Subread对齐器：通过seed-and-vote实现快速、准确和可扩展的读取映射

ERCC峰值控制数据

Ambion（文本注册）External RNA Controls Consortium（ERCC）尖峰控制包括92个尖峰转录本，它们在两种混合物（混合物1和混合物2）中以不同浓度尖峰出现(http://www.lifetechnologies.com, 2013). 这两种混合物中的转录物以定义的混合物1:混合物2摩尔浓度比存在，由四个亚组描述（分别为2、0、−0.58和−1的对数倍变化）。每组包含23份10分的成绩单⁶-折叠浓度范围，转录物大小和GC含量大致相同。转录序列中尖峰的中位长度为994 bp。

本研究中使用的ERCC峰值控制测序数据是作为SEQC研究的一部分创建的。在进行文库制备之前，混合物1和混合物2分别与SEQC样品A（UHRR）和样品B（HBRR）混合。将尖峰转录序列与人类基因组相结合，以便每个比对子可以建立一个杂交指数。然后将尖峰读数和人类读数映射到混合指数。

为了计算每个尖峰转录本的折叠变化，读取计数通过映射尖峰读取总数和转录本长度（每1 kb转录本读取/1000映射尖峰写入读取）进行标准化。将偏移量计数0.5添加到原始读取计数中，以避免日志为零。

源自NCBI RefSeq注释的外显子-外显子连接

在比较检测外显子-外显子连接的不同方法时，我们评估了他们发现源自注释外显子的连接的能力。我们从NCBI RefSeq人类基因注释（构建37.2）中获得了注释外显子的染色体坐标。我们称一个报告的连接为“已知”连接，如果它连接来自同一基因的两个带注释的外显子，即连接的5′剪接点位于5′外显子的最后一个碱基位置，而3′剪接点将位于3′外显器的第一个碱基之前的一个碱位。

绘制质量分数

Subread和Subjunc为每个映射的读取输出映射质量分数（MQS），由

哪里我是读取长度，第页_我是棒球P（P）的值我读数中的第个基数，b条_米是匹配底座的位置集b条_毫米是不匹配基的位置集。

基本呼叫P（P）可以根据FASTQ文件（原始读取数据文件）中可用的基本质量分数轻松计算值。高质量的底座具有低底座P（P）值。发现为插入的读取基在MQS计算中被视为匹配基。MQS是一个读取长度规范化值，范围为0–200。如果一个读取可以最好地映射到多个位置，则其MQS将除以此类位置的数量。

建立参考基因组索引

为了建立索引，从参考基因组中每三个碱基中提取16 bp序列，即每对相邻的16 bp序列之间有2 bp的间隙。相应地，每个读取必须扫描三次以进行映射，即提取三组子读取，分别从读取的第一、第二和第三个基开始。

我们为参考基因组建立了一个哈希表，以便能够快速访问从每次读取中提取的子读取的染色体位置。哈希表包括从参考基因组（键）中提取的所有信息性16 bp序列及其染色体位置（值）。每个16 bp序列中的每个碱基都由2位编码。因此，每个16 bp序列占用4个字节的空间。对于小鼠或人类基因组，它们的索引大小分别为6.2 GB和6.6 GB。实际的峰值内存使用量将略高于这些值，因为在执行比对时，整个基因组的序列也会加载到内存中。索引构建功能提供了将索引拆分为多个部分的选项，以减少内存占用（内存中任何时候都只有一个部分）。

最佳子读取长度

一组等距重叠的子字符串子广告，从读取中提取，并且每个都映射到参考基因组。绘制每个子读数时不允许出现任何不匹配，因此可以通过基因组的散列索引以极快的速度和效率完成这一步骤。我们不允许不匹配，而是保持子广告相对较短，以实现灵敏度和准确性之间的良好平衡。测试表明，从这个角度来看，从10–25 bp的子读取长度范围内工作良好（数据未显示）。子标题使用长度为16的子标题，因为这在灵敏度和准确性的最佳范围内，并且因为这个长度的序列将完全适合32位计算机系统上的一个机器字或64位计算机系统上的半个字。这将以最有效的方式使用计算机内存，并减少数据访问时间(补充方法,补充图S2).

