活组织具有复杂的质量运输要求，主要通过心血管系统多尺度血管网络的血流来满足。这些血管向体内所有器官系统输送营养物质和氧气，并清除代谢副产物，对大规模多细胞生物的兴起至关重要[5]. 尽管在过去几十年里，从天然组织中分离和培养细胞取得了巨大进展，但即使是最基本的血管构筑物也无法维持以生理细胞密度填充的组织构建物的简单方法仍然难以捉摸。
在工程组织中创建可灌注通道，层层组装[6–9]已经过探索。在这种方法中，沟槽被模制成一层，这样第二层单独制作的层就可以对齐并层压，从而以迭代的方式关闭盖子以形成通道。然而，逐层装配速度较慢，会在整个构件中产生接缝或其他结构瑕疵，同时对制造过程中使用的材料、通道和单元施加相当大的设计约束。生物打印[10]在过去的十年中，细胞和基质是逐滴沉积的，但这是一个缓慢的串行过程，对打印分辨率、材料和细胞都有限制。与这些方法相比，3D牺牲造型[11–13]提供了一个有趣的选择。经得起验证的研究表明，可以通过创建由细丝构成的刚性3D晶格，将晶格浇铸成橡胶或塑料材料，然后牺牲晶格以揭示块体材料中的微流体结构，来制造通道网络。然而，到目前为止，可灌注通道的3D牺牲成型需要使用细胞毒性有机溶剂或处理条件来去除牺牲丝或铸造周围材料，因此无法使用基于水的ECM或在活细胞存在的情况下完成。
在这里，我们描述了一种生物相容的牺牲材料——一种由廉价且易得的碳水化合物混合物制成的简单玻璃——以及一种3D打印材料的方法，以便于在工程组织中快速铸造有图案的血管网络。这种碳水化合物玻璃配方是专门为适应我们确定的生物相容性3D牺牲材料的两个看似对立的设计标准而开发的：1）足够的机械刚度，以在纤维的开放3D晶格中物理支撑其自身重量；2）快速溶解并具有生物相容性活细胞的存在。
碳水化合物玻璃可以通过将一种或多种碳水化合物溶解在水中，然后将溶剂煮沸而形成。我们早期的实验基于食品工业开发的蔗糖-葡萄糖混合物，该混合物表明，虽然蔗糖在过饱和溶液中不稳定，但添加葡萄糖可以防止再结晶，并有助于形成稳定且廉价的玻璃[14]. 这种简单的混合物吸湿性太强，太软，难以处理。在材料优化和潜在添加剂筛选过程中，我们发现淀粉的添加使基材变硬，但它的光学清晰度较差，因此对通常通过光化学反应交联的基质的潜在用途有限[15,16]. 相反，甘油的加入保持了纤维的透明度，但在室温下使纤维在机械上不稳定。最终，我们通过加入右旋糖酐进一步增强了玻璃并提高了其温度稳定性。单轴压缩试验证实，碳水化合物玻璃在室温下具有机械硬度和脆性(). 玻璃的光学透明度表明，玻璃在紫外线、可见光和近红外范围内与光聚合波长兼容，因此玻璃不太可能在光活性支架中留下阴影伪影().
