In Silico Analysis of Tumor Necrosis Factor α-Induced Protein 8-Like-1 (TIPE1) Protein

Pei Shen; Hong Zhang; Zhaoliang Su; Shengjun Wang; Huaxi Xu

doi:10.1371/journal.pone.0134114

公共科学图书馆一号。2015; 10（7）：e0134114。

2015年7月24日在线发布。数字对象标识：10.1371/日志.文件.0134114

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PMID：26207809

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8-Like-1（TIPE1）蛋白的硅内分析

佩申（Pei Shen）,^#^1,^三 Hong Zhang（张红）,^#² 苏兆良,¹ 王胜军（Shengjun Wang）,¹和徐华西^1,^*

Eugene A.Permyakov，编辑器

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关联数据

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摘要

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（TNFAIP8）样蛋白1（TIPE1）是肿瘤坏死因子诱导蛋白8家族的成员。已有研究表明TIPE1可诱导肝癌细胞凋亡。在本研究中，我们试图预测其潜在结构。利用生物信息网络服务或软件对TIPE1进行生物信息学分析，预测其潜在结构。结果表明，TIPE1的氨基酸序列在哺乳动物中具有很好的保守性。人TIPE1中不存在信号肽和跨膜结构域。TIPE1的脂肪指数为100.75，理论pI为9.57。TIPE1是一种稳定的蛋白质，其亲水性总平均值为-0.108。推测TIPE1中也存在各种翻译后修饰。此外，Swiss-Model Server和Swiss-Pdb Viewer程序的结果表明，预测的TIPE1蛋白三维结构是稳定的，可能符合立体化学的规律。TIPE1可以与FBXW5、caspase8等相互作用。总之，TIPE1可能是一种无信号肽、无跨膜结构域的稳定蛋白。TIPE1的生物信息学分析将为进一步研究TIPE1功能奠定基础。

介绍

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（TNFAIP8）是肿瘤坏死因子诱导蛋白8家族的第一个成员，最初是通过比较两个原发和两个匹配的转移性头颈部鳞癌（HNSCC）细胞系，使用northern blot和mRNA差异显示方法鉴定的[1]. 然后利用高通量基因芯片技术对TNFAIP8家族的其他成员进行了连续鉴定[2]. 迄今为止，TNFAIP8家族至少包含四个成员，包括TNFAIP9（也称为SCC-S2）、TNFAIP8-like protein 1（TNFAIP8l 1，TIPE1）、TNFAIP8-likeprotein 2（TNFAIP 8l 2，TIPE2）、TNFAIP8-lique protein 3（TNFAI8l 3，TIPE3）[2–5]. TNFAIP8家族所有成员高度同源，参与多种细胞行为，尤其是细胞凋亡和细胞增殖[2,三,6].

先前的研究主要集中在TNFAIP8和TIPE2的功能和结构研究上。Kumar等人证明，TNFAIP8含有死亡效应域（DED），是某些细胞类型凋亡的负调控因子[三]. Sun等人报道，TIPE2是一种负调控因子，参与免疫稳态的调节[2]. TIPE2在免疫中的功能可能与其疏水性中心腔有关，疏水性中心腔可以与辅助因子结合[7]. 最近，Fayngerts等人还表明，TIPE3作为磷酸肌醇第二信使的转移蛋白，具有更大的疏水腔，其在人类癌细胞中的表达增加[8]. 虽然先前的研究表明TIPE1可以通过调节Rac1诱导肝细胞癌（HCC）细胞凋亡，但对其结构知之甚少[9]. 因此，我们尝试在本研究中使用生物信息学方法预测其潜在结构。

材料和方法

序列检索与同源树构建

从NCBI中获得了人类、牛牛、无尾熊、褐家鼠、泛长臂猿、臭鼬、猕猴、家蚕、白颈Ficedula albicollis、绵羊、猫科动物、小家鼠、灰仓鼠和猕猴等不同物种TIPE1的全部序列。使用DNAMAN软件进行多重序列比对，并构建同源树。

