癌症的根源：干细胞和肿瘤异质性的基础

摘要

介绍

干细胞生物学应用于癌症研究的概念基础来自对肿瘤异质性的基本观察。两种类型的肿瘤异质性是当前在确定有效癌症生物标记物、预测治疗反应和设计靶向治疗方面面临的挑战的核心。不同患者发生的同一组织类型的肿瘤之间存在肿瘤间异质性，其预后和/或治疗反应可能不同。此外，在单个患者的肿瘤中可以观察到肿瘤内的异质性，这在组织病理学特征方面早就被注意到了，最近在分子水平上也被注意到了。干细胞生物学的核心概念可以用来解释这两种肿瘤异质性的基础，从而产生具有临床相关性的实验可测试假设。

尽管从事再生医学研究的干细胞生物学家经常使用与癌症研究者相似的概念和方法，但这两组研究人员的目标根本不同。因此，许多干细胞生物学家的主要目标包括开发成人组织干细胞的鉴定、分离和繁殖方法，作为治疗疾病的方法，或将多能干细胞分化为再生医学中应用的所需细胞类型。相反，癌症生物学家致力于干细胞研究，以建立改善癌症预后的方法，并通过根除癌症干细胞产生靶向治疗。然而，尽管人们对这一领域非常感兴趣，但干细胞概念的应用能否为癌症生物学提供临床有用的见解仍有待确定。

在这里，我们回顾了一些最近的论文，这些论文阐述了理解干细胞与癌症生物学之间关系的基本原理和复杂性。我们将重点关注前列腺癌的分析，同时也参考其他癌症的研究来强调要点。

起源细胞与肿瘤间异质性

癌症起源细胞是指肿瘤发生致癌转化后的正常细胞类型[1]. 鉴于其固有的自我更新能力，成人干细胞被认为是致癌转化的良好靶点。然而，在许多情况下，癌症也可能由非干细胞的细胞类型引起，从而在转化时获得自我更新的特性。起源细胞模型进一步提出，给定组织内不同的起源细胞类型可以产生相应的肿瘤亚型，这些亚型具有不同的治疗反应和/或患者结果(图1). 因此，特定组织内不同来源细胞类型的转化可能是肿瘤间异质性的重要来源。值得注意的是，该模型可能具有临床意义，因为有可能设计针对关键信号通路的治疗，或针对保留在相应肿瘤亚型中的起源细胞类型的主调节器。

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图1

起源细胞及其与肿瘤亚型的关系。正常组织的谱系层次示意图中，干细胞位于层次顶部，产生多能干祖细胞、下游传递放大细胞和分化细胞类型。干细胞具有自我更新的能力，其特性受邻近生态位的调控。不同来源细胞类型（如干细胞（红色箭头）或下游祖细胞（虚线箭头）的癌基因转化可产生不同的肿瘤亚型。

肿瘤干细胞和肿瘤起始细胞

在过去的十年中，干细胞概念与癌症生物学之间的关系一直由癌症干细胞模型主导(图2A). 该模型提出肿瘤内的细胞是通过类似于正常组织的谱系层次生成的，并由一群自我更新的干细胞维持[21,22]. 此外，这种癌症干细胞也可能分化产生具有更有限增殖潜能的表型不同的细胞类型。癌症干细胞模型因其潜在的治疗意义而具有吸引力，因为癌症干细胞可能不受传统疗法的影响，因此可能有助于癌症复发和长期传播。尽管如此，癌症干细胞模型仍然存在很大争议，因为难以确定可靠的癌症干细胞标记物以及开发可靠的检测方法[23].

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图2

肿瘤干细胞模型与克隆进化。A： 传统的肿瘤干细胞模型假设肿瘤起始细胞（TIC）通过谱系层次结构产生不同的肿瘤细胞类型。在肿瘤内，只有TIC而不是其子代才能在肿瘤启动试验中成功生成肿瘤移植物（红色箭头）。由此产生的移植物重述了亲代肿瘤的等级组织和表型。B： 在克隆进化模型中，肿瘤可能包含多个不同的肿瘤起始细胞，这些细胞反过来产生克隆多样性并导致肿瘤内异质性。在连续移植试验中，这些不同的肿瘤起始细胞在肿瘤传播能力上可能不同。

鉴定假定癌症干细胞的实验方法通常利用流式细胞术从人类或小鼠肿瘤中分离候选细胞群。由此产生的细胞群可以移植到免疫缺陷小鼠体内，以评估它们是否能够形成重演亲代肿瘤表型的肿瘤。如果这些候选的肿瘤起始细胞能够被识别，那么限制稀释分析可以评估其肿瘤干细胞的频率，同时可以进行连续移植以评估长期增殖潜力。使用这种通用方法，已从多种人类癌症中鉴定出致瘤细胞群[23]. 然而，肿瘤干细胞和肿瘤分级组织最令人信服的证据来自血液系统恶性肿瘤的研究，而其在实体肿瘤中存在的已发表证据则更具争议性[24–26]. 最近，来自小鼠模型血统追踪研究的新证据为完整实体瘤的血统层次提供了直接证据[27–29]. 这些体内研究表明，在肠腺瘤、皮肤乳头状瘤、鳞状细胞癌以及胶质瘤中，干细胞样肿瘤细胞可以产生具有不同增殖潜能的分化程度更高的细胞类型[27–29]. 是否可以在其他肿瘤类型中识别出类似的肿瘤干细胞尚待确定。

