图2

A） 滚筒瓶中细胞生长和同步协议的示意图。B） 胸腺嘧啶核苷将HeLa FRT TRex SUMO2和HeLa FR T TRex SUMO2ΔGG细胞阻滞在S期，或与胸腺嘧啶核苷类和紫杉醇同步进行有丝分裂，然后在指定时间内加入ZM447439刺激有丝分裂退出。使用抗SUMO2/3、细胞周期蛋白B1和Aurora A抗体作为有丝分裂进展和Vinculin的标记物，通过western blotting分析细胞裂解物。(^★)表示未结合的SUMO2融合蛋白(^⧫)表示内源性SUMO2/3。C） 定量蛋白质组学策略示意图。细胞大规模生长，并在滚筒瓶中同步，如A所示。SUMO2ΔGG细胞用轻“L”/R0K0氨基酸进行同位素标记，并滞留在前中期（灰色），表达SUMO2的细胞用中等“M”/R6K4氨基酸进行标记，代表加入ZM447439后一小时的有丝分裂退出阶段（绿色）和表达SUMO2的细胞被重“H”/R10K8氨基酸标记并滞留在前中期（红色）。混合来自标记群体的等量细胞裂解液，并按照图1SUMO2结合物富集样品用SDS-PAGE分离，用胰蛋白酶消化，用质谱（MS）分析。用针对FLAG、Cyclin B1、Aurora A和Vinculin的免疫印迹抗体分析不同实验条件下的裂解产物，以确定接合状态和有丝分裂期。(^★)表示未结合的SUMO2融合蛋白。D） 屏幕I和屏幕II的整个数据集的散点图。该图显示了对数的值₂（M/L）和日志₂（H/L）用于确定SUMO化目标的SILAC比率。日志处的红色虚线₂（M/L） = 1和日志₂（高度/高度） = 1表示各SILAC对的截止比≥2。每个点代表单个已鉴定的蛋白质，在屏幕I中鉴定的蛋白质用蓝色表示，在屏幕II中鉴定的蛋白质用紫色表示。分类为SUMO化点击的已识别蛋白质位于虚线截止线上方，颜色较深，而分类为背景的已识别蛋白位于截止线下方，颜色较浅。E） 图中显示了屏幕I（蓝色）、屏幕II（紫色）中SUMO2/3修改的已识别目标（点击）数以及两个屏幕中已识别点击的重叠（深蓝色）数。F） 具有屏幕I和屏幕II日志之间相关性的散点图₂确定的SUMO2/3靶蛋白的（H/M）比率。每个点代表一个SUMO2/3目标。显示了皮尔逊相关性R。