用CHX和G007-LK单独或联合处理6小时，然后使用Olympus ScanR显微镜进行高通量图像采集研究(图2A). 使用ScanR分析软件量化GFP-TNKS1点的数量(图2B). 引人注目的是，当G007-LK与CHX结合时，降解体的形成被完全消除，这表明G007-LK-诱导的降解体形成可能需要持续合成AXIN2。事实上，Western blot分析显示，AXIN2蛋白水平在6小时联合治疗期间的任何时间点都没有稳定或增加(图2C和2D). 总之，我们的结果表明，降解体的形成需要AXIN2的持续新合成。然而，在这一点上，我们不能排除其他未知的降解体形成起始因子可能会受到mRNA翻译抑制的影响。因此，我们进行了AXIN1和AXIN2的击倒实验。

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图2

G007-LK诱导降解体的形成需要持续的蛋白质合成。

（A） 用CHX和G007-LK单独或联合处理表达GFP-TNKS1的SW480细胞6小时。图像是用奥林巴斯ScanR显微镜拍摄的。GFP-TNKS1斑点，白色；细胞核，蓝色。比例尺：10μm。（B） 使用ScanR分析软件量化每个细胞GFP-TNKS1点的平均数量。显示了三个独立实验的+/-SEM值。在每个实验中，每个条件下至少分析2000个细胞。（C） 将表达GFP-TNKS1的SW480细胞暴露于与（A）中相同的处理条件下进行裂解，并应用全细胞裂解液进行Western blotting。膜与抗AXIN1、AXIN2、总β-连环蛋白和肌动蛋白的抗体孵育（负荷控制）。显示了一个具有代表性的印迹。（D） 图表显示了来自三个独立实验+/-SEM的（C）中蛋白质印迹的量化。

延长TNKSi治疗后，AXIN1不需要用于持续降解体的形成

经G007-LK治疗6小时后，AXIN1水平基本保持不变(图1D). 然而，在延长G007-LK治疗（长达24小时）后，我们观察到AXIN1和AXIN2蛋白水平均显著升高(图3A)，这与24小时后TNKSi XAV939对AXIN水平的影响一致[9]。为了研究AXIN1的这种晚期上调是否对降解体的稳定性和功能至关重要，在短干扰RNA（siRNA）介导的AXIN1或AXIN2或两者蛋白的缺失后，用G007-LK处理稳定表达GFP-TNKS1的SW480细胞24小时(图3B). 重要的是，AXIN1的缺失并没有导致AXIN2的补偿性上调，反之亦然。在每种条件下，用Olympus ScanR显微镜研究细胞诱导降解酶的能力(图3C). 使用ScanR分析软件对GFP-TNKS1点的数量进行量化，结果表明，与对照细胞相比，缺乏AXIN2的细胞降解体形成减少了约50%(图3D). 令人惊讶的是，AXIN1细胞耗竭不会影响G007-LK诱导的降解酶的数量或大小，也不会进一步显著减少AXIN1和AXIN2细胞耗竭的降解酶数量(图3D和3E). 因此，我们认为，在G007-LK处理24小时后观察到的AXIN1蛋白水平增加2-3倍并不需要降解体的形成，而AXIN2蛋白水平增加15-20倍既是必要的也是充分的。有趣的是，尽管AXIN2在稳态时丰度较高，但AXIN1并没有上调，似乎也没有拯救AXIN2的耗竭[24]G007-LK孵育24小时后其中度增加(图3A).

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图3

长期TNKSi处理后AXIN1的后期上调不需要降解体的形成。

（A） 分别用G007-LK处理0、2、4、6和24小时的SW480细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹。膜与抗AXIN1、AXIN2和肌动蛋白抗体孵育。（B） 稳定表达GFP-TNKS1的SW480细胞在siRNA介导的AXIN1或AXIN2或这两种蛋白耗竭48小时后，用G007-LK处理24小时。使用非靶向siRNA（Scr）作为阴性对照。（C） Olympus ScanR显微镜拍摄的图像显示，在G007-LK处理24小时后，对照（Scr siRNA）细胞或AXIN1和AXIN2缺失的细胞中单独或联合形成GFP-TNKS1点。比例尺：10μm。（D） 使用ScanR分析软件量化GFP-TNKS1点的数量。条形图显示了三个单独实验的+/-SEM值。（E） 图3D中的GFP-TNKS1点阵按大小分为小点阵（2–20像素）、中点阵（20–60像素）和大点阵（60–500像素），并显示了每个大小类别中每个单元格的平均点阵数。

值得注意的是，最近的研究表明，果蝇Axin水平增加三到四倍不足以抑制几乎所有无翅驱动的发育过程中的信号传导，从而建立了一个生理范围，在此范围内AXIN水平可能会波动，并且仍然与Wnt刺激后所有细胞中通路的激活兼容[25]。我们建议，在G007-LK治疗后，如果AXIN2水平没有显著增加，则不会超过该阈值。然而，不能排除AXIN1和AXIN2在降解体中的其他功能差异。

作者感谢Stefan Krauss和Jo Waaler提供G007-LK。我们进一步感谢奥斯陆大学医院先进光学显微镜核心设施提供相关显微镜的使用权，以及Anne Engen和她在细胞实验室设施中的同事为细胞培养物的专家处理提供便利。