碳水化合物玻璃材料特性和灯丝结构形成。(一)单轴压缩试验的应力-应变曲线表明，碳水化合物玻璃在25°C下是一种硬脆材料，杨氏模量=1 GPa（在线性状态下测量），最大强度为28 MPa，最大应变为3.25%。(b条)1 cm碳水化合物玻璃样品的光学消光表明，该材料可以传输生物相容性成像和光聚合过程中常用的波长（365–550 nm，阴影框）。(c（c）)在热挤压和3D打印过程中，长丝直径由挤压喷嘴的移动速度控制，并遵循玻璃纤维拉伸的简单幂律（等式插图）。(天)多尺度碳水化合物玻璃格子（绿色）的建筑设计。(e（电子）)多尺度建筑设计的俯视图（d）3D打印在碳水化合物玻璃中（比例尺=1 mm）。界面熔融熔融被放大并显示在侧视图中（比例尺=200µm）。(（f）)多层晶格在几分钟内制成，具有精确的横向和轴向定位分辨率（比例尺=1 mm）。(克)一种多尺度结构，显示单个1 mm灯丝（顶部）连接到较小互连灯丝的成角阵列（比例尺=1 mm）。(小时)也可以制造串联y型接头和弯曲灯丝（比例尺=1 mm）。
多尺度血管网络由一系列血管直径及其相互连接组成。热挤压和用3D打印机绘制纤维——一种可编程的笛卡尔坐标定位系统——为丝状碳水化合物玻璃晶格的制造提供了一条有效的途径。通过仅改变挤压喷嘴的平移速度，同时保持喷嘴直径和挤压流量参数不变，挤压长丝直径遵循控制方程：
哪里D类(v（v）)是合成的灯丝直径，A是一个常数，包含挤压喷嘴直径和挤压流量，以及v（v）是挤压喷嘴的速度(). 这种关系源自现有的玻璃纤维拉伸模型[17]并允许以预定义、多尺度和可复制的模式生成碳水化合物玻璃晶格(). 此外，控制装配平台的温度有助于在纤维交叉处形成平滑的熔体熔融().
接下来，我们试图使用这些晶格作为牺牲元素，在整体细胞化组织结构中创建流体通道(). 在我们的策略中，将细胞悬浮液倒入ECM预聚物中以封装晶格。在交联ECM后，玻璃丝溶解形成血管，而玻璃丝间的融合成为血管间连接(). 为了防止ECM交联破坏，并避免因碳水化合物溶解而对封装细胞造成渗透性损伤，我们在铸造ECM之前用一层薄薄的聚（D-乳酸-聚乙二醇）（PDLGA）涂层碳水化合物玻璃晶格。这种涂层允许溶解的碳水化合物从形成的通道中流出，而不是通过工程结构的主体(和补充电影1). 重要的是，涂层并没有抑制网络支持对流和扩散传输到散装凝胶的能力(). 此外，我们观察到，牺牲后，玻璃纤维间融合留下光滑的椭圆形血管间连接，支持相邻血管通道之间的流体连接。
包含有图案的血管结构和活细胞的整体组织结构。(一)示意图概述。一个开放的、相互连接的、自支撑的碳水化合物玻璃格子被3D打印出来，作为血管构筑物铸造的牺牲元素。晶格与活细胞一起被封装在ECM中。晶格在细胞培养基中溶解几分钟，不会对附近的细胞造成损害。该过程产生了一个整体组织结构，其血管结构与原始晶格相匹配。(b条)将单个碳水化合物玻璃纤维（顶部直径200µm）封装在纤维蛋白凝胶中。ECM交联后，将凝胶和长丝浸入水溶液中，溶解的碳水化合物从产生的通道（中间）流出。去除纤维丝会在纤维蛋白凝胶中形成开放的灌注通道（底部，标尺=500µm）。请参见补充电影1全日制课程。(c（c）)具有不同直径图案互连通道的纤维蛋白凝胶支持注入通道网络的荧光葡聚糖的对流和扩散传输（左上角，相位对比，标尺=500µm）。凝胶和通道的归一化荧光线图（蓝色箭头）显示了通道中的正弦曲线（在黑色虚线之间），具有圆柱体和从通道到散装凝胶的时间扩散特性。虚线框区域的放大显示了两个垂直通道之间的椭圆形血管间连接（右侧，比例尺=100µm）。