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生物化学杂志。2012年4月20日；287(17): 13752–13760.
2012年3月5日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M111.337469号
预防性维修识别码：PMC3340185型
PMID：22393046

Lys-138的RhoGDI SUMO化增加其与Rho GTPase的结合活性及其抑制癌细胞运动*

余建秀，‡,1 张东云，‡,1 刘金一（Jinyi Liu），‡,1 李靖霞，‡ 余永辉，‡ 吴学儒，§和黄传书‡,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

背景：RhoGDI影响小Rho GTPase的生物活性，从而调节肌动蛋白聚合和细胞运动。

结果：Lys-138的RhoGDI SUMO化对RhoGDI在细胞运动中的功能至关重要。

结论：XIAP对RhoGDI SUMO化的调节在调节癌细胞Rho GTPase活化中起着关键作用。

意义：我们的研究揭示了XIAP介导癌细胞侵袭和转移的分子基础。

关键词：癌症生物学、细胞运动、细胞骨架、Rho-GTPases、XIAP、Rhogdi、环结构域、Sumoylation

摘要

Rho-GDP解离抑制剂（RhoGDI）可以与小GTPase结合，使其在细胞质中处于生物非活性状态，从而影响肌动蛋白聚合和细胞运动。然而，RhoGDI如何调节Rho-GTPase复合物形成/膜提取/GTPase解离的机制在很大程度上尚未探索。我们之前的研究报告称，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）通过其RING结构域与RhoGDI相互作用，并负调控RhoGDI-SUMO化和HCT116癌细胞迁移。在这里，我们确定RhoGDI SUMO化特异性地发生在Lys-138，这被XIAP结构域抑制。我们进一步证明，Lys-138的RhoGDI SUMO化对抑制肌动蛋白聚合和细胞骨架形成以及癌细胞运动至关重要。此外，与未经SUMO酰化的RhoGDI相比，SUMO-RhoGDI对小Rho-GTPase具有更高的结合亲和力。总之，我们的研究证明了RhoGDI的一种新修饰，即Lys-138处的SUMO酸化，它在调节癌细胞中Rho GTPase激活中起着关键作用。XIAP环结构域对RhoGDI SUMO化的生理调节可能解释XIAP对癌细胞侵袭和转移的调节。

关键词：癌症生物学、细胞运动、细胞骨架、Rho-GTPases、XIAP、Rhogdi、环结构域、Sumoylation

介绍

小Rho-GTP酶参与调节肌动蛋白细胞骨架事件，包括局部粘连、应力纤维形成、跛足和丝状足、膜皱褶、细胞运动和细胞形态(1). Rho-GTP酶在细胞质中不活跃的GDP-结合形式和质膜中活跃的GTP-结合状态之间循环(2). Rho-GDP解离抑制剂（RhoGDI）三是小Rho GTPase生物活性的关键下调因子(三). 人们普遍认为，RhoGDI与小Rho GTP酶的非活性GDP结合形式结合，控制GTP酶在胞质溶胶和膜室之间的分配(4). 据报道，RhoA和Cdc42的磷酸化促进了GTPase-RhoGDI复合物的形成以及从膜中提取GTPase(5，6). 同时，RhoGDI的磷酸化促进Rho GTPase从Rho GDI中分离(7，8). 然而，复合物形成/膜提取/GTP酶解离的一般机制在很大程度上尚未探索。

小泛素样修饰物（SUMO）是一种可逆的翻译后蛋白修饰物。SUMO化提供了一系列改变蛋白质定位、相互作用、稳定性和活性的功能(9). 我们最近的研究表明，X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）能够与RhoGDI蛋白相互作用，抑制RhoGDI-SUMO化，随后调节HCT116细胞的细胞骨架形成和细胞运动(10). 然而，RhoGDI的特定SUMO化残基以及RhoGDI-SUMO酸化对Rho GTPases活性的影响尚不清楚。在这里，我们确定了Lys-138处的RhoGDI SUMO化，这对其抑制Rho GTPases活性、细胞肌动蛋白聚合和细胞运动的功能至关重要。我们还证明了XIAP RING结构域在减弱RhoGDI SUMO化中的一种新的生物功能，这降低了RhoGDI功能，进而促进肌动蛋白聚合、细胞骨架重组和癌细胞侵袭。总之，我们的研究揭示了XIAP调节癌细胞侵袭和转移的新机制。

