GKT137831抑制NOX1/4：一种潜在的减轻视网膜神经胶质细胞炎症的新疗法
和
德维·德利扬蒂
澳大利亚维多利亚州墨尔本市商业路89号阿尔弗雷德医学研究与教育区蒙纳士大学免疫学系，邮编3004
詹妮弗·威尔金森-贝卡
澳大利亚维多利亚州墨尔本市商业路89号阿尔弗雷德医学研究与教育区蒙纳士大学免疫学系，邮编3004
澳大利亚维多利亚州墨尔本市商业路89号阿尔弗雷德医学研究与教育区6楼莫纳什大学免疫学系3004
通讯作者。 收到日期：2015年6月22日；2015年7月20日验收。
版权©Deliyanti和Wilkinson Berka。2015 摘要
背景
炎症和活性氧（ROS）的过度生成在缺血性视网膜病变（如糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变）的发病机制中起着重要作用。我们假设GKT137831是NADPH氧化酶（NOX）1和NOX4的双重抑制剂，通过抑制视网膜免疫细胞以及大胶质Müller细胞和神经元的促炎表型，减轻缺血视网膜的炎症。
方法
80%氧暴露可诱导Sprague-Dawley大鼠缺血性视网膜病变2以21%O循环2从出生后第0天（P）到第11天每天持续3小时，然后是室内空气（第12天到第18天）。在P12至P18（皮下注射60 mg/kg）给药GKT137831，并与房间空气对照组进行比较。通过测量白细胞对视网膜血管的粘附性、游离钙结合接合器蛋白-1阳性小胶质细胞/巨噬细胞以及视网膜疾病相关关键炎症因子的mRNA和蛋白水平来检测视网膜炎症。通过白蛋白ELISA定量神经胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞和血管渗漏来评估Müller细胞的损伤。为了验证GKT137831对参与缺血性视网膜病变的胶质细胞和神经元的抗炎作用，将大鼠视网膜小胶质细胞、Müller细胞和神经节细胞的原代培养物暴露于缺血、缺氧（0.5%）的体外对应物，并用GKT1370831治疗72小时。用二氢乙硫铵评估ROS水平，用定量PCR、ELISA和蛋白细胞因子阵列评估炎症因子的蛋白和基因表达。
结果
在缺血视网膜中，GKT137831降低了白细胞对血管系统的粘附增加、小胶质细胞和大胶质细胞的促炎表型、血管内皮生长因子、单核细胞趋化蛋白-1和白细胞粘附分子的基因和蛋白表达增加以及血管渗漏。在所有培养的细胞类型中，GKT137831降低了低氧诱导的ROS水平和各种炎症介质蛋白表达的增加。
结论
GKT137831对NOX1/4酶的抑制在视网膜中具有强大的抗炎作用，表明其有潜力治疗各种视觉威胁性视网膜病。
关键词：视网膜缺血、炎症、NADPH氧化酶、神经节细胞、小胶质细胞、米勒细胞
介绍
早产儿视网膜病变和糖尿病视网膜病变等缺血性视网膜病变分别是婴儿和工龄人群失明和失明的主要原因[1,2]. 目前的治疗方法，如激光光凝，用于减少这些疾病末期发生的严重微血管和组织损伤。然而，尽管这些治疗有些成功，但并不能阻止视网膜病变从早期到晚期的进展。针对参与缺血性视网膜病变发展的潜在机制的新策略具有相当大的兴趣。
炎症已成为缺血性视网膜病和其他视网膜疾病中血管损伤的一个重要因素，涉及循环白细胞和局部神经胶质炎症反应的作用[三,4]. 被称为小胶质细胞的常驻巨噬细胞的激活和增殖通过增加细胞因子的产生而损伤视网膜血管[5,6]和大胶质Müller细胞，它们在维持血-视网膜屏障中起着不可或缺的作用，成为胶质细胞并表现出促炎症表型[4,7,8]. 此外，激活的小胶质细胞产生的细胞因子增加会损伤神经节细胞[9]. 这些胶质细胞和神经元细胞群也是血管内皮生长因子（VEGF）的主要产生者，VEGF是缺血性视网膜中一种有效的血管生成和渗透因子[7,10]也有促炎作用，包括白细胞对组织的吸引[11].
