国际纳米医学杂志。2013; 8: 1563–1572.
小干扰RNA蛋白激酶C-alpha对dispase诱导的小鼠实验性增殖性玻璃体视网膜病变的抑制作用
,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和1
Qianying Gao公司
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
王文聪
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
于庆兰
2中华人民共和国广州中山大学附属第二医院眼科
陈晓青（Xiaoqing Chen）
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
魏阳
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
袁永光
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
胡安·谭
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
姚宗
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
姜兆新
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
1中华人民共和国广州中山大学中山眼科中心眼科国家重点实验室
2中华人民共和国广州中山大学附属第二医院眼科
版权©2013 Gao等人，出版商和持牌人Dove Medical Press Ltd 这是一篇开放获取的文章，允许无限制的非商业性使用，前提是正确引用了原始作品。
摘要
目标
评估小干扰RNA蛋白激酶Cα（siRNA PKCα）对dispase诱导的小鼠实验性增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的影响。
方法
通过玻璃体内注射dispase诱导C57BL/6小鼠PVR模型（4-6周龄），然后平均分为六组。1周后，五个治疗组分别接受2μL浓度为250 nM、500 nM、750 nM、1000 nM和1500 nM的siRNA-PKCα玻璃体内注射，而阴性对照组接受2μL浓度为500 nM的no-silencing siRNA。siRNA-PKC-α通过方波电穿孔器转染。术后定期进行晶状体清晰度和眼底的眼科观察。在4周观察期结束时，将小鼠眼球摘除并埋入最佳切割温度下进行组织学和免疫荧光分析。
结果
注射siRNA-PKCα4周后，250nM组晶状体溶解率为100%，PVR为100%，500nM、750nM、1000nM和1500nM组分别为70%、70%、70%和50%，与阴性组相比差异显著。眼底外观异常与siRNA PKCα浓度有关；siRNA-PKCα浓度越高，眼底越正常。眼部苏木精-伊红染色组织切片支持临床观察。免疫荧光分析显示，随着siRNA-PKCα浓度的降低，视网膜中的RPE65、谷氨酰胺合成酶、胶质酸性纤维蛋白和α-平滑肌肌动蛋白增加，表明眼内siRNA-PGCα可以部分抑制胶质细胞、成纤维细胞、，PVR过程中的视网膜色素上皮细胞和Müller细胞。
结论
用siRNA PKCα进行基因治疗可以有效抑制小鼠PVR，并为我们提供一个新的PVR治疗靶点。
关键词：蛋白激酶Cα，小干扰RNA，增殖性玻璃体视网膜病变
介绍
增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）发生率为5%-11%，是视网膜脱离修复术后复发性视网膜脱离的最常见原因。1,2基础研究表明，PVR的特征是形成瘢痕样纤维组织，其中含有来自转分化视网膜色素上皮（RPE）细胞的肌成纤维细胞，以及其他类型的细胞，如胶质细胞、，它们进入玻璃体并在玻璃体腔内和两个分离的视网膜表面诱导细胞膜收缩。三这种非肿瘤性眼内增生，以及其他实体，如增生性糖尿病视网膜病或创伤后后遗症，是发达国家失明的一些最重要原因。4PVR中这种多因素疾病的发病机制尚不完全清楚。5