(天)将组成性表达EGFP的细胞封装在多种ECM材料中（5e6/mL），然后用共焦显微镜成像，以可视化示意图所示的基质（红色珠子）、细胞（10T1/2，绿色）和可灌注血管腔（蓝色珠子）(右下角). 这些材料具有不同的交联机制（如上图所示），但都可以通过血管通道形成图案。比例尺=200µm。(e（电子）)培养两天后，将未标记的HUVEC（1e6/mL）和10T1/2（1e6mL）共培养物（不表达EGFP）的代表性横截面图像均匀封装在纤维蛋白凝胶（10 mg/mL）的间隙中，并在可灌流网络中，用荧光活/死分析染色（绿色，钙蛋白AM；红色，埃塞俄比亚同二聚体）。细胞存活并在开放的圆柱形通道附近扩散（用白色箭头突出显示）。比例尺=200µm。
为了证明这种方法的灵活性和通用性，我们在多种天然和合成ECM材料中的活细胞存在下对血管通道进行了模式化(). 将细胞和晶格封装在ECM预聚物中、ECM交联和玻璃溶解所需的时间约为分钟。重要的是，我们选择的ECM材料不仅在体积材料属性上有所不同，而且在交联方式上也有所不同。事实上，该方法生成了通道，而无需修改由链缠结（琼脂糖冷却）、离子相互作用（钙聚合海藻酸盐）、光聚合（合成聚乙二醇水凝胶[18])酶活性（凝血酶聚合纤维蛋白）和蛋白质沉淀（基质加温）。从碳水化合物玻璃的光学透明度表征中可以预测，由于图案化玻璃晶格的光吸收，光聚合凝胶没有显示出可见的阴影伪影。据我们所知，没有其他通道形成技术与如此广泛的ECM材料兼容。这种方法似乎对细胞没有负面影响。封装的细胞在通道支架中存活、扩散和迁移，其水平与非通道对照凝胶没有差异，证明了整个血管浇铸过程的生物相容性(). 在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、10T1/2细胞、人成纤维细胞和人胚胎肾（HEK）细胞中也发现了类似的活性（数据未显示）。
由于碳水化合物玻璃晶格的机械刚性和自支撑性，将3D多层结构引入工程血管系统不需要额外的限制、时间或牺牲过程的步骤(补充图S1a). 为了证明这种血管铸型方法与通常对组织工程很重要的额外设计考虑的兼容性，我们在组织构建物中制造了复杂的细胞和固定因子梯度，其中也包含我们的通道(补充图S1b). 分析这些组织结构(补充图S1c)证明在含有可灌注血管通道的单个工程组织构建中，可以将构建中的细胞或固定因子模式化为阶梯、线性和指数梯度。这里，细胞与固定化荧光珠一起被封装，作为模型因子，但这项技术应该很容易转化为固定化梯度的粘附肽[19]、蛋白质和生长因子[20–22]或ECM本身[23,24]. 总之，这些结果表明，组织构建的可用设计参数空间首次不受图案化血管通道和连接的阻碍。
从概念上讲，血管化的实体组织可以被简化为一个“血管单位细胞”，由三个关键隔间组成：1）血管腔，它既是大多数可溶性因子的源细胞，又是汇细胞；2）内皮细胞排列在血管壁上，调节与间质的物质运输交换，和3）存在于血管通道之间的间质区中的细胞和基质(). 在这里，我们展示了在工程组织构建中对每个隔间的控制。凝胶的整体性质（由一步聚合产生）和缺乏结构接缝，支持在正压下用层流或湍流脉动流进行人体血液的无泄漏灌注(和补充电影2和3)光滑的通道间连接支持分支流体流动。内皮细胞通过网络中的一个入口接种，迅速排列在整个网络的壁上，包括不同直径血管之间的连接处(). 由于内皮细胞是在形成组织后形成的，这些细胞及其种子是从填塞在间质区的细胞中独立引入的。在与10T1/2细胞在间质空间的共培养中，血管腔内的内皮细胞被10T1/2的细胞包围，并形成从有图案的血管系统延伸到大块凝胶中的单细胞和多细胞芽().