介导这些炎症途径的一个中心机制是活性氧（ROS）的过度生成，它促进转录因子、缺氧诱导因子-1α的稳定，以增加VEGF和趋化因子（如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1））的表达[12–14]. 细胞因子和生长因子（包括白细胞介素（IL）-6和肿瘤坏死因子-α（TNFα））的刺激导致活性氧生成进一步增加，从而加剧组织炎症[14,15]. 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族在包括视网膜病在内的多种疾病中作为过量ROS产生源的作用引起了广泛关注[14]. 事实上，针对NADPH氧化酶的药理学方法一直是大量研究的主题，以开发相关和有效的药物治疗[16]. 现在人们意识到，以前的方法大多使用对NADPH氧化酶无特异性的药物，这可能是它们在临床上失败的原因[16].
NADPH氧化酶催化单元NOX存在于七种亚型（NOX1至5、DUOX1、DUOX2）中，这一发现导致了重大研究，以确定单个NOX亚型在各种疾病中的作用以及其抑制是否具有治疗潜力[16–20]. NOX1、2和4与缺血性视网膜病变的发病机制有关[21–24]吞噬细胞NOX2导致视网膜炎症[23,25]. 然而，由于NOX2在防御病原体方面的关键作用，完全阻断NOX2可能不完全适合作为人类的治疗方法[16,26]. 有趣的是，新出现的证据表明NOX1和NOX4具有促炎作用[19,27,28]. GKT137831是吡唑哌啶二酮家族的成员，是一种小分子，能有效抑制NOX1和NOX4（在使用异源过度表达特定NOX酶亚型的细胞制备的膜进行ROS生成的无细胞分析中，Ki在100–150 nM范围内）[29]. GKT137831的治疗潜力已在各种疾病动物模型中得到证明[19,29–32]目前正在诊所进行评估[16]. 然而，GKT137831的益处是否延伸到缺血性视网膜病变中发生的广泛视网膜炎症尚不清楚。在这里，我们使用早产儿视网膜病变大鼠模型，即氧诱导视网膜病变（OIR）和视网膜细胞的体外培养，证明GKT137831可以减弱参与缺血性视网膜病变的胶质细胞和神经元细胞的缺血/缺氧诱导的促炎表型。
方法
NOX1/4抑制
GKT137831（瑞士日内瓦Genkyotex SA）是NOX1和NOX4亚型（Ki 100–150 nM和E类最大>90 %). 在无细胞分析中，GKT137831对NOX2亚型的活性显著降低（Ki 1500 nM和E类最大60–70%），在无细胞分析中也是NOX2亚型的弱抑制剂，但在浓度高达100μM时，不能显著抑制中性粒细胞的氧化爆发，也不能抑制体内或体外固有微生物的杀灭（当使用浓度高达20μM或口服100 mg/kg时）。此外，GKT137831在高达100μM的浓度下测试时没有清除或抗氧化活性，并且对NOX1和NOX4酶具有极好的特异性，如广泛的体外非靶向药理学分析所示，其中包括170种不同的蛋白质，包括ROS生成酶和氧化还原敏感酶[30,31].
动物
所有程序均经阿尔弗雷德医学研究和教育区（AMREP）动物伦理委员会批准（申请E/1061/2011/M），并根据澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）的《科学研究中动物护理指南》执行。Sprague-Dawley大鼠购自动物资源中心（澳大利亚西部珀斯ARC）。
氧诱导视网膜病变
使用先前公布的方法在Sprague-Dawley大鼠中诱导OIR[33–35]. OIR的发展分为两个阶段，即血管增生（阶段I）和新生血管（阶段II）。在第一阶段，大鼠暴露于80%的氧2以21%O循环2在出生后第0天和第11天之间每天服用3小时。出生后12至18天，将大鼠置于室内空气中，发生OIR第二阶段。在整个研究中，对照组均在室内空气中。将垃圾随机分为两组，分别在P12和P18之间皮下注射（100μl）GKT137831（60 mg/kg/天）或溶媒（25%二甲基亚砜）。如果幼鼠出生后第3天的体重约为8克，则进入研究。每天测量幼崽的体重，产仔数保持在14只幼崽。GKT137831的剂量是基于之前的研究，在这些研究中它有效地减少了血管疾病[33]. 在出生后第18天用戊巴比妥钠（170 mg/ml，澳大利亚新南威尔士州Virbac）杀死大鼠。
OIR小胶质细胞和Müller细胞胶质增生症的免疫组织化学研究
