图4

A） RhoGDIα作为SUMO2/3靶点的鉴定。来自屏幕I和屏幕II的SILAC比率和MS数据。B） RhoGDIα的示意图，其氨基酸序列围绕赖氨酸残基K138和K141。一致修饰基序显示，赖氨酸以红色突出显示。C）使用GFP-trap珠从紫杉醇滞留细胞中纯化Venus-RhoGDIα或Venus-RHODIαK138R/K141R。RNAi耗尽SUMO结合途径成分Ubc9和PIAS1-4，用多西环素诱导生成的稳定HeLa FRT Trex细胞系中的Venus-RhoGDIα融合蛋白表达，并添加ZM447439一小时，如图所示。用SUMO2/3和RhoGDIα特异性抗体进行western blotting，分析不同实验条件下纯化的RhoGDI-α和RhoGDI-αK138R/K141R的SUMO化状态。D） 亲代HeLa FRT和HeLa FR T TRex SUMO2细胞被胸腺嘧啶核苷阻滞在S期，或在有丝分裂中与胸腺嘧啶核苷类和紫杉醇同步，随后通过添加ZM447439进行有丝分裂检查点覆盖和进程。用抗细胞周期蛋白B1、RhoGDIα、RhoA和α-微管蛋白抗体对细胞裂解产物进行western blotting分析，结果表明RhoGDI-α本身在有丝分裂中是稳定的。E） 对每个靶点使用3种不同的siRNA寡核苷酸，使用RNAi去除正常HeLa细胞中的RhoGDIα或RhoGDI-β。用RhoGDIα和RhoA特异性抗体进行western blot分析裂解产物的耗尽效率和Rho A稳定性。F） 稳定的HeLa FRT TRex FLAG-RhoGDIα或FLAG-RhosGDIαK138R/K141R细胞被内源性RhoGDI-α耗尽，并被紫杉醇阻止有丝分裂。如图所示，使用外源性RhoGDIα融合蛋白进行救援时，多西环素的浓度增加（ng/ml）。用RhoGDIα和RhoA特异性抗体进行western blot，分析裂解液的消耗效率、外源性RhoGDI-α的表达水平和RhoA-稳定性。G） 稳定HeLa细胞系在有丝分裂过程中表达Venus-RhoGDIα和Venus-RHODIαK138R/K141R的延时电影中的代表性静止图像。显示DIC和Venus通道，并指示核膜破裂（NEBD）、中期和后期的时间。H） 作为F），但使用Venus-RhoGDIα。