演示了对血管化实体组织的三个关键隔间的控制，如图所示(一)由于“血管单位细胞”由血管腔、血管壁内衬的内皮细胞以及含有基质和包膜细胞的间质区组成。(b条)花纹血管通道支持人体血液的正压和脉动流，血管间连接支持分支流体流动（左）。螺旋流型(正确的，0.4秒）是通过圆柱形通道的非层流的特征。请参见补充电影2和3，比例尺=1 mm，左侧；2 mm，右侧。(c（c）)通过将10T1/2细胞（1.5e6/mL，组成性表达EGFP）封装在纤维蛋白凝胶（10 mg/mL）的间隙中，然后接种HUVECs（组成性表达mCherry），证明了血管化组织构建物的间质区和衬里内皮的控制通过单腔注射贯穿整个血管网络（参见方法). 在培养一天后，共焦z堆叠蒙太奇显示HUVEC位于血管空间，10T1/2均匀分布在整个凝胶中。比例尺=1 mm(天)两个交叉通道的部分z堆叠显示通道壁和血管间连接处的内皮化，而在周围的大块凝胶中，可以看到10T1/2细胞开始在3D中扩散。请参见补充电影4对于完整的700µm z堆叠(天). (e（电子）)在培养9天后，典型通道的横截面成像（光学厚度和z位置=10µm）表明，血管腔内的内皮单层被10T1/2细胞包围。比例尺=200µm。(（f）)内皮细胞从有图案的脉管系统中形成单细胞和多细胞芽（箭头），如从凝胶内部较深处的z堆栈（光学厚度=200µm）所示（z位置=300µm，左边). 更深入的成像（z位置=950µm，光学厚度=100µm，正确的)证实了血管腔在整个血管和血管间连接处保持开放，内皮细胞也从较大的血管（箭头）中发芽。请参见补充电影5对于完整的1 mm z堆叠(e、 （f）).
由于缺乏足够的物质运输，细胞密集的工程结构可能会形成坏死的核心[1]. 因此，这种工程化血管系统的一个主要功能要求是其在代谢要求较高的环境（如生理上的高细胞密度）中维持细胞活动的效用。为了便于对如此密集的结构进行成像，我们在矩形结构的中心生成了单层平行射流通道。作为细胞功能和活性的测量，我们检测了插入HEK293T细胞的组成性表达慢病毒盒中不稳定EGFP的表达。与细胞均匀分布的整体板状凝胶仅在凝胶周长处表现出细胞活性(). 相反，具有通道的凝胶拯救了凝胶核心中的蛋白质表达，在每个灌注通道周围最为显著。这种细胞功能的保存依赖于灌注，因为在没有灌注的通道附近没有EGFP表达（数据未显示）。我们还通过组成分泌型Gaussia荧光素酶报告子的功能酶分析，观察了这些结构中更广泛的细胞密度。在低细胞密度下，单独的扩散能够在块状凝胶中维持细胞功能(). 随着组织结构的营养需求随着细胞密度的增加而增加，高斯藻的产量开始趋于稳定。通过通道脚手架的对流输送克服了这一限制。细胞代谢活性的维持()以及功能蛋白和酶的分泌()是许多类型工程组织的重要功能输出[25]两者似乎都是由我们的工程血管系统维持的。这些结果共同说明了模式化灌注通道结构的能力，以在生理细胞密度或接近生理细胞密度时向3D细胞培养提供功能性物质传输。
灌注通道在稠密组织结构的核心维持细胞代谢功能。(一)培养三天后，含有40e6 HEK细胞/mL的PEG水凝胶的代表性横截面图像蒙太奇。细胞内dsEGFP报告器在空间上表明细胞在凝胶板周长和灌注通道周围活跃，但在凝胶核心的其他地方不活跃。比例尺=2 mm(b条)对这些结构体分泌的高斯荧光素酶进行的功能酶分析表明，即使在高细胞密度下，通道结构也能保持细胞功能，而平板凝胶中的功能会迅速下降(c（c）)培养8天后，用荧光活/死分析（绿色，钙调素AM；红色，乙炔二聚体）对原代大鼠肝细胞（24e6肝细胞/mL）和琼脂糖凝胶中稳定基质成纤维细胞（平板与通道）进行染色。细胞在凝胶周边和灌注通道附近存活，在凝胶中存活的时间更长。比例尺=1 mm(天)白蛋白分泌评估(顶部)和尿素合成(底部)培养8天后，通过凝胶中的原代肝细胞（16e6/mL）在通道凝胶中显示出与平板凝胶相比改善的肝功能。误差条表示通道与平板凝胶比较的标准误差，p值：*<0.0051；<0.045.