材料和方法

质粒

表达HA标记XIAP、HA标记XIAP-ΔRING、HA-标记XIAPΔBIR和pEBB-HA表达空载体的质粒是Colin S.Duckett博士（德克萨斯大学奥斯汀分校）赠送的(11). 表达绿色荧光蛋白（GFP）标记的RhoGDI和Rac1/pcDNA3的pEGFP-C3/RhoGDI-载体由Mark R.Philips博士（纽约大学医学院）提供。人RhoGDI蛋白SUMO化位点突变的三对引物如下：K105R，5′-TCG TTT GTG CTG A Gg GAG GGT GTG GAG-3′和5′-CTC CAC ACC CTC CcT CAC AAA CGA-3′；K138R，5′-AGG AAA GGC GTC AGG ATT GAC AAG ACT-3′和5′-AGT CTT GTC AAT CcT GAC GCC TTT CcT-3′；K199R，5′-AAT CTA ACC A TC AgG AAA GAA TGG AAA-3′和5′-TTTT CCA TTT CcT GAT TAG A-3′。使用QuikChange定点突变试剂盒（圣地亚哥Stratagene）引入突变。所有结构均通过测序确认。

抗体和其他试剂

抗体（抗HA、XIAP和GFP）购自Cell Signaling Technology，Inc.（波士顿）。琼脂糖结合的抗HA抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加利福尼亚州圣克鲁斯）。琼脂糖结合的抗Rac1抗体和抗RhoGDI（兔子）抗体来自Millipore。抗-FLAG抗体来自Sigma。GADPH特异性抗体从Cell Signaling Technology，Inc.（波士顿）或Sungene Biotech（中国天津）获得。俄勒冈州绿488卵磷脂和Alexa Fluor 594卵磷脂来自Invitrogen。

细胞培养和转染

野生型和XIAP−/−HCT116细胞（人类结肠癌细胞系）是Bert Vogelstein博士（马里兰州巴尔的摩霍普金斯医学院霍华德·休斯医学研究所和西德尼·金梅尔综合癌症中心）赠送的礼物(12). 将其培养在补充有10%胎牛血清（FBS、Nova-Tech、Grand Island、NE）和青霉素/链霉素（Invitrogen）的McCoy 5A培养基中。所有细胞均保存在37°C的加湿培养箱中，培养箱中含有5%CO2增湿的大气。细胞转染采用脂质体己内酰胺试剂（Invitrogen）或FuGENE®HD转染试剂（Roche Applied Science）进行。为了实现稳定的转染，对培养物进行潮霉素B或G418或嘌呤霉素（Invitrogen.）药物选择，并将从抗生素选择中存活的细胞合并为稳定的大规模转染剂。在实验中使用之前，这些稳定的转染体在选择的无抗生素培养基中培养至少两代。

伤口愈合试验

将细胞接种到6孔板的每个孔中，培养至80%汇合。伤口由无菌吸管尖端造成。用无血清PBS冲洗细胞，然后在正常培养基中培养不同时间点。每24小时拍照一次，直到伤口在亲代细胞中愈合(13). 使用细胞迁移分析软件（Muscale LLC，Scottsdale，AZ）对伤口面积进行量化。

细胞侵袭试验

BD BioCoat TM基质TM（TM）侵入室（BD Biosciences）用于侵入测定。电池（2.5×104)在500μl无血清McCoy’s 5A培养基中对每个插入物进行三次播种。将插入物放置在含有500μl含5%FBS和12-O（运行）-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（20 ng/ml）。36或72小时后，用棉签擦拭，将过滤器上表面上的细胞完全清除。用锋利的手术刀切开膜，并将其放置在一个96度的钢板中。通过CellTiter-Glo®发光细胞活性测定（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测定入侵/迁移细胞的水平。侵入率（%）=（侵入细胞的ATP活性/迁移细胞的ATP活动）×100%。