TIPE1的生物信息学分析

人类TIPE1的信号肽由生物序列分析中心（CBS）平台的SignaIP-4.1服务器预测，该工具的网站是http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP网站/.TMpred程序(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)然后用于预测TIPE1的跨膜区域及其相关方向。在expasy平台上使用Protscale Server对TIPE1的亲水性、可接近性、极性、柔韧性、变异性、体积和折射率进行了预测(http://web.expasy.org/portscale/). 在CBS预测的服务器中，还预测了TIPE1蛋白的翻译后修饰，包括甘露糖基化位点、糖基化位置、磷酸化位点和激酶特异性磷酸化位点等(http://www.cbs.dtu.dk/services网站/). 然后通过expasy平台上的Protparam Server验证TIPE1的各种生理参数(http://web.expasy.org/portparam/).

TIPE1的同调建模与分析

使用expasy平台的Swiss-Model对TIPE1进行同源建模(http://swissmodel.expasy.org/). 然后利用Swiss-PdbViewer程序的Ramachandran图对预测结果进行分析。

TIPE1的蛋白质相互作用分析

蛋白质相互作用研究是使用检索相互作用基因和蛋白质的搜索工具（STRING）进行的，该工具是已知和预测蛋白质相互作用的数据库。

结果

序列检索与同源树构建

在所有序列中，人类TIPE1的氨基酸序列(NP_689575号和NP_001161414)提供如下：MDTFSTKSLALQAQKKLLLSKMASKAVVAVLVDTSSEVLDELYRATREFTRSRKEAQKMLKNLVKVALKLLRGDQLGGEELALLRFRHRARCLAMTAVSFHQVDFTFDRRVLAAGLLECRDLHQAVGPHLTAKSGRINHVFGHLADCDFLALYGPAEPYRSHLRICEGLMLDEGSL-

利用DNAMAN软件对不同物种的序列进行比对，然后用DNAMAN构建同源树，以显示不同物种TIPE1的同源性。结果如所示图1不同物种的TIPE1具有高度的序列同源性，其氨基酸序列在哺乳动物中具有很好的保守性。

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图1

同源树构造。

通过DNAMAN软件构建同源树，并显示了来自不同物种的TIPE1的同源性。

TIPE1信号肽和跨膜结构域的预测

使用SignaIP Server预测TIPE1的信号肽[10]结果显示为图2从SignaIP服务器获得的所有分数，包括C-、S-和Y-分数，均低于标准值（0.5）。以及图2A提示TIPE1序列中不存在信号肽。

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图2

TIPE1信号肽和跨膜结构域的预测。

TIPE1的信号肽（A）和跨膜结构域（B）分别由SignaIP Server和TMpred Server预测。X轴表示从N端到C端的氨基酸序列。Y轴表示每个服务器计算的分数。

然后利用TMpred Server预测TIPE1的跨膜结构域。结果如所示图2B最大值为459，相关核心区域从146 aa到166 aa。这可能是一个从内到外的跨板螺旋。然而，只有500分以上的预测分数在TMpred服务器中才被认为是显著的，并且146 aa到166 aa的螺旋线可能不显著，因为其值为459。

TIPE1亲水性、可接近性、极性、柔韧性、变异性和膨胀性的预测

然后利用expasy平台提供的Protscale Server对TIPE1的亲水性、可访问性、极性、灵活性、可变性和笨重性进行了分析。得分越高表示TIPE1的每个参数的概率越高。因此，亲水性值(图3A)在-1.100（位置159 aa）和1.711（位置51 aa）之间。可访问性值(图3B)Janin评分表示球状蛋白质从内部到外部的转移自由能，其值介于-0.867（位置54 aa）和0.356（位置100 aa）之间。极性值(图3C)介于0.422（位置159 aa）和34.826（位置92 aa）之间，而平均柔度值(图3D)在0.373（位置101 aa）和0.502（位置79 aa）之间。相对可变性值(图3E)在46.556（位置72 aa）和96.778（位置36 aa）之间。笨重值(图3F)在11.017（位置79 aa）和18.120（位置64和66 aa）之间。