使用既定方法[33,35]将3μm石蜡切片与电离钙结合适配器分子1（Iba1）抗体在4°C下孵育过夜，以检测小胶质细胞（1:1000，日本东京，Wako）和胶质纤维酸性蛋白，以检测胶质增生症（GFAP，1:500，DakoCytomation，Glostrup，丹麦）。每个实验中包括一个不含初级抗体的阴性对照和一个同型IgG对照。用Vectastain ABC标准试剂盒（Vector Laboratories Inc.，CA，USA）和液体DAB+底物染色系统（DakoCytomation）对用Iba1孵育的切片进行免疫标记。在用Alexa Fluro 488-共轭山羊抗兔IgG（1:200，澳大利亚维多利亚州生命技术公司）孵育切片后，可以观察到GFAP的免疫标记。为了定量，从每只眼睛中随机选择四个相距至少60μm的切片。在每一节中，使用Spot数码相机（澳大利亚维多利亚州科学技术中心）以400倍放大率拍摄横跨整个视网膜的四个非重叠区域。Image J软件用于设置免疫标记的阈值，该阈值应用于所有领域。对于Iba1，在视网膜内部（从视网膜表面到内网状层）进行免疫标记量化，对于GFAP，对所有视网膜层进行采样。每组评估5-6只大鼠。
视网膜白细胞抑制
遵循先前发布的方法[33,36]，大鼠右心房灌注0.1 M磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4），以清除血细胞，然后用罗丹明结合的伴刀豆球蛋白A凝集素（0.25 mg/kg，Vector Laboratories）染色粘附的白细胞和内皮细胞。将眼睛固定在0.1M磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中的4%多聚甲醛中30分钟，并平板安装视网膜。在放大200倍的条件下拍摄非重叠图像，并计算每个视网膜的白细胞数量。每组评估6至9只大鼠。
视网膜血管渗漏
按照制造商的说明，使用商用大鼠白蛋白ELISA定量仪（美国德克萨斯州蒙哥马利市Bethyl实验室）测量新鲜冷冻的单个视网膜中的白蛋白水平，如前所述[37]. 白蛋白值标准化为干视网膜重量。每组评估6至7只大鼠。
视网膜中VEGF、MCP-1和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的蛋白水平
如前所述测量VEGF和MCP-1[37]. 简言之，收集视网膜裂解物的上清液，并根据制造商的方案，使用Bradford比色法（Bio-Rad Laboratories，NSW，Australia）对总蛋白浓度进行定量。然后使用市售大鼠VEGF、ICAM-1（美国明尼苏达州R&D Systems）和MCP-1 ELISA试剂盒（美国加利福尼亚州BD Biosciences）对未稀释上清液进行分析。所有程序均按照制造商的说明进行。每组评估6只大鼠。
实时PCR
根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Doncaster，VIC，Australia）分离总RNA，然后对1μg RNA进行DNA酶处理（无DNA-free试剂盒，Ambion，Carlsbad，CA，USA）和反转录（First Strand cDNA合成试剂盒，Roche，Switzerland）。为了定量评估mRNA表达，将基因特异性引物和cDNA（20 ng）与SYBR Master Mix（Invitrogen）混合，并使用ABI 7900 HT序列检测系统（Applied Biosystems）进行实时PCR[34]. mRNA表达归一化为18s rRNA内源性控制，并使用比较2-ΔΔCt方法[34]. 该研究中使用的引物序列之前已发表[37]除血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）、正向引物-5′GGCAGTCCCACTTCTT3′和反向引物-5’TGTGTACTCACATCCATTTCTG3′外。每组评估6至10只大鼠。
大鼠视网膜小胶质细胞和Müller细胞的原代培养
原代培养按之前公布的方法进行[33,35,37]. 简单地说，从4至6天龄的Sprague-Dawley大鼠收集视网膜，消化，悬浮在培养基（低葡萄糖DMEM，Gibco，NY，USA）中，培养至10至12天达到融合。然后在37°C下以200 rpm摇晃烧瓶3 h，以去除小胶质细胞。摇晃后，取下培养上清液，将剩余细胞涂布在聚-D-赖氨酸涂层的6孔板或盖玻片上。小胶质细胞和Müller细胞的特征如前所述[33,35,37]. 细胞暴露于缺氧（0.5%O2，94.5%氮2和5%CO2)在模块化培养箱（MIC101；QNA International Pty Ltd，VIC，Australia）中培养4、8、16或72小时。对暴露于常压下的细胞进行比较。实验重复三到四次，每个实验至少重复三次。