细胞增殖分析

活细胞（1×10三)悬浮在100μl补充有10%FBS的完整培养基中，分三次播种到96个平板中。在37°C下，在5%CO的增湿环境中培养平板2在不同时间点用50μl裂解缓冲液提取细胞。使用CellTiter-Glo®发光细胞活力测定试剂盒（Promega）测量细胞生长。结果表示为相对增殖率，计算如下：增殖率=ATP活性n个第天/ATP活动为0天。

用镍分析His-tagged SUMO1共轭物2+-NTA-Agrose珠子

在之前的研究中描述了这种分析His-tagged SUMO1的方法(14)并进行了一些修改。简单地说，293T或HCT116细胞与FLAG-UBC9和His一起转染了各种构建物6-SUMO1（每个2μg），使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。转染48小时后，收集细胞，用NEM-RIPA缓冲液提取25%的细胞作为输入。剩余75%的细胞在3ml His溶解缓冲液中溶解，并与60μl Ni孵育2+-NTA-agrose珠子（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen），在4°C下旋转过夜。在室温下，用750μl以下缓冲液每个步骤清洗珠子5分钟：清洗缓冲液1、清洗缓冲液2、清洗缓冲区3、清洗缓冲层4(14). 最后一次清洗后，他的6-标记的磺胺酰化产物在室温下通过在75μl洗脱缓冲液中孵育珠子20分钟进行洗脱。洗脱液经Western blotting分析。

免疫荧光染色和共焦显微镜

HCT116及其转染物在10%FBS-McCoy’s 5A培养基的盖片上培养48 h。细胞用3.7%多聚甲醛固定15 min，然后用0.1%Triton X-100在PBS中室温渗透15 min。然后用1%的BSA/PBS封闭细胞30分钟，在室温下用Oregon-conjugated phalloidin孵育30分钟，然后用0.1μg/ml DAPI染色1分钟。用PBS清洗玻片三次，并用防臭试剂（分子探针）固定。在共聚焦显微镜（徕卡DMI6000B）下观察细胞。

免疫沉淀

用所示质粒转染的细胞在细胞裂解缓冲液（1%Triton X-100，150 m）中进行裂解米氯化钠，10米米Tris，pH 7.4，1 m米乙二胺四乙酸，1米米EGTA，0.2米米纳三VO（旁白）40.5%Nonide P-40和罗氏应用科学公司的全蛋白混合物抑制剂）。通过蛋白质定量测定试剂盒（Bio-Rad）测定蛋白质浓度。通过用蛋白A/G加糖（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）孵育预处理裂解液（0.5 mg），然后用抗Rac1抗体结合琼脂糖珠孵育过夜（Millipore，Temecula，CA）。用细胞裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物三次，并进行蛋白质印迹分析。

RhoA/Rac1/Cdc42活性测定

为了测量内源性小GTPase活性，使用Rho/Rac/Cdc42活化分析组合试剂盒（Cell Biolabs Inc.，圣地亚哥）。简单地说，细胞在1×分析/溶解缓冲液中的冰上溶解10分钟。细胞溶解物离心10分钟（14000×克4°C），上清液与Rhotekin RBD或PAK PBD-琼脂糖珠在4°C下在旋转器上培养1小时。用0.5 ml 1×检测缓冲液将珠子清洗三次。蛋白质样品用1×SDS-PAGE样品缓冲液洗脱，并用抗RhoA、Rac1和Cdc42抗体进行蛋白质印迹。

西方印迹法

用细胞裂解缓冲液（10 m）制备细胞提取物米三重HCl，pH 7.4，1%十二烷基硫酸钠，1m米纳三VO（旁白）4)，蛋白质浓度由蛋白质定量分析试剂盒（Bio-Rad）测定。用SDS-PAGE分离30μg蛋白质，然后用指示的一级抗体和碱性磷酸酶结合的二级抗体进行检测。如前所述，通过增强化学荧光Western印迹系统检测信号，并使用磷光成像仪（型号Storm 860，GE Healthcare）进行扫描(15，16). 用TotalLab Quant软件定量分析Western印迹条带的密度。

统计学方法

学生的t吨试验用于确定不同转染剂之间细胞增殖、伤口愈合和细胞侵袭差异的显著性。差异将在第页≤ 0.05.