值得注意的是，在癌症干细胞文献中，基本术语的定义往往很差。不幸的是，“肿瘤起始细胞”这一术语的使用导致了该领域的一些混乱，因为这个术语也被应用于起源细胞，导致癌细胞和正常细胞之间缺乏区别。为了避免这种语言混乱，一些研究人员倾向于使用替代术语，如癌症再增殖细胞，这也可能代表对移植试验的更准确描述。此外，虽然假定的癌症干细胞有时被认为与其来源的细胞类型相似，但如果肿瘤是由非干细胞来源产生的，则表型相似性几乎没有依据。同样，肿瘤的层次结构并不一定意味着它来自正常的干细胞。

现在很明显，与传统的肿瘤起始检测相关的方法学和解释性缺陷有很多。例如，有必要进行严格控制，以确定流式细胞术分离的假定非癌症干细胞群体的特性。重要的是要证明，这一人群无法形成肿瘤不仅仅是因为存在死亡/死亡细胞，或特定检测条件导致的生长缺陷。还必须证明用于分离假定癌症干细胞群的细胞表面标记物是可靠的，并且可以以高度可重复的方式使用。

在几个值得注意的例子中，被认为是“通用”干细胞和/或肿瘤起始细胞标记的细胞表面标记的表达模式一直存在误导。例如，对CD133标记的研究表明，它在成年小鼠和原发性结肠癌的多种分化上皮细胞类型中广泛表达：大多数CD133⁻细胞对应于基质细胞或炎性细胞，而转移性结肠癌由CD133和CD133组成⁺和CD133⁻肿瘤起始能力无差异的上皮细胞群[30]. 此外，CD133和CD271等标记物似乎无法识别肿瘤发生频率不同的稳定黑色素瘤细胞群，这支持了以下解释：恶性黑色素瘤缺乏层次结构，不遵循癌症干细胞模型[31,32].

此外，系统的方法学改进也可以大大提高肿瘤起始检测的效率。因此，对移植方法进行技术改进，以及使用免疫缺陷严重的小鼠作为移植受体，可以将恶性黑色素瘤中肿瘤起始细胞的检测频率提高到约30%[31,32]. 另一方面，同样的方法显然无法识别许多其他肿瘤类型的高频率肿瘤起始细胞[33]. 因此，肿瘤起始细胞的总频率似乎由肿瘤类型决定，但也受需要针对每种肿瘤类型优化的分析条件的影响。

克隆进化与肿瘤内异质性

导致肿瘤异质性的一个主要因素是克隆进化，在克隆进化中，癌症被认为是通过获得具有选择性优势的基因突变而进化的[40]. 随着肿瘤在生长过程中或治疗反应中，对空间和营养资源的竞争，不同的癌细胞群在特定肿瘤中的比例会急剧膨胀或收缩。原则上，克隆进化可能是由遗传和/或表观遗传学上不同的癌症干细胞类型之间的竞争驱动的，每种类型都会产生一个有层次结构的癌细胞群体（克隆），从而产生瘤内异质性(图2B).

克隆进化模型表明，癌症是由产生表型多样性的细胞群的复杂混合物组成的，并且可以通过耐药克隆的生长来应对治疗。例如，急性淋巴细胞白血病（ALL）通常由具有白血病起始功能的遗传多样性克隆组成，这些克隆以复杂的分支方式进化[41]. 当费城ALL染色体患者的样本被移植到免疫缺陷小鼠体内时，一些移植物在15周前在受体小鼠中引起疾病，而其他的则没有。为了研究肿瘤多样性的演变，将产生的移植物重新移植，然后进行DNA拷贝数分析，以追踪次级移植物中亚克隆的演变。尽管在患者诊断时发现的克隆可以在许多侵袭性二次移植物中检测到，但在其他移植物中发现了新的拷贝数改变以及解释功能异质性的特定遗传差异[41]. 在类似的方法中，可以使用荧光追踪ETV6-RUNX1融合阳性ALL患者中不同克隆的进化就地杂交检测常见的基因组拷贝数改变[42]. 在这两项研究中，存在具有不同基因缺失的多个肿瘤亚克隆，表明具有白血病起始功能的肿瘤继续以多克隆分支方式进化。这些发现突显了通过靶向特定癌细胞群实现有效治疗反应的困难，因为肿瘤并不对应于静态实体。相反，肿瘤内部的异质性导致肿瘤在治疗后对选择性压力作出反应，并出现具有治疗耐药性的克隆。