大鼠视网膜神经节细胞的原代培养
如前所述进行原代培养，并进行了一些小的修改[35,38]. 收集3日龄Sprague-Dawley大鼠的视网膜，并在37°C的Hanks平衡盐溶液（HBSS，无Ca）中消化10分钟2+/镁2+，Gibco），添加0.2 g/L胰蛋白酶和80 U/ml DNase I。通过在HBSS中添加0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂（Gibco。将细胞悬液通过40μM尼龙网（BD Biosciences，CA，USA），转移到涂有BS-1凝集素（10μg/ml，Sigma）的负摇板上，并在室温下培养30分钟以去除小胶质细胞。然后将细胞转移到涂有山羊抗鼠IgM（10μg/ml，链特异性，Jackson ImmunoResearch，PA，USA）鼠抗鼠Thy1.1抗体（10μg/ml，克隆T11D7e，Serotec，Oxford，UK）的阳性平板上，并在室温下孵育45分钟。用HBSS彻底清洗非粘附细胞。通过胰蛋白酶（0.25%，Gibco）收集结合的细胞。将神经节细胞置于视网膜神经节细胞培养基（神经基底培养基A[Invitrogen，Carlsbad，CA，USA]，1×B27补充剂[Gibco]，2 mM谷氨酰胺，10%透析FBS[Gibco]）中的聚-D-赖氨酸（10μg/ml，Sigma）和层粘连蛋白（50μg/ml）涂层盖玻片或24孔板上、100μM forskolin、25 ng/ml睫状神经营养因子、10 ng/ml脑源性神经营养因子和1×青霉素-链霉素溶液[Sigma]）。实验在隔离7天后进行。视网膜神经节细胞的特征如前所述[35]. GKT137831溶于载体（0.0001%二甲基亚砜）中。神经节细胞暴露于缺氧（0.5%O2，94.5%氮2和5%CO2)在模块化培养箱中培养4和16小时。将其与暴露于常氧的细胞进行比较。实验重复三到四次，每次重复三次。
大鼠视网膜小胶质细胞、Müller细胞和神经节细胞中的ROS水平
如前所述测量ROS水平[33]. 用HBSS清洗原代培养细胞2分钟，然后用5μM二氢乙锭在37°C和5%CO中培养30分钟2在黑暗中。孵育后，用HBSS清洗细胞，然后立即使用Eclipse TE2000倒置荧光显微镜（尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔）和图像处理计算机软件（NIS-Elements版本2.20，尼康仪器有限公司）成像。使用Image J分析软件（1.44版，美国马里兰州贝塞斯达），将细胞的荧光强度用作细胞内活性氧水平的测量。对于定量，从每个培养皿的三个不同区域中随机选择至少15个细胞进行评估。测量两个细胞之间空白处的荧光强度作为背景强度。每组进行三到四个独立实验，至少重复三次。
培养视网膜细胞中炎症介质的蛋白水平
根据制造商的说明，使用大鼠细胞因子抗体阵列测量培养大鼠小胶质细胞上清液中细胞因子的蛋白质水平（澳大利亚研发系统公司）。在培养的大鼠米勒细胞上清液中测量MCP-1、VEGF和可溶性ICAM-1（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）以及IL-6（R&D Systems Inc.）的蛋白水平，并使用商用ELISA试剂盒在培养的鼠神经节细胞中测量VEGF。
统计
所有数据均使用GraphPad Prism软件（第5版，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析。通过Pearson、Shapiro-Wilk和Kolmogoro-Smirnov正态性检验评估正态性。通过使用单向方差分析进行分析，然后对比较数和未配对数进行适当的事后分析校正t吨测试（参数）或Kruskal-Wallis测试，然后是Mann-WhitneyU型测试（非参数）。调查人员被蒙面告知这些团体。值为P（P）<0.05被认为是显著的。
结果
GKT137831减少OIR中Iba1阳性小胶质细胞和白细胞沉积
与房间空气对照组相比，OIR与视网膜小胶质细胞密度增加有关，这可以通过Iba1的免疫标记来证明[33,37]. 这发生在本研究中，OIR对照大鼠的小胶质细胞通常局限于伸出玻璃体腔的血管（图到). 在OIR大鼠中，GKT137831将Iba1免疫标记降低到房间空气控制水平（图到). 由于白细胞粘附在视网膜血管系统上有助于缺血性视网膜病的发展[11]，我们用OIR评估了大鼠视网膜白细胞沉积。在OIR对照组中，与房间空气对照组相比，视网膜白细胞沉积增加。在OIR大鼠中，GKT137831降低了视网膜白细胞淤积（图到).