尽管这些数据证明了该方法在支持转化细胞系方面的实用性，但临床植入工程组织最终所需的原代薄壁细胞通常无法耐受与长时间悬浮和缺氧相关的应激。因此，我们设计了含有原代肝细胞的可灌注凝胶，已知其对缺氧和处理高度敏感(). 在培养8天后，与相同体积的平板凝胶（无通道凝胶）相比，可灌注组织表现出明显更高的白蛋白分泌和尿素合成(). 这些结构的光学切片显示，在高细胞浓度下，细胞存活在灌注通道附近最为普遍，并呈放射状衰减，这与在dsEGFP表达的HEK293T细胞中观察到的模式以及向包埋细胞输送营养物的三维有限元模型相一致(补充图S2). 这些结果共同说明了这种策略在支持由甚至高度敏感的原代细胞组成的工程组织的功能方面的实用性。
现有的制造含有微流控网络的细胞凝胶的方法需要精确堆叠和层压单独制造的层的精细过程[6–9]. 在这项研究中，我们发现牺牲碳水化合物玻璃晶格非常适合创建具有灌注血管通道和连接的密集组织结构。我们的方法的一个关键优点是，通过填充碳水化合物玻璃晶格周围的三维空隙体积并交联基质，整个可灌注支架形成一个连续相。细胞被封装在ECM中，由此形成的组织结构可以在几分钟内灌注。我们相信，这一过程的极快速度阻止了制造过程中代谢需求细胞坏死核心的形成。此外，流体网络的微观结构特征，如容器直径、圆形度、表面粗糙度和结结构，源于纤维拉伸和表面张力，而不是光刻或微机械加工。依靠简单的物理原理，而不是工程过程，使得低精度硬件能够在含有活细胞的水基生物材料支架中快速且可重复地生成多尺度微血管结构。
此外，纤维网络的3D微加工与细胞和ECM处理之间的过程分离允许将该技术传播到远程研究实验室。为了在当前的研究中说明这一特征，碳水化合物玻璃晶格在实验室之间的环境条件下运输。然后通过标准的手动移液步骤将原代肝细胞包裹起来，以快速形成可灌注的肝组织或不可灌注的对照凝胶。无需在内部构建网络即可访问此血管化策略，这可能有助于快速采用该技术。
工程化3D构造越来越受到关注在体外用于研究细胞-细胞和细胞-基质相互作用的工具，并正在探索作为人体组织的实验模型或治疗替代物的潜在用途。然而，除了无血管或薄组织外，很难达到天然组织的细胞密度（大约每毫升1000万到5亿个细胞）。这里描述的方法展示了一种构建和研究此类组织模拟的方法，其中血管系统似乎不限制组织本身的设计空间，允许任意的细胞类型、基质及其图案。结合微流体设备技术的进步[26,27]这些工程流体网络的受控结构也可以提供一种直接检查特定组织的质量传输需求与血管结构之间相互作用的方法。此外，这种可灌注组织制造策略的易用性和高度自动化特性应为广泛的特定应用提供一个灵活的平台，并可将密集的组织结构缩放到任意大小。