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图3

预测TIPE1的亲水性、可接近性、极性、柔韧性、变异性和膨胀性。

利用expasy平台的Protscale Server预测了TIPE1的亲水性（A）、可达性（B）、极性（C）、柔韧性（D）、变异性（E）和膨松性（F）。X轴表示从N端到C端的氨基酸序列。Y轴表示每个算法计算的分数。

TIPE1的翻译后修改

然后在CBS预测服务器中预测各种翻译后修饰。首先，使用NetAcet Server预测N-末端乙酰化位点，结果表明TIPE1中不存在乙酰化位点。其次，使用NetCGlyc Server预测C-甘露糖基化位点，使用NetNGlyc Server预计TIPE1的N-连接糖基化部位。然而，在TIPE1的氨基酸序列中既没有发现C-甘露糖基化位点，也没有发现N-连接的糖基化位点。同时，使用NetOGlyc Server预测TIPE1中粘蛋白型O-GalNAc糖基化位点，结果表明，TIPE1中存在三个O-GalNAc糖基化位点，分别位于42aa、46aa、54aa和268aa的位置。

此外，还使用NetPhos Server和NetPhosK Server分析TIPE1中的一般磷酸化位点和激酶特异性磷酸化位点。结果表明，TIPE1蛋白中也存在蛋白激酶C（PKC）位点（5位、19位、52位、103位、110位、136位）和蛋白激酶A（PKA）位点（8位）(图4A). 然而，在TIPE1中未发现p38 MAPK和蛋白激酶B（PKB）位点。同时，TIPE1中可能存在四个丝氨酸磷酸化位点（位置5 aa、19 aa、35 aa和52 aa）、四个苏氨酸磷酸化部位（位置6 aa、34 aa、50 aa和136 aa）和一个酪氨酸磷酸化位置（位置166 aa(图4B).

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图4

TIPE1的翻译后修改。

（A）使用NetPhosK Server预测TIPE1中的激酶特异性磷酸化位点。（B）使用NetPhos Server预测TIPE1中的一般磷酸化位点。X轴表示从N端到C端的氨基酸序列。Y轴表示软件计算的值。高于阈值的值意味着磷酸化的可能性最大。

TIPE1的生理参数

ProtParam Server用于预测各种生理参数。结果表明，预测的分子量为20827.2道尔顿，理论pI为9.57。推测公式为C₉₁₈H（H）₁₅₀₅N个₂₇₅O（运行）₂₅₉S公司₉原子总数为2966。TIPE1的估计半衰期分别为30小时（哺乳动物网织红细胞，体外）和>20小时（酵母，体内）。此外，不稳定性指数预计为35.94，这表明TIPE1是一种稳定的蛋白质。同时，脂肪指数为100.75，而亲水性总平均值（GRAVY）为-0.108。

同调建模与模型稳定性评价

Swiss-Model Server在expasy网络中进行同源建模，TIPE1蛋白的预测三维（3D）结构如所示图5A然后使用拉马钱德兰图方法评估模型质量(图5B)结果表明，TIPE1在离群值区域有0.6%的残基。能量最小化方法得到的值为-20599.754 KJ/mol。根据这些数据，Ramachandran图的结果表明，TIPE1蛋白的三维结构模型可能具有可接受的稳定性，并且符合立体化学的规则。

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图5

同调建模和模型稳定性评估。

（A）通过Swiss-Model Server进行同源建模，并显示TIPE1蛋白的预测三维结构。（B）使用Ramachandran图的方法评估模型质量，结果表明TIPE1蛋白的3D结构具有可接受的稳定性。

TIPE1的蛋白质相互作用分析

STRING平台是已知和预测蛋白质相互作用的数据库[11,12]. 如中所示的结果图6，TIPE1蛋白可能与含有F-box和WD重复结构域的5（FBXW5）、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶10、蛋白酶体成熟蛋白（POMP）等相互作用。FBXW5蛋白的最大得分为0.812。