在OIR中，GKT137831降低了小胶质细胞的Iba1免疫标记和白细胞抑制。GKT137831（GKT）。一–c（c）用电离钙结合适配器分子1（Iba1，箭头). 与房间空气对照组相比，OIR对照组的Iba1免疫标记增加，并且在OIR对照中，Iba1存在于视网膜前血管中(星号)突出到玻璃体腔中。在OIR中，GKT治疗降低了Iba1免疫标记。比例尺=40μm。GCL公司神经节细胞层，IPL公司内网状层，印度卢比内核层。d日在视网膜内部（从视网膜表面到IPL）定量Iba1免疫标记。n个=每组5至6只大鼠。e（电子）–克灌注伴刀豆球蛋白A以显示白细胞的大鼠的代表性全视网膜(箭头)粘附在视网膜血管系统上。与房间空气控制相比，OIR控制中的白细胞淤积增加。在OIR中，GKT治疗可减少白细胞抑制。比例尺=40μm。小时对整个视网膜的白细胞淤积进行量化。n个=每组6至9只大鼠**P（P）<0.01至房间空气控制##P（P）<0.01至OIR控制。数值为平均值±SEM
GKT137831降低OIR中促炎症介质的表达
由于促炎介质的上调是OIR的一个特征，因此在视网膜中测量这些因素[33,37]. 与房间空气对照组相比，OIR导致VEGF、MCP-1和ICAM-1的mRNA和蛋白水平增加，以及血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和PECAM-1的mRNA水平增加（图到). 在OIR大鼠中，GKT137831降低了所有炎症因子（图到).
在OIR中，GKT137831减少了视网膜中的炎症介质。GKT137831（GKT）。用定量PCR法测定整个视网膜的mRNA水平。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定整个视网膜的蛋白质水平。一,b条VEGF mRNA和蛋白。c（c）,d日MCP-1 mRNA和蛋白。e（电子）,（f）ICAM-1 mRNA和蛋白。克VCAM-1 mRNA。小时PECAM-1 mRNA*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001至房间空气控制#P（P）<0.05, ##P（P）<0.01，以及###P（P）<0.001至OIR控制。n个=每组9至10只大鼠。数值为平均值±SEM
GKT137831减少OIR患者视网膜胶质增生和血管渗漏
GFAP免疫标记可以可靠地检测视网膜胶质增生[4]. 在房间空气控制中，GFAP免疫标记仅限于视网膜表面（图)而在OIR对照组中，GFAP免疫标记存在于延伸视网膜宽度的Müller细胞突起中（图). 在OIR大鼠中，GKT137831降低了GFAP标记（图和). Müller细胞胶质增生症与血-视网膜屏障的破坏有关[4]，测量血管渗漏。与对照组相比，OIR对照组的血管渗漏增加。在接受GKT137831治疗的OIR大鼠中，与OIR对照组相比，血管渗漏减少（图).
在OIR中，GKT137831减少了视网膜Müller细胞胶质增生和血管渗漏。GKT137831（GKT）。一–c（c）用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫标记的视网膜代表性3μm石蜡切片。GCL公司神经节细胞层，印度卢比内核层，ONL公司外核层。在房间空气控制中，在视网膜表面检测到GFAP免疫标记(星号)，而在OIR对照中，GFAP免疫标记在Müller细胞过程中延伸到整个视网膜(箭头). 在接受GKT137831治疗的OIR大鼠中，与OIR对照组相比，GFAP免疫标记降低。比例尺=40μm。d日对整个视网膜进行GFAP免疫标记定量。n个=每组5至6只大鼠。e（电子）用白蛋白ELISA法检测单个视网膜的血管渗漏。n个=每组6至7只大鼠*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001至房间空气控制##P（P）与OIR对照组相比<0.01。数值为平均值±SEM
GKT137831降低缺氧条件下视网膜小胶质细胞中ROS水平和炎症介质的表达
由于小胶质细胞是视网膜中主要的常驻炎症细胞，我们检测了ROS水平和与缺血性视网膜病相关的各种炎症介质的表达。小胶质细胞暴露于低氧4小时导致NOX1、NOX2和NOX4的mRNA水平增加，到16小时，NOX1和NOX4 mRNA水平仍然升高（表). 随后的实验在16小时进行，以最大限度地增加蛋白质表达。缺氧16小时后，与常氧对照组相比，ROS水平升高（图和). 此外，VEGF、IL-6、TNFα、IL-1β、ICAM-1、CINC2、CINC3、RANTES（激活调节，正常T细胞表达和分泌）、CXCL3、CXCL5、干扰素的蛋白水平ϒ（干扰素ϒ)与常氧对照组相比，缺氧使MCP-1增加（图到). GKT137831降低低氧诱导的ROS和炎症介质增加（图到).