蛋白激酶C（PKC）是磷脂依赖性丝氨酸-三氢嘌呤激酶的多基因家族，在信号转导中调节大量蛋白底物的磷酸化，并在细胞增殖、分化、有丝分裂和炎症反应等过程中发挥中心作用。6,7已有大量文献证明PKC家族参与RPE细胞的增殖、迁移、吞噬和凝胶收缩过程，8–14据报道，这些都与PVR的发病机制有关。我们还发现金丝桃素是PKC的一种特异性抑制剂，通过抑制Ca2+流入途径。15Tahara等人16和我们的团队17发现玻璃体内注射金丝桃素是一种安全有效的降低兔眼PVR的方法。迄今为止，已经克隆了至少12种PKC亚型，所有亚型都显示出不同的酶特性、组织表达和细胞内定位。18,19因此，PKC的特异性抑制剂可能抑制所有PKC亚型，其中大多数亚型不参与PVR。我们之前的研究描述了所有12种PKC亚型的表达模式，并表明10种亚型（PKCα、PKCβ我、PKCβ二、PKCδ、PKCɛ、PKCθ, ΡΚΟμ，PKCζ、PKCλ和PKCτ)存在于培养的人RPE细胞中，20这表明只有PKCα通过下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27影响人类RPE细胞的细胞周期进展和增殖基普1.21因此，我们假设PKCα抑制剂有可能成为PVR的治疗靶点，并且是比PKC抑制剂更特殊的靶点。
小干扰RNA（siRNA）是抑制基因表达的有效策略。考虑到我们可以通过化学修饰创造更大的siRNA稳定性，在本研究中，我们进一步研究了甲基化修饰的siRNA-PKCα（siRNA-PGCα）对小鼠实验性PVR的影响，并试图寻找一种新的治疗策略来抑制PVR。
材料和方法
老鼠
C57BL/6小鼠，4-6周龄，购自南方医科大学动物中心。畜牧业和实验程序由中山大学中山眼科中心动物研究委员会批准。所有动物均被安置在中山大学中山眼科中心（中华人民共和国广州）根据实验动物护理评估与认证协会指南维护的特定无致病性生物危害2级设施中。
dispase玻璃体内注射诱导PVR的体内模型
用dispase（Gibco）诱导60只C57BL/6小鼠PVR模型®如CantóSoler等人和Iribarne等人之前所述22,23和我们的团队。24,25用4.3%水合氯醛（0.01 mL/g）麻醉小鼠（中华人民共和国广州中山大学附属眼科医院）。他们用0.5%托吡卡胺扩瞳（中国沈阳新奇药业有限公司）。在右眼背鼻象限（1点钟）进行玻璃体内注射。此外，用装有30G针头的Hamilton注射器将浓度为0.2 U/μL的3μL dispase注入玻璃体腔。对照动物（n=10）注射3μL无菌生理盐水。
SiRNA-PKCα玻璃体内注射和转染
注射dispase一周后，60只小鼠被平均分为六组。五个治疗组接受2μL玻璃体内注射，浓度为250 nM、500 nM、750 nM、1000 nM和1500 nM siRNA-PKCα，并进行2′-O甲基化修饰（sense 5′-GAAUGAGCAA ACAGAAAdTdT-3′，antisense 5′-UUUCUUUG CUCUCAUUCdTdT-3'，中国广州瑞波生物技术有限公司），分别是。假设玻璃体腔的体积为10μL，眼睛中玻璃体腔最终浓度为50 nM、100 nM、150 nM、200 nM和300 nM。阴性对照组接受2μL 500 nM无荧光siRNA。将Hypromellose滴眼液（中华人民共和国广州中山大学附属眼科医院）滴入眼睛后，用电极（CUY650P7）接触角膜方波电穿孔器（CUY21EDIT，日本千叶市A A GENE Co，Ltd）。然后，根据以下参数转染玻璃体腔中的siRNA-PKCα：电阻：0.8–1.5 kohm；电压：80–100 V；pon：50毫秒；poff：950毫秒；数量：5；安培：0.080.15 A。然后观察小鼠4周。所有实验程序均遵循视力和眼科研究协会关于在眼科和视力研究中使用动物的决议。
随访检查
在玻璃体内注射siRNA-PKCα4周后，用手术显微镜或直接检眼镜检查和评估注射的眼睛，包括角膜、晶状体混浊、玻璃体内出血和眼底。由于玻璃体内出血和白内障在以前的研究中经常发生，26临床PVR样体征被定义为在我们之前的研究和本实验中的1周、2周和4周出现以下三种症状之一：视网膜皱褶、视网膜前膜和虹膜不均匀。24,25该评估系统由CantóSoler等人和Iribarne等人修改而来。22,23