为了使子读取策略有效地工作，每个子读取都必须具有合理的特定性，这样就可以从子读取集中删除与高度重复或过于常见的序列相对应的子读取。对人类基因组的检查表明，所有可能的16 bp序列中，81%的序列在基因组中出现24次或更少(补充方法,补充图S3). 基于这一动机，我们将任何序列在参考基因组中出现>24次的子读取定义为无信息。因此，信息亚读是指在参考基因组中出现≤24次的亚读。仿真表明，阈值越高，映射灵敏度越高，但准确性越低(表5). 我们的目标是实现高绘图精度和高绘图速度；因此，我们决定使用更严格的阈值来过滤掉无信息的子读取。除非另有说明，否则在与本研究中的其他对准器进行比较时，Subread使用了24个重复的截止值。Subread在索引构建程序中提供了一个选项（“-f”），以便用户可以根据需要调整此阈值。

为读取操作投票相同映射位置的任何信息子读取集都称为共识集一般来说，一次阅读会有多个共识集。这部分是因为歧义，因为子阅读可以映射到多个位置，也因为阅读的不同区域可能真正来源于参考序列的不相交区域，例如，因为RNA阅读可能跨越一个或多个外显子-外显子连接。

每次读取的最大共识集决定了其映射位置。如果没有唯一的最大共识集，因为映射到不同位置的两个或多个共识集具有相同的投票数，则选择基因组中包含更多碱基的共识集。如果仍然存在平局，则会根据MQS或读取区域和每个候选区域之间的汉明距离打破平局。

有多少子阅读和多少投票？

决定映射算法的其余参数是从每次读取中选择的子读取数和一致性阈值。共识阈值是报告映射位置所需的最小子读取（投票）数。进行了广泛的模拟研究，以确定这些参数的最佳值(补充材料). 针对1000万101 bp读取的映射，检查了范围为7到28的子读取数，以及范围为子读取数10%到70%的共识阈值。毫不奇怪，对于任何固定的子读取数，随着一致性阈值的增加，灵敏度降低，准确性提高(补充图S4). 然而，将共识阈值设置为子读取数的～30%，在广泛的子读取数和删除无信息子读取的截止值的准确性和敏感性方面表现良好(补充图S5). 从计算成本的角度来看，首选较小数量的子读取。考虑到所有评估结果，我们决定从每次读取中选择10个子读取，并使用一致的阈值3进行映射。

检测子读取周围的索引

检测删除和插入是读取映射的一个特别困难的方面，通常会产生相当大的计算成本。然而，我们的seed-and-vote策略有助于高效、准确地进行indel检测，并且计算开销非常小。首先考虑由一致性子读取提供支持的indel。在这种情况下，侧翼亚读的基因组位置决定了indel长度并限制了indel碱基的位置。靠近读取末尾的索引两侧不会有侧翼子读取。在这种情况下，我们沿着未映射的区域移动窗口以标识索引。子读取方法只需要对齐映射子读取未覆盖的读取基，与整个读取的完全对齐相比，这节省了大量的计算量。

图1C说明了我们如何识别索引并确定其长度和位置。图1（C1）显示了在读取中未找到indel时子广告的映射位置。为了简单起见，这里每个提取的子读取都映射到一个唯一的位置。可以看出，参考基因组中子读取的映射位置之间的距离与它们在读取中的距离相同。我们利用这种距离一致性来推断indel长度。当读取包含插入时[图1（C2）]，插入右侧的子广告的映射位置将向左移动一段距离d日，等于插入长度。类似地，当读取包含删除时[图1（C3）]，右侧子读取的映射位置将向右移动等于删除长度的距离。由于侧翼子读取中不允许出现不匹配，因此indels调用时具有很高的可信度。由于indel的出现，未被映射子读物覆盖的未覆盖碱基随后使用Smith–Waterman动态编程程序与侧翼子读物的映射位置（由绿色虚线包围）之间的基因组间隔对齐。由于indel长度已经由侧翼子读取确定，因此可以指示Smith–Waterman算法找到正确indel长度的对齐方式。