为了支持这一观点，其他研究已经确定了前列腺癌中不同的肿瘤起始细胞群，它们的治疗反应不同。对于前列腺癌，雄激素消除治疗仍然是治疗策略的主要手段，但许多前列腺癌最终发展为去势抵抗和疾病复发。值得注意的是，最近一项使用前列腺癌细胞系和异种移植物的研究发现，去势抵抗的肿瘤起始细胞表达低水平的前列腺特异性抗原（PSA），PSA是分化管腔细胞的标记物，以及表达高PSA的去势敏感肿瘤起始人群[43]. 特别是，在感染了含有PSA启动子的慢病毒载体后，人类LAPC异种移植物系可以分为不同的GFP-bright PSA⁺和GFP-dim PSA^−/lo人口。原位移植到免疫缺陷男性宿主后，两个PSA^−/lo和PSA⁺细胞群显示出肿瘤起始能力，尽管PSA⁺人群产生了越来越多更大的肿瘤。相反，连续移植后，PSA^−/lo衍生的异种移植物在第三代传代后生长更快，可以传代更多代，而PSA⁺衍生移植物表现出逐渐减少的潜力。这些发现表明，在没有广泛的连续传代的情况下，可能无法轻易观察到肿瘤起始和长期肿瘤传播之间的重要实验区别。此外，这些发现还意味着肿瘤起始和肿瘤传播能力并非绝对相关。

在小鼠连续移植试验中，通过追踪个体人类原发性结肠癌细胞自我更新的谱系追踪策略，发现了肿瘤始发人群的额外复杂性[44]. 在原发性结肠癌衍生的肿瘤球生长后，分离的细胞被整合在独特位置的慢病毒载体感染，然后在免疫缺陷小鼠中进行肾移植。对产生的肿瘤进行连续传代后，发现了不同的克隆，这些克隆不易在二次移植中繁殖，可能来源于“肿瘤瞬时扩增细胞”，也有少数克隆含有肿瘤增殖细胞（称为“长期肿瘤起始细胞”），这些细胞可能在连续移植中形成肿瘤。相对于肿瘤瞬时增强细胞，这些肿瘤增殖细胞也更有可能产生转移。最有趣的是，这种标记系统可以识别“延迟贡献的肿瘤起始细胞”，这些细胞对二级或三级移植物有定量贡献，但在一级移植物中检测不到，这与先前休眠的肿瘤起始群体的激活一致[44].

尽管越来越多的证据表明，基因差异会导致肿瘤内异质性，但表观遗传学机制的参与程度仍不清楚。然而，表观遗传调控的间接证据已由推测的癌症干细胞可塑性的研究提供[45]. 在来源于原发性肿瘤的培养SUM人乳腺癌细胞系中，通过使用细胞表面标记物CD24、CD44和EpCAM进行流式分类，确定基底、管腔和“干样”细胞群。在分离出每个亚群并在培养中扩大后，基底、管腔和干样种群的相对比例随着时间的推移恢复到平衡。同样，在将经过分类的种群原位植入免疫缺陷小鼠的乳腺后，所有三个种群都能够接种肿瘤。数学模型对非干细胞成为癌干细胞的能力进行了定量评估，表明细胞状态之间很容易发生相互转化。这些发现是否适用于前列腺癌或其他实体肿瘤尚不清楚。然而，这些发现为肿瘤内异质性的复杂人群动力学提供了额外证据，并进一步表明需要针对多种细胞类型的同时联合治疗来防止癌症复发。

结论

干细胞研究概念在癌症生物学中的应用为肿瘤异质性的基础提供了重要的见解。特别是，癌症起源细胞可能会影响治疗反应和患者结局，因为最近的研究表明，起源细胞可以影响产生的肿瘤亚型，从而导致肿瘤间异质性。因此，仔细分析起源细胞类型（与突变细胞相比）可能会改善癌症预后，并有助于开发靶向治疗。例如，在前列腺癌中，识别可能天生具有去势抵抗力的来源细胞类型，可能会导致针对此类细胞的治疗，从而改进对去势抵抗致命疾病的治疗。

关于肿瘤内异质性，目前有重要证据表明，至少一些癌症是分层组织的，遵循肿瘤干细胞模型。然而，尽管人们在确定假定的癌症干细胞群体方面付出了大量努力，但癌症干细胞模型仍存在争议，需要进一步验证。最后，最近的研究表明，肿瘤内异质性背后的异常遗传复杂性，表明进化选择压力作用于多种共存的肿瘤细胞群体，可能是由不同的肿瘤起始群体产生的。克隆进化的过程表明，针对不同肿瘤细胞群的组合方法对于成功的癌症治疗是必要的。

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