注射siRNA-PKCα后视网膜PKCα水平
为了证明siRNA-PKCα的疗效，如我们之前报告的那样，我们使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分析检测了1500nM siRNA-PGCα注射后2周的视网膜PKCα水平。27
逆转录聚合酶链反应
使用Trizol提取治疗眼（n=5）和对照眼（n=3）的总核糖核酸（RNA）®试剂按照制造商的程序（Life Technologies）。用2%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。根据SuperScript协议，约1μg RNA被反转录®（生命科技）第一流合成系统。PCR扩增出编码PKCα和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的互补DNA：94℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃伸长45秒。引物序列是使用Primer3设计的(http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3www.cgi对于PKCα，正向引物为5′-GTTACCCGGCCAACGACT-3′，反向引物为5'-TCTTCACCTCATG-CACGTTC-3′。家政基因GAPDH被用作内部控制。正向引物为5′-TTGCAT-GGGAGTAACGAGA-3′，反向引物为5'-CAGGCAGTTGGTACAGG-3′。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分析。使用特定的计算机程序（Image J 1.43U软件；Wayne Rasband，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）确认信号强度的量化。
蛋白质印迹分析
用含有60 mM Tris、pH 6.8、2%（w/v）十二烷基硫酸钠、100 mM 2-巯基乙醇和0.01%（w/v）溴酚蓝的样品缓冲液溶解治疗眼（n=5）和对照眼（n=3）的视网膜样品。然后将裂解液在冰上孵育30分钟。使用细胞刮板刮取裂解液，并使用移液器收集，然后在4°C下离心30分钟。收集上清液并煮沸5分钟，并在−20°C下保存。处理人RPE细胞的细胞提取物进行Western blot分析。简单地说，在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上加载每孔30μg蛋白质。将蛋白质在250 MA下电转移到聚偏二氟乙烯膜（Merck Millipore，Billerica，MA，USA）上2小时，然后用含有5%脱脂奶和0.1%吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水封闭1小时，并用兔抗PKCα（Cell Signaling Technology，Inc，Danvers，MA，US）孵育过夜。用TBST清洗三次后，在室温下用辣根过氧化物酶结合二级抗体培养膜1小时，然后用TBST冲洗。按照制造商的说明，使用ECL试剂盒（Cell Signaling Technology，Inc）通过化学发光检测蛋白质的表达。GAPDH（Cell Signaling Technologies，Inc）被用作内部控制。
组织制备及组织学和免疫荧光分析