可以看出，动态编程过程只需要用于对齐未覆盖的底座，而不是像Novoalign等其他对齐器执行的那样使用此过程来对齐整个读取序列。当使用此程序在本研究包含的1000个基因组数据集中发现indels时，Subread的运行时间仅增加了3%。动态编程过程还报告了98%的读取数据集包含索引的正确索引长度。

然而，indel的两侧可能没有侧翼子读，特别是当它们的位置接近读的末尾时[图1（C4）]。在这种情况下，将一个4 bp的窗口从第一个（或最后一个）映射基数移动到读取的开始（或结束），以标识索引。我们需要窗口中至少三个不匹配项来考虑潜在的indel。报告了提高未发现碱基和相应参考区域之间相似性的任何潜在指数。

发现亚阅读之间的外显子-外显子连接

RNA-seq的一个独特特征是能够测量基因的不同亚型，包括选择性剪接事件。在这里，我们使用seed-and-vote范式开发了一种新的方法来检测外显子-外显子连接并从RNA-seq读取中生成完整的映射结果。

图2显示了该方法的示意图。整个读取集扫描两次。在第一次扫描中，从每次读取中提取若干子读取，然后使用这些子读取投票选择参考基因组中读取的映射位置。任何至少获得一票的地点都将被考虑。我们为每个读取选择投票最多的两个映射位置，并检查在这两个选择的位置之间是否存在任何拼接位点。我们要求在这两个位置之间存在一个供体位点（“GT”）和一个受体位点（“AG”），然后才考虑它们之间有剪接点。我们还要求，参考基因组中由投票选出两个最佳位置的两组亚基所跨越的区域长度（不包括已确定的供体位点和受体位点之间的区域）必须等于由两组相同亚基所横跨的区域长度，当不允许使用indels时。这在中Read 1的映射中进行了说明图2(). 如果允许缩进，则长度差将等于或小于规定的最大缩进长度。第一次扫描对发现潜在外显子-外显子连接非常敏感，因为考虑了低至一票的任何映射位置。另一方面，对绘制区域长度和供体/受体位置的要求确保了高精度的实现。

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图2。

在种子-标记范式下检测外显子-外显子连接的示意图。使用两次扫描程序来检测外显子-外显子连接，并确定每个读数的映射。使用三个人工读取来说明此过程（读取1、读取2和读取50）。在第一次扫描中，从每次读取中提取一组子读取并映射到参考基因组。从每次读取中选择最佳的两个映射位置，该位置获得两个最大数量的投票，以供进一步考虑。如果在这两个位置和总大小之间发现供体和受体部位()参考中两个映射区域的大小等于(L（左）)在由投票选出最佳两个映射位置的子阅读跨越的阅读区域中，确定的剪接点将记录在假定的外显子-外显子连接表中。还记录了基因组和读取中每个读取的锚定位置，这分别给出了读取映射到的最佳映射位置以及为该位置投票的一组提取子读取的最左侧基的位置。锚定位置将用于检索假定拼接点和第二次扫描进行的验证。第一次扫描应用于所有读取，完成时生成两个表。这两个表分别包括每个外显子-外显子连接处的假定剪接点的染色体位置和每个读取的锚定信息。第二次扫描的输入包括这两个表以及读取的数据。对于每次读取，第二次扫描使用其锚定位置从第一次扫描的连接表输出中搜索位于读取范围内的假定拼接点，然后检查所有映射可能性（包括将读取映射为外显子读取），以最终确定应如何映射读取。当它被映射为连接读取时，读取序列和映射区域之间的相似性必须大于被映射为外显子读取时的相似性（即。)，如果它被称为连接读取。当假定读取不包含连接时，青色虚线指示读取的第一个基址或最后一个基址的映射位置。如果在第二次扫描完成后发现假定拼接点没有任何支持读取，则从最终结果中删除这些拼接点。此两次扫描程序的最终输出是一个验证的外显子-外显子连接表，其中包括支持读取的数量，以及每个读取的完整映射结果，包括CIGAR字符串，其中描述了每个读取中的每个碱基是如何映射的。