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图6

TIPE1的蛋白质相互作用分析。

STRING平台用于预测蛋白质相互作用。预测FBXW5、caspase8、caspase 10、POMP等与TIPE1相互作用。

讨论

最近，据报道，TNFAIP8家族的表达在多种癌症的发生发展中发生改变，包括肝癌、肠型胃腺癌、肺癌、卵巢上皮癌、子宫内膜癌和结肠癌[13–18]. TNFAIP8家族也被证明与糖尿病肾病、帕金森病和结肠炎相关[5,19,20]. 在TNFAIP8家族的所有成员中，TIPE2在中枢含有一个疏水性空腔，可能是TIPE2对免疫稳态关键功能的反应[7]. TIPE1是TNFAIP8家族的另一成员，与TIPE2具有高度的序列同源性[7]. 虽然TIPE2和TIPE1中存在共同的折叠，但TIPE1可能在免疫中不起重要作用[21]. Cui等人[21]据报道，在成熟T和B淋巴细胞中未检测到TIPE1。然而，它在人类B淋巴细胞系HMy2.CIR中表达，该细胞系经EB病毒DNA转化[21]. 此外，TIPE1也在小鼠的脑、肝、肾、胃等多种组织中表达，在多种肿瘤细胞系中表达上调，尤其是病毒转化细胞系[21]. 然而，Zhang等人[9]也有报道称，与邻近的非肿瘤组织相比，肝癌组织中TIPE1的表达下调。TIPE1可诱导肝癌细胞凋亡并抑制其生长[9]. 因此，TIPE1在不同细胞中有趣且不同的表达水平吸引了我们对其结构的关注。

在本研究中，我们尝试在web平台上使用生物信息学方法分析其结构。由于TIPE1的序列在哺乳动物中可能具有很好的保守性，因此选择人类TIPE1序列进一步分析TIPE1结构，并使用SignaIP平台预测TIPE1信号肽，而使用TMpred服务器预测TIPEl的跨膜区域。根据SignaIP平台和TMpred系统的算法，推测人类TIPE1中没有信号肽和跨膜结构域。此外，还利用ProtParam计算了各种化学和物理参数，结果表明，TIPE1的脂肪族指数为100.75，这是提高球形蛋白质热稳定性的一个积极因素。同时，对TIPE1翻译后修饰的预测结果表明，推测TIPE1蛋白中存在四种磷酸化位点，而TIPE1蛋白质中也可能存在PKC位点和PKA位点。我们还构建了TIPE1的三维结构，结果也表明预测的结构是稳定的。

重要的是，预测TIPE1与一些蛋白质相互作用，包括FBXW5、caspase8和caspase10蛋白质。TIPE1的蛋白质相互作用分析结果表明，TIPE1可能通过这些分子在某些细胞中诱导凋亡或自噬。以往对肝细胞癌（HCC）细胞TIPE1功能的研究表明，TIPE1通过负调控Rac1的表达而诱导HCC细胞凋亡[9]. Ha等人还发现，TNFAIP8 l1/Oxi-β通过与FBXW5结合，可以增加帕金森病模型中的自噬[19]. 这些研究可能支持我们的观点。有趣的是，TNFAIP8家族的另一成员TIPE2也被报道抑制Rac1的表达以抑制肝癌细胞的转移和侵袭[22]. 此外，caspase8还被报道与TIPE2蛋白结合以诱导细胞凋亡[2]. TIPE2通过caspase3和caspase9促进肺癌细胞凋亡[23]. 这些研究均提示TIPE1在细胞凋亡和自噬中的作用有待于进一步研究。

总之，TIPE1可能是一种不含信号肽和跨膜结构域的稳定蛋白，并且TIPE1可以诱导一些适当细胞的凋亡和自噬。TIPE1生物信息学分析的所有结果将为进一步研究TIPE1在某些疾病中的作用提供基础。

资金筹措表

本研究得到江苏省研究生科研创新计划（CXLX12_0677）的资助。

数据可用性

所有相关数据都在论文中。

工具书类

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文章来自PLOS ONE系列由提供多环芳烃