在注射siRNA-PKCα后4周处死用于组织化学研究的小鼠，并使用最佳切割温度（OCT；Sakura Finetek USA，Inc，Torrance，CA，USA）对解剖的眼睛进行冷冻保存。对于苏木精酶（HE）和免疫荧光染色，每个样品的连续6μm厚的切片被切割并解冻安装在聚赖氨酸涂层的玻璃载玻片上。对于共聚焦显微镜，使用两个一级抗体分别在室温下孵育约20小时，然后在黑暗中孵育大约1小时进行双重免疫染色。一级抗体用作RPE细胞（RPE65）、Müller细胞（谷氨酰胺合成酶[GS]）、，星形胶质细胞（胶质酸性纤维蛋白[GFAP]）和成纤维细胞（α-SMA）。每种一级抗体的稀释度和来源见通过省略主要抗体进行阴性对照。本研究中有三种二级抗体：R-藻红蛋白结合的山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G（1:10；Southern Biotechnology Associates，Inc，Birmingham，AL，USA）、R-藻红蛋白结合的羊抗鼠IgG（1:110；Souther Biotechlology Ass联社，Inc）和荧光素异硫氰酸标记的山羊抗兔IgG；KPL，Kirkegaard and Perry Laboratories，Inc，Gaithersburg，MD，USA）。切片在磷酸盐缓冲盐水中清洗四次（每次5分钟），并安装在防褪色溶液（中华人民共和国北京Applegen Technologies Inc）的盖玻片下，用蔡司激光扫描共焦显微镜（LSM 510 META；德国耶拿卡尔蔡司Meditec AG）进行观察。
表1
| 抗体 | 等级 | 的标记 | 来源 | 稀释 |
|---|
| RPE65型 | 小鼠单克隆抗体 | RPE细胞 | Abcam plc 332英国剑桥科学园 | 1:100 |
| GS公司 | 米勒细胞 | | Abcam plc 332剑桥科技园，英国剑桥 | 1:50 |
| GFAP公司 | 小鼠单克隆抗体 | 星形胶质细胞 | Abcam plc 332英国剑桥科学园 | 1:500 |
| α-SMA | 兔多克隆 | 成纤维细胞 | Abcam plc 332英国剑桥科学园 | 1:100比例 |
统计分析
结果表示为平均值±标准偏差。使用Kruskal-Wallis检验和单因素方差分析（ANOVA）确定治疗组和对照组之间的显著差异。值为Ρ<0.05被认为是显著的。
结果
注射siRNA-PKCα后PVR的发展
玻璃体内注射和方波电穿孔的电转染被证明是灵活的(). 注射地塞米松后，第一周内，注射地塞米的眼睛出现严重出血17%（10/60），轻度出血67%（40/60），无出血17%（10/60）。注射siRNA-PKCα4周后，250nM组晶状体溶解率和PVR均为100%（10/10）；然而，在500nM、750nM、1000nM和1500nM组中分别发现70%（7/10）、70%（7/10）、70%PVR和50%（5/10），这与250nM组和阴性组（100%）的PVR显著不同(). 眼底外观异常与siRNA-PKCα浓度有关；siRNA-PKCα浓度越高，眼底越正常。五个治疗组和一个阴性组的PVR百分比在统计学上存在显著差异（Kruskal-Wallis检验，x2= 5.5543,Ρ= 0.0187,).
小鼠体内的siRNA-PKCα玻璃体内注射和转染。(A类)使用配有30G针头的Hamilton注射器进行玻璃体内注射。(B)方波电穿孔电转染。
缩写：siRNA-PKCα，小干扰RNA-蛋白激酶C-α。
注射siRNA-PKCα4周后PVR发展。(A类)250nM和1500nM siRNA PKCα的临床PVR眼底照片，以及4周观察期结束时阴性对照的临床PVR眼底照片。250 nM siRNA-PKCα治疗组与阴性组相似，观察到明显的视网膜皱褶、视网膜前膜和不均匀的虹膜；然而，1500 nM siRNA-PKCα显示了视网膜动脉和静脉的径向分布。(B)五个治疗组和阴性对照组的百分比。
注：250nM组和阴性组的百分比与其他组的百分比有显著差异*P（P）<0.05。
缩写：增殖性玻璃体视网膜病变；小干扰RNA蛋白激酶Cα。
注射siRNA-PKCα后视网膜PKCα的表达
如所示和RT-PCR结果显示，与dispase注射组和对照组相比，注射siRNA-PKCα的组PKCα信使RNA（mRNA）显著下调（ANOVA，Ρ= 0.00018 < 0.01,Ρ=0.00010<0.01）。与mRNA水平的变化一致，注射siRNA-PKCα后PKCα蛋白与注射dispase组和对照组相比下降（ANOVA，Ρ= 0.00220 < 0.01,Ρ= 0.00490 < 0.01). 这些数据表明，注射siRNA-PKCα后，siRNA-PGCα可以降低视网膜PKCα的表达。