第二次扫描将使用第一次扫描的输出，对每次读取执行完全读取对齐（包括那些映射为外显子读取的读取，它们只有一个候选映射位置）。第二次扫描也是一个验证过程，它将检查每次读取的所有映射可能性，并为其选择最佳可能的映射。它还将读取指定给第一次扫描发现的外显子-外显子连接，并删除那些未能获得任何支持读取的连接。

第一次扫描的输出包括发现的推定外显子-外显子连接和用于读取的锚定信息。对于每次读取，其在基因组中的锚定位置是投票选出读取的最佳映射位置的子读取集合中最左侧子读取的最左侧基的映射位置，其在读取中的锚定位是读取中相同基的位置。每次读取中的锚定区域是由投票选择最佳映射位置的一组子读取跨越的区域，而读取中锚定区域映射到的基因组中的区域是其在基因组中的锚定位区域。为每次读取保存的锚定位置允许第二次扫描检索第一次扫描发现的读取范围内的所有假定外显子-外显子连接位置。第二次扫描考虑了如何最终绘制每个读取的所有可能性，包括将读取映射为外显子读取的位置（读取中未发现连接断点），将读取映射为具有一个连接断点的连接读取的位置，或将读取映射成包含多个连接断口的连接读取位置。

我们用涉及两次读取的示例来说明所提出的算法，如图所示图2.读取1当使用其锚定位置从外显子-外显子连接表中搜索第一次扫描发现的该读数的拼接点时，发现其包含位于锚定右侧的假定连接断点(图2). 为了确认这是否是一个真正的连接，我们检查了在绘图结果中包含此连接是否会提高其与参考基因组的序列相似性。如果包括此交叉点，则其位置读取1可以通过计算这个在基因组中读取的锚定位置（染色体1上的950）和位置之间的距离来计算拼接点1在基因组中（1号染色体上1000个），因为这个距离等于read中这个连接位置和read中的锚位置之间的距离（当不存在indels时）。每个外显子-外显子连接在参考基因组中有两个剪接点，拼接点1和拼接点2如果有indel，则读取中的连接位置将向右移动，表示在读取中插入，或者向左移动，表示在读取中删除indel碱基的数量。纳米_L（左）表示在读取中确定的连接位置和锚位置之间的区域中找到的匹配底座的数量。我们进一步将位于连接位置和读数3′端之间的区域映射到从位置开始的基因组区域拼接点2再一次，我们在这个映射中允许indels。在该区域中找到的匹配碱基的数量表示为纳米_R（右）.总数纳米_L（左）和纳米_R（右）当该区域被视为包含连接时，给出位于锚点右侧的整个读取区域的匹配基的总数。然后，我们直接将该区域与从锚点位置开始到青色虚线所示位置结束的连续参考区域进行比较，并计算匹配的碱基数，表示为纳米_E类。此比较检查了该区域被映射为外显子区域的可能性，即该区域中不存在连接。此比较中允许使用索引。如果纳米_L（左）和纳米_R（右）大于纳米_E类，然后将确认发现的连接，此读取也将被视为此连接的支持读取之一。否则，该区域将被映射为外显子区域。用于人工读取读取1，该连接被确认并添加到验证的外显子-外显子连接表中。

确定锚点右侧读取区域的映射后，第二次扫描继续映射锚点左侧的区域。该区域未发现假定的连接断点；因此，该区域的映射非常简单。投票子读数已经确定了锚中这些基地的映射位置，并且只需要计算出这些基地中的索引，这些基地位于锚区域之外（如果有）。这是通过测试在每个碱基中添加indels是否可以增加匹配的碱基来实现的。