表1
大鼠视网膜小胶质细胞、Müller细胞和神经节细胞原代培养中NOX1、NOX2和NOX4的mRNA水平
| 小胶质细胞 | 米勒细胞 | 神经节细胞 |
|---|
| 4小时 | 16小时 | 8小时 | 72小时 | 8小时 | 16小时 |
|---|
| NOX1（氮氧化物1） |
| N个 | 1.01±0.01 | 1.01 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.01 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.00 |
| H（H） | 1.31±0.06** | 3.06 ± 0.28** | 0.90 ± 0.13 | 1.63 ± 0.11** | 2.90 ± 0.25* | 2.45 ± 0.47* |
| 二氧化氮 |
| N个 | 1.00 ± 0.00 | 1.02 ± 0.02 | 1.04 ± 0.04 | 1.01±0.01 | 1.02 ± 0.01 | 1.06 ± 0.04 |
| H（H） | 2.15 ± 0.21** | 0.93 ± 0.07 | 0.87 ± 0.11 | 1.16 ± 0.18 | 1.26 ± 0.52 | 1.12 ± 0.21 |
| 氮氧化物4 |
| N个 | 1.01 ± 0.01 | 1.01 ± 0.01 | 1.00 ± 0.00 | 1.00 ± 0.01 | 1.03 ± 0.02 | 1.01 ± 0.00 |
| H（H） | 1.66 ± 0.11*** | 1.77 ± 0.04*** | 0.96 ± 0.04 | 0.70 ± 0.14 | 1.02 ± 0.10 | 1.01 ± 0.12 |
在培养的小胶质细胞中，升高的ROS和炎症介质的蛋白水平用GKT137831降低。N个常氧控制（21%O2),H（H）低氧控制（0.5%O2). GKT137831（GKT），5μM。大鼠视网膜小胶质细胞的原代培养暴露于常压、缺氧和GKT中16小时。一活性氧水平的定量。b条用二氢乙硫酸氢钠标记视网膜小胶质细胞的显微照片来检测活性氧。比例尺=100μm。c（c）–n个用大鼠细胞因子抗体阵列测定炎症介质的蛋白水平。c（c）血管内皮生长因子。d日IL-6。e（电子）肿瘤坏死因子α。（f）IL-1β。克可溶性ICAM-1（sICAM-1）。小时CINC2。我CINC3。j个兰特斯。k个CXCL3。我CXCL5。米干扰素ϒ.n个MCP-1*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001至常氧对照#P（P）<0.05和##P（P）缺氧控制<0.01。数值为平均值±SEM。n个=3至4个独立实验，一式三份
GKT137831降低缺氧条件下视网膜Müller细胞中ROS水平和炎症介质的表达
作为大胶质细胞，Müller细胞在视网膜稳态中起着重要作用[4]，我们检测了Müller细胞损伤时ROS水平和炎症介质的表达上调[7,39,40]. Müller细胞缺氧8和72小时导致NOX1 mRNA水平升高，但NOX2 mRNA和NOX4 mRNA水平没有升高（表). 随后的实验在72小时后进行，与常氧对照组相比，缺氧导致活性氧水平升高（图和). 与常氧对照组相比，缺氧增加了VEGF、IL-6、可溶性ICAM-1和MCP-1的蛋白水平（图到). GKT137831降低低氧诱导的ROS和炎症介质增加（图到).