注射1500 nM siRNA-PKCα后的RT-PCR分析。
笔记：注射siRNA-PKCα后，PKCα信使RNA显著下调，而对照组和对照组则无显著差异（ANOVA**P（P）= 0.00018 < 0.01, *P（P）= 0.00010 < 0.01). GAPDH带用于定量。
缩写：逆转录聚合酶链反应；siRNA-PKCα，小干扰RNA-蛋白激酶C-α；蛋白激酶C-α；RNA、核糖核酸；方差分析；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
注射siRNA-PKCα后PKCα蛋白发生变化。
笔记：Western blot分析表明，PKCα与dispase注射组和对照组相比下降（ANOVA*P（P）= 0.00220 < 0.01, **P（P）= 0.00490 < 0.01). 42 kDa的β-肌动蛋白带用于定量。
缩写：蛋白激酶C-α；siRNA-PKCα，小干扰RNA-蛋白激酶C-α；方差分析，方差分析。
注射siRNA-PKCα后的病理变化
所有小鼠在注射siRNA PKCα4周后均通过组织学进一步证实。HE染色的冰冻切片显示，250nM组和阴性对照组的晶状体溶解率为100%，视网膜严重脱离；在500 nM、750 nM、1000 nM和1500 nM组中，视网膜脱离率分别为70%（7/10）、70%（7/10）、70%（7/10(). HE结果还显示，在500 nM、750 nM、1000 nM和1500 nM组中，注射siRNA-PKCα的两只眼睛、两只眼睛、两眼和三只眼睛的形态分别正常。因此，眼睛的组织切片进一步支持了临床观察。总之，与临床检查类似的数据表明，高浓度的siRNA-PKCα导致眼睛结构更加正常，并可以部分抑制PVR的发生。
注射siRNA-PKCα4周后眼部HE染色。
笔记：在阴性对照组、250 nM组、500 nM组和750 nM组中观察到玻璃体腔内的增殖膜和视网膜脱离；然而，与正常眼睛相比，1000nM组和1500nM组的视网膜结构正常。比例尺：100μm。
缩写：HE、苏木精和曙红；siRNA-PKCα，小干扰RNA-蛋白激酶C-α。
HE染色的冰冻切片清楚地显示出RPE和感觉视网膜之间明显的增生膜和视网膜脱离，以及视网膜和晶状体的破坏。在PVR发育过程中，RPE65、GS、GFAP和α-SMA标记细胞参与了小鼠PVR眼的发育。正常视网膜中RPE65和GS有微弱表达，表明小鼠视网膜中存在RPE细胞和Müller细胞。阴性对照组和250nM、500nM和750nM组的这些表达似乎比1000nM和1500nM组更为明显，如同样，正常视网膜中GFAP和α-SMA的表达较弱，表明小鼠视网膜中存在成纤维细胞和星形胶质细胞。与1000 nM和1500 nM组相比，阴性对照组和250 nM、500 nM和750 nM组的这些表达似乎更强，如.
注射siRNA-PKCα4周后RPE65和GS的免疫荧光分析。
笔记：正常视网膜RPE65（红色）和GS（绿色）有微弱表达；与1000和1500 nM组相比，阴性对照组以及250 nM、500 nM和750 nM组的视网膜前膜中的这些表达最为显著。比例尺：100μm。
缩写：视网膜色素上皮；GS，谷氨酰胺合成酶。
注射siRNA-PKCα4周后GFAP和α-SMA的免疫荧光分析。
笔记：正常视网膜中GFAP（红色）和（绿色）有微弱表达；与1000nM和1500nM组相比，阴性对照组以及250nM、500nM和750nM组的视网膜前膜中的这些表达似乎更为明显。比例尺：100μm。
缩写：胶质纤维酸性蛋白；α-SMA、α-平滑肌抗体；siRNA-PKCα，小干扰RNA-蛋白激酶C-α。
免疫荧光分析显示，视网膜中RPE65、GS、GFAP和α-SMA随着siRNA-PKCα浓度的降低而增加，表明眼内siRNA-PGCα可以部分抑制PVR过程中胶质细胞、成纤维细胞、RPE和Müller细胞标记物的变化。
讨论
在本研究中，我们在小鼠中建立了一个由dispase诱导的PVR模型，并发现高浓度的siRNA PKCα注射可以部分抑制PVR。