读取50然而，除了在锚的右侧确认的连接断点外，还发现在锚的左侧区域中包含一个假定的连接断口。第二次扫描执行一项测试，与确认右侧连接的测试类似，以验证左侧区域中的连接。

两次扫描完成后，每次读取都将完全对齐，并将生成验证的连接位置列表。第一次扫描报告的那些假定连接位置，在第二次扫描中没有得到任何支持读数，从结果中删除了这些位置（例如，删除了由红十字表示的连接）。为每个报告的连接提供支持读取数。除了发现的外显子-外显子连接的染色体位置外，还报告了每次读取的定位结果。对于每个读取的连接，其每个基的映射位置都记录在一个香烟串中(34).

Subread为外显子读的映射输出与Subjunc给出的映射结果相同的映射结果。对于每个连接读取的映射，Subread给出的映射区域将与Subjunc给出的其中一个映射区域重叠，因为它们使用相同的一致子读取集来确定映射位置（Subread）或锚位置（Subjunc）。因此，Subread和Subjunc之间的读取映射位置基本相同，这意味着Subread与Subjunc具有相同的映射精度。

子读取比以前的对齐器更快

首先，我们比较了最近1000个基因组数据集上的替代性比对，该数据集包含2750万对100 bp的DNA读取。Bowtie2、Maq和Subread都成功地将几乎所有的读数映射到了人类基因组中，而且他们也拥有Rabema计划给出的最高百分比的归一化发现区间(35). 在Rabema中开发的“标准化发现间隔”度量与本研究中使用的回忆类似，只是它向下强调了映射到多个位置的读取。

Subread的速度几乎是最近的竞争对手Bowtie2的四倍(表1). Subread和最慢的对准器之间的速度相差30倍。即使调整为使用较小的内存占用，Subread的速度仍然是任何其他校准器的两倍以上。MrsFast和Maq为此数据集使用了大量内存，因为它们的内存使用取决于映射的读取数。本评估中使用的1000个基因组数据集给出了通过使用下一代测序技术在基因组变异检测领域中使用的读取数据的典型大小。Subread的速度使其适合于生产使用。

Subread的速度优势随着读取时间的延长而增加。对于映射202 bp读取，子读取速度是次快读取速度的7倍(补充表S1). 通过这样长的读取，只有Subread、Bowtie2和BWA能够成功完成任务。

接下来，我们比较了SEQC RNA-seq数据上的对准器。在这个RNA数据上，Subread绘制了迄今为止任何比对物读取百分比最高的图，同时保持了与DNA读取相同的相对速度优势(表2). 虽然此处可以使用TopHat或MapSplice等连接检测器来实现与Subread相当的映射百分比，但这需要>15倍的计算时间(表7)这使得这条路线对常规全基因组表达谱的吸引力降低。

Subread比以前的校准器更准确

检测指数

接下来，我们根据对准器检测已知indel的能力对其进行了评估。为了构建具有已知缺失的基因组，我们从人类参考基因组的第1染色体中提取了一个包含100万个碱基的长序列，并将缺失（以0.02%的速率）和SNP（以0.09%的速率）引入其中。然后，我们从该序列中包含缺失的位置提取了101个bp的读码，并记录每次读取中删除的位置和长度。删除可以位于读取的任何基本位置，除了第一个和最后四个基本位置。每次读取仅包含一个删除事件。为了评估对准器检测不同长度索引的能力，我们生成了16个数据集，涵盖从1到16 bp的每个可能的缺失长度。第一个数据集包括删除1 bp的读取，第二个数据集包含删除2 bp的读取等等。每次读取的基本质量分数都是从101 bp SEQC数据集中的读取中获得的。每次读取中的碱基都会根据其质量分数进行变异，以模拟测序错误，即碱基的质量分数越低，就越有可能被更改为不同的核苷酸。

图3显示了每个对齐器在检测每个累积删除大小的删除时的召回率和准确性。Maq和MrsFast不支持indel检测，因此不包括在此评估中（Maq仅支持对-end读取的indel检测）。我们添加了BWA-SW(37)在本次评估中。