在培养的Müller细胞中，GKT137831可降低炎症介质的ROS和蛋白水平升高。N个常氧对照（21%O2),H（H）低氧控制（0.5%O2). GKT137831（GKT），5μM。大鼠视网膜Müller细胞的原代培养暴露于常氧、缺氧和GKT 72小时。一活性氧水平的定量。b条用二氢乙炔标记视网膜Müller细胞的显微照片检测活性氧。比例尺=100μm。c（c）–（f）用ELISA测定蛋白质水平。c（c）血管内皮生长因子。d日IL-6。e（电子）可溶性ICAM-1（sICAM-1）。（f）MCP-1*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001至常氧对照#P（P）< 0.05, ##P（P）<0.01，以及###P（P）缺氧控制<0.001。数值为平均值±SEM。n个=3至4个独立实验，一式三份
GKT137831降低缺氧条件下视网膜神经节细胞ROS水平和VEGF表达
神经节细胞缺氧4和16小时导致NOX1 mRNA水平升高，但NOX2 mRNA和NOX4 mRNA水平没有升高（表). 随后的实验在16小时进行，与常压对照组相比，缺氧会增加ROS水平和VEGF蛋白水平（图和). GKT137831降低低氧诱导的ROS和VEGF增加（图).
在培养的视网膜神经节细胞中，GKT137831降低了ROS和VEGF蛋白水平的升高。N个常氧控制（21%O2),H（H）低氧控制（0.5%O2). GKT137831（GKT），5海里。大鼠视网膜神经节细胞的原代培养暴露于常压、缺氧和GKT中16小时。一用二氢乙硫酸氢钠标记视网膜神经节细胞的显微照片来检测活性氧。比例尺=100μm。b条活性氧水平的定量。c（c）通过ELISA测定VEGF蛋白水平**P（P）<0.01和***P（P）<0.001至常氧对照##P（P）<0.01和###P（P）缺氧控制<0.001。数值为平均值±SEM。n个=3-4个独立实验，一式三份
讨论
过量ROS的慢性产生是包括视网膜在内的炎症性疾病发展的核心[14,41]. 新的证据表明，ROS源于NOX1，NOX4有助于组织炎症[27,28]因此，针对这些NOX亚型的特异性抑制剂的开发可能对各种炎症疾病具有治疗潜力。我们之前报道过GKT137831对NOX1/4的双重抑制可以减少OIR诱导的ROS水平升高和视网膜新生血管形成[33]. 本研究首次证明，在OIRⅡ期组织缺血开始时给予GKT137831具有显著的抗炎作用，表现为循环白细胞对视网膜血管系统的粘附性降低，以及视网膜小胶质细胞、大胶质细胞、，神经节细胞。我们的体外研究与OIR II期相似，表明在研究的时间点，缺氧诱导NOX1和/或NOX4上调，GKT137831对神经胶质细胞群具有直接的抗炎作用。
白细胞粘附视网膜血管增加是缺血性视网膜病变的一个特征[11,42]. 事实上，在OIR模型中，白细胞粘附分子如ICAM-1和VCAM-1的表达增加[42,43]以及化学引诱剂如RANTES在早产儿视网膜病变儿童的玻璃体液中升高[44]. 与全身炎症导致OIR的概念相一致的是，玻璃体巨噬细胞被吸引并参与视网膜新生血管形成[45]. GKT137831降低OIR中视网膜白细胞滞留的能力以及视网膜中MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和PECAM-1的表达表明，GKT137.831阻断白细胞对视网膜血管的粘附。这一观点与NOX1参与细胞因子诱导的单核细胞与血管平滑肌细胞粘附的证据相一致[46].