最近，使用dispase在小鼠和家兔眼睛中诱导PVR模型的趋势越来越明显。22–26,28,34Dispase，一种中性蛋白酶，分离自多粘菌芽孢杆菌由于其能够切割各种组织中的基底膜，因此能够采集和培养细胞，并且可以用作玻璃体内注射材料来诱导PVR。我们之前的数据显示，在小鼠的前房中发现了中性粒细胞和视网膜中发现了PVR样体征，玻璃体内注射dispase后，没有发生特异性免疫反应。24,25因此，在小鼠或家兔中建立的分离PVR模型是研究PVR发病机制的理想模型。
PKC是抑制PVR动物模型的有效生物靶点。兔模型也表明，玻璃体内注射特殊PKC抑制剂（金丝桃素）是降低实验性PVR的一种安全有效的方法。16,17我们以前的研究表明，培养的人RPE细胞中存在10种亚型，20他们还证明，只有PKCα影响人类RPE细胞的细胞周期进展和增殖。21此外，PKCα含量丰富，并被进一步选择用于治疗PVR。
由于PKCα抑制剂的局限性，siRNA是一种非常流行的抑制PKCα的方法。不稳定性是RNA治疗应用的主要障碍。如果不进行任何化学修饰，siRNA很容易被核酸酶降解，其内部半衰期很短，因此不能有效抑制目标基因的表达。对化学合成的siRNA进行适当的化学修饰是可行的。化学修饰后，可以增强siRNA的稳定性，延长其内部半衰期。这可以有效抑制靶基因的表达，有助于实现基因治疗。因此，为了提高siRNA的稳定性，在本研究中，我们在化学合成siRNA时引入了2'-O-甲基化修饰，并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化过程。
siRNA-PKCα的有效浓度对PVR的治疗靶点至关重要。在我们之前的体外研究中，单独用100 nM siRNA-PKCα孵育RPE细胞或从可折叠的囊性玻璃体中释放RPE细胞成功地抑制了PKCα的表达，并且其生长速度约为对照细胞的一半，为我们预防PVR提供了一种新的方法。21,27根据上述数据，选择了250 nM到1500 nM的五种浓度（最终眼部浓度：分别为50 nM、100 nM、150 nM、200 nM和300 nM），以确定哪种浓度对眼睛最有效。当前数据来自和–表明三种浓度的siRNA-PKCα（500 nM、1000 nM和1500 nM）可以部分抑制小鼠PVR，1500 nM是三种浓度中最有效的。
siRNA的传递可以在体外和体内用于靶向特定RNA，并降低靶细胞中特定蛋白产物的水平。转染方式对siRNA非常重要。脂质体2000和逆转录病毒常用作基因载体。在我们的研究中，使用Lipofectamine 2000将可折叠囊性玻璃体释放的siRNA-PKCα转染到人RPE细胞中，并成功抑制PKCα的表达。27病毒介导的siRNA传递将在体内持续复制，并会导致mRNA水平长期降低，这不利于正常病理恢复。电穿孔是应用最广泛的物理方法，可以改变膜的渗透性，使外源基因进入细胞。确切的机制尚不清楚，但据推测，短的电脉冲会扰乱细胞膜，并在细胞膜上留下孔洞，核酸可以通过这些孔洞。由于电穿孔简单快速，一旦确定了最佳电穿孔条件，它就能在短时间内转染大量细胞。35与其他方法相比，该方法具有高效、简便、易操作、重复性好、安全、适用范围广等优点。36因此，许多重要的靶向基因可以被传递，包括血管内皮生长因子（VEGF）和低氧诱导因子-1。37–42例如，Reich等人37据报道，在腺病毒诱导人VEGF转基因体内表达后，siRNAs可有效且特异性地抑制人细胞系中低氧诱导的VEGF水平。我们的结果还表明，通过电穿孔传递的高浓度siRNA-PKCα在基因和蛋白质水平上具有良好的敲除效果(和). 高浓度siRNA-PKCα注射液可部分抑制PVR；因此，本研究涉及电穿孔。进一步的研究正在进行中，以优化siRNA-PKCα并评估其在兔子或猴子大得多的眼睛中的药代动力学。
综上所述，siRNA-PKCα基因治疗能有效抑制小鼠PVR，为我们提供了一个新的PVR治疗靶点。
致谢
本研究得到了中华人民共和国国家科学技术计划的支持和国家“十二五”规划（2012BAI08B00）的资助。
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