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图3。

对准器在检测不同大小的删除时的性能。横轴给出了累计删除大小。对于每种尺寸，合并删除大小相等或较小的数据集，并用于计算每个对准器该尺寸的召回率和准确性。为了检测不同大小的删除，对齐器以其最佳设置运行。

发现Subread在准确性和召回率方面明显优于其他校准器。随着删除大小的增加，它也是唯一在准确性和召回率方面取得越来越高性能的对齐器。Subread在检测索引方面的优异性能应该归功于使用完全匹配的侧翼子读取来发现索引的能力。Novoalign的准确度位居第二。然而，它的召回率随着删除长度的增加而迅速下降，其召回率低于Bowtie2。鲍蒂2的召回率位居第二；然而，它的准确性是最差的。BWA-SW比BWA具有更高的准确性，但召回率更低。在本次评估中，发现BWA-SW和BWA在所有对准器中的性能最差。尽管本评估中仅包括缺失，但在检测插入时应观察到类似的结果。

正确映射模拟读取

接下来，我们检查了校准器将读数映射到正确位置的能力。我们首先使用了两个101 bp的模拟数据集，这两个数据集是从已删除重复区域的修改人类基因组生成的（材料和方法）。一组数据包含indels，另一组没有。每个数据集中的读取都有一个唯一的已知映射位置。

非del数据集使我们能够对不支持indel检测的对准器（包括Maq和MrsFast）进行公平比较。支持indel检测的对准器配置为禁用indel检测（如果可能），以便在使用此数据集进行比较时，可以按等效条件比较所有对准器。表4表明Subread在所有对准器中具有最高的精度。映射精度是指所有映射读取中正确映射读取的分数。Novoalign和Maq的精确度略低于Subread。Novalign的召回率略高于Subread；然而，Maq的召回率要低得多。召回率计算为所有读取中正确映射的读取的分数。Bowtie2在所有对准器中的召回率最高；然而，它的制图精度是最差的之一。发现BWA和MrsFast在所有对准器中的召回率和准确性都很低。

表4。

从过滤的基因组中生成的定位模拟读取的性能（重复区域被删除）

校准器	没有索引		带索引		时间（分钟）	内存（Gb）
	收入（%）	科目（%）	收入（%）	科目（%）
Subread（子读取）	95.96	99.72	95.58	99.31	16 (29)	7.6 (4.3)
鲍蒂2	99.04	99.41	98.65	99.03	66	3.3
BWA公司	81.06	99.22	80.24	98.50	205	2.4
Maq公司	90.56	99.69			622	5.9
诺沃利尼	95.99	99.69	95.57	99.29	91	8
最后一位女士	72.78	99.45			256	4.6

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使用了两个数据集。一个数据集包含索引，另一个不包含索引。列“Rec（%）”给出了数据集中所有模拟读取中正确映射读取的百分比，列“Acc（%）”给出了所有映射读取中正确映射读取的百分比。Maq和MrsFast不支持indel检测，因此对于包含indel的数据集，它们没有召回和准确度值。使用包含索引的数据集测量Subread、Bowtie2、BWA和Novoalign的运行时间和峰值内存使用量。括号中给出了设置为使用更少内存时Subread的运行时间和峰值内存使用量。

然后，我们使用包括indel的数据集来比较那些支持indel检测的对准器。在这里，一个正确映射的读取必须有一个正确的香烟串，此外还必须有参考基因组上的正确映射坐标，如最左边的碱基所示。CIGAR字符串描述读取中索引的位置和长度（如果有）。同样，发现Subread可以达到最高的绘图精度(表4). Novoalign的准确率和召回率略低于Subread。与映射不包含索引的数据集的性能类似，Bowtie2的召回率较高，但准确性较低。对于这个数据集，BWA的准确率和召回率都是最差的。

我们进一步比较了这些对准器使用的运行时间和峰值内存。Subread、Bowtie2、BWA和Novoalign使用的运行时间和峰值内存是在包含indels的数据集上测量的，而其他对准器是在不包含indels.的数据集中测量的。Subread是唯一允许调整用于读取映射的内存量的对齐器。研究发现，使用7.6 GB内存时，Subread的映射速度是其他对齐器的4-39倍，使用4.3 GB内存时是其2-21倍(表4). Subread之所以能够实现这种巨大的速度优势，主要是因为它具有高效的投票机制，不需要将种子序列扩展到所有其他对齐器正在执行的整个读取过程中的昂贵操作。

当绘制202 bp长读数时，Subread保持了比竞争对手校准仪更高的精度(补充表S1).