小胶质细胞参与视网膜炎症是复杂的，因为这种细胞类型从保护性、分支性和M2表型转变为具有M1特性的活化和变形虫形状的细胞[47]. 在缺氧或其他应激源引起的激活状态下，小胶质细胞是趋化因子、粘附分子、细胞因子和生长因子的主要来源，对视网膜中的各种细胞类型产生有害影响[6]. 全身炎症可能有助于证明给小鼠注射脂多糖导致视网膜小胶质细胞活化[48]. 在本研究中，GKT137831对OIR中Iba1阳性小胶质细胞的减少表明，由于抑制NOX1/4衍生的ROS，对该细胞群具有保护作用。然而，人们认识到Iba1也标记巨噬细胞，因此，这种细胞类型可能有助于我们评估视网膜小胶质细胞。通过利用缺氧条件下视网膜小胶质细胞的原代培养物模拟OIRⅡ期发生的缺血，我们能够直接评估该细胞群，并显示NOX1、NOX4和ROS水平升高。GKT137831能够减少低氧诱导的ROS和炎症分子VEGF、IL-6和TNFα的增加，这表明NOX1/4的双重抑制对视网膜关键免疫活性细胞具有强大的抗炎作用。GKT137831的抗炎特性延伸至白细胞募集分子的减少，包括MCP-1、RANTES、CINC2、CINC3、CXCL3和CXCL5以及ICAM-1和VCAM-1，并强调了该药物抑制激活的视网膜小胶质细胞产生的强烈促炎信号的能力。我们的发现与最近的报告一致，报告显示GKT137831减少了糖尿病肾脏中巨噬细胞的浸润[49]动脉粥样硬化的T细胞数量[19]. 我们研究的局限性在于，我们没有评估抑制视网膜小胶质细胞中NOX1/4衍生的活性氧是否是保护视网膜其他胶质细胞和神经元免受缺氧介导损伤的主要事件[9,39]. 当然，视网膜炎症这方面的未来研究值得关注。
大胶质Müller细胞具有许多对视网膜稳态至关重要的功能，包括神经保护、抑制炎症和维持血-视网膜屏障[4]. 受伤时，Müller细胞表现出促炎表型[4]MCP-1和ICAM-1表达增加[50,51]. 通过测量中间丝标记物GFAP，有力地证明了Müller细胞的健康状况[4]. 在未受损的视网膜中，GFAP的表达仅限于视网膜表面的星形胶质细胞，而在疾病中，Müller细胞沿其细胞突起显示GFAP，几乎覆盖整个视网膜宽度[4,6,8]. 在OIR中，Müller细胞胶质增生和炎症是血-肠屏障破坏的主要原因[4,52]. GKT137831在Müller细胞中的抗炎作用表明，这转化为预防OIR中的胶质增生和血管渗漏。我们在培养的Müller细胞中的发现证实了GKT137831的抗炎特性，并且NOX1在缺氧反应中的上调表明，NOX亚型可能参与ROS介导Müler细胞的炎症效应。
一项重要发现是GKT137831能够降低小胶质细胞、米勒细胞和神经节细胞中的VEGF。VEGF强大的促血管生成和促渗透作用已被充分证明，并成为贝伐单抗等治疗糖尿病视网膜病变的基础[53]. 此外，VEGF是一种有效的化学引诱剂，可刺激视网膜中ICAM-1表达增加和白细胞粘附[11]. 在之前的研究中，我们证明GKT137831减少了OIR大鼠和小鼠的视网膜新生血管[33]但没有详细评估GKT137831调节VEGF表达的视网膜细胞类型。我们在当前研究中的发现表明，GKT137831在缺血性视网膜病中的作用涉及神经胶质细胞群中放大的VEGF水平的减弱。此外，视网膜神经节细胞对OIRⅡ期VEGF的生成起着重要作用[10]，主要表达NOX1。这一发现与之前的一项研究一致，该研究表明缺氧和葡萄糖剥夺可诱导视网膜神经节细胞中NOX亚型的表达[54].
结论
越来越多的证据表明，源于NOX特定亚型的活性氧与视网膜疾病有关。在这里，我们描述了一种特定NOX1/4抑制剂GKT137831减轻视网膜和神经胶质细胞缺血诱导炎症的能力。GKT137831目前正在临床开发中，尽管用于其他疾病。我们的研究结果表明，抑制NOX1/4可能为炎症性眼病提供了一种新的治疗策略，其特征是这些NOX亚型过度产生ROS。
致谢
JWB是澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的高级研究员。
缩写
| GFAP公司 | 胶质纤维酸性蛋白 |
| GKT公司 | GKT137831号 |
| 哈佛商学院 | 汉克斯平衡盐溶液 |
| 伊巴1 | 电离钙结合适配器分子1 |
| ICAM-1公司 | 细胞间粘附分子-1 |
| 伊利诺伊州 | 白细胞介素 |
| MCP-1型 | 单核细胞趋化蛋白-1 |
| NADPH公司 | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 |
| OIR公司 | 氧诱导视网膜病变 |
| PECAM-1型 | 血小板内皮细胞黏附分子-1 |
| 兰特斯 | 调节激活正常T细胞表达 |
| ROS公司 | 活性氧物种 |
| 肿瘤坏死因子α | 肿瘤坏死因子-α |
| VCAM-1型 | 血管细胞粘附分子-1 |
| 血管内皮生长因子 | 血管内皮生长因子 |
脚注
竞争性利益
作者声明，他们没有相互竞争的利益。
作者的贡献
DD和JWB设计了研究。DD进行了实验，JWB在DD的编辑协助下编写了手稿。两位作者都阅读并批准了手稿的最终版本。
工具书类
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