我们还使用未过滤的人类基因组进行了模拟，其中重复区域未被删除，以补充上述使用人类基因组独特区域的模拟。模拟读取由三个模拟器生成，包括Art、Mason和我们自己的模拟器（材料和方法）。调用正确映射的读取必须具有正确的CIGAR字符串。在这个模拟中，我们还尝试使用不同的截断来删除Subread的无信息子读取。与以前一样，Subread继续实现更好的映射精度和更高的映射速度，而灵敏度成本很低(表5). 在这里的所有比较中，发现Bowtie2的准确度最差，尽管它的回忆相对较好。

还可以看出，当使用更高的阈值删除无信息的子阅读时，子阅读的准确性更低，但召回率更高。准确性的降低应该是因为当使用更高的阈值时，仍有更多的无信息子读取，而这些无信息子读给映射带来了更多的歧义。我们倾向于使用较低的阈值（20–100）来支持映射准确性，尽管用户可以对其进行调整，以在准确性和所需的回忆之间取得平衡。更重要的是，Subread的速度优势几乎不受阈值选择的影响。

接下来，我们使用模拟数据检查了MQS用于测量读取对齐的置信度的程度。已发现MQS在下游分析中很有用，例如基因型分析人员使用MQS来提高变量调用的性能等(38).图4a和c显示，对于每个对齐器，与预期一样，使用高MQS映射的读取包含更少的错误对齐。这支持使用MQS作为查找高置信度读取对齐的方法。对于具有高到中等MQS的读取，Subread报告的正确对齐（召回率更高）比Bowtie2报告的要多，而对于具有中到低MQS的读，错误对齐报告的要少。请注意，每个对齐器都为多映射读取分配低MQS。对于MQS较高的读取，Novoalign的召回率似乎低于Subread，但对于MQS较低到中等的读取，召回率略好。请注意，绝大多数映射读取都被每个对准器赋予了高MQS。在梅森数据集中，BWA的召回率最高，但在我们的模拟数据集中，召回率最低。

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图4。

MQS对准器的召回和准确性。(一)和(c（c）)给出从高映射质量到低映射质量的正确映射读取和错误映射读取的累计数量。(b条)和(d日)显示了从高映射质量到低映射质量的累积精度和误差分数。（a） 和（b）使用表4、（c）和（d）使用中包含的Mason数据集表5。每个图中的每个点都对应于对齐器给定的MQS。在（a）和（b）中使用默认设置运行Subread，在（c）和（d）中使用-f 100。

在评估替代对准器相对于每个MQS的准确性时，我们使用误差分数而不是不正确对准的绝对数量，以考虑到不同对准器报告的不正确对准总数不同的事实。相对于MQS的错误分数秒计算为MQS等于或大于的错误映射读取数秒除以对准器报告的错误映射读取总数。相对于秒然后计算为MQS等于或大于的正确映射读取数秒除以MQS等于或高于的读取总数秒.图4b和d表明，Subread在每个MQS值的映射精度方面优于所有其他对齐器。综合起来，发现Subread与其他对齐器相比，在整个MQS范围内具有类似的召回率，但准确性更高。

我们感谢特里·斯皮德（Terry Speed）、拉斐尔·伊里扎里（Rafael Irizarry）和亚伦·伦（Aaron Lun）对手稿的批判性阅读，感谢莱明·施（Leming Shi）和查尔斯·王（Charles Wang）提供SEQC试点数据。