结果

Lys-138发生RhoGDI SUMO化

SUMO的翻译后偶联作用对靶蛋白产生广泛的影响，包括蛋白质构象、活性、定位和蛋白质相互作用的改变(17). 我们最近的研究表明，XIAP与RhoGDI结合，并对RhoGDI蛋白SUMO化有潜在影响(10). 为了进一步确定RhoGDI中的SUMO化受体位点，我们首先使用Abgent SUMOplot分析了RhoGDI的潜在SUMO酸化残基TM（TM）程序。如所示图1一个在三个赖氨酸残基Lys-199、Lys-138和Lys-105（标记于大胆的和下划线的). 我们将三个假定的赖氨酸残基突变为精氨酸，然后用His转染点突变RhoGDI构建物6-SUMO1和FLAG-Ubc9进入293T细胞(图1B类). 我们使用镍进行了SUMO酰化分析，以确定RhoGDI中SUMO乙酰化位点的精确位置2+-NTA珠子可将与His进行SUMOylated的蛋白质拉下来6-如先前研究所述，标记SUMO1(14). 如所示图1B类在Ubc9+SUMO1存在下，GFP-RhoGDI-WT的相对分子质量从56 kDa移动到73 kDa，表明～73 kDa的带可能代表SUMO-GFP-RhoGDI。尽管Ubc9+SUMO1与GFP-RhoGDI K105R突变或GFP-RhonGDI K199R突变的联合转染体中有一条明显的SUMO化的GFP-RhosGDI带，但Ubc9+SUMO1和GFP-RhoGDI K135R突变的共同转染体完全没有GFP-RhoGDI的这种转移(图1B类). 这些结果清楚地表明，赖氨酸138处发生RhoGDI SUMO酸化。

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赖氨酸138处发生RhoGDI SUMO酸化。 A、，人类RhoGDI蛋白的SUMOplot预测。SUMO共识包含序列ΨKX（X）（E/D）（其中Ψ是一个大的疏水氨基酸，K是目标赖氨酸，X（X）并且D或E是酸性残基）。用Abgent SUMOplot程序预测人RhoGDI蛋白的SUMO化位点TM（TM）在Lys-199、Lys-138和Lys-105处的三个赖氨酸残基具有较高的分数，这是假定的SUMO化位点（标记于大胆的和下划线的).B中，人类RhoGDI SUMO相关位点的鉴定。用His-SUMO1和FLAG-Ubc9构建物以及GFP-RhoGDI的WT或突变体（K105R、K138R或K199R）瞬时转染293T细胞。细胞提取物用于镍次氮基三乙酸(氮基三乙酸)Western blotting鉴定沉淀蛋白和下拉蛋白。输入数据显示在降低五个面板。IB公司免疫印迹；Endo公司，内源性。

Lys-138的RhoGDI SUMO化对RhoGDI抑制癌细胞迁移、侵袭和肌动蛋白聚合至关重要

上述结果强烈表明，人类RhoGDI在Lys-138的位置被SUMO化。为了确定SUMO-RhoGDI对RhoGDI调节细胞迁移和侵袭的功能是否至关重要，我们使用含有空载体pEGFP-C3、RhoGDI-WT和RhoGDI-K138R的稳定转染体进行了伤口愈合试验(图2一个). 在伤口愈合试验中，我们发现，与空载体转染体在第2-4天的表达相比，RhoGDI-WT的表达明显抑制了自发伤口闭合，而K138R的突变未能提供RhoGDI-WT转染体中在所有测试时间点观察到的抑制作用(图2B类). 为了排除RhoGDI对细胞迁移的影响是由于抑制细胞增殖所致的可能性，我们比较了三种转染剂的细胞增殖率(图2C类). 结果表明，在前2天，当RhoGDI-WT或RhoGDI-K138R过度表达时，对细胞增殖没有明显抑制作用(图2C类)与转染载体相比，可以观察到RhoGDI-WT过度表达而非K138R突变导致的细胞迁移缺陷(图2B类). 因为在第4天，在RhoGDI-WT转染剂中观察到细胞增殖的部分抑制（～25%）(图2C类)，我们将伤口闭合率归一化为增殖率，我们仍然发现RhoGDI-WT转染剂与载体转染剂相比，细胞迁移明显减弱(图2D类). 此外，我们还观察到RhoGDI-WT或RhoGD1-K105R的表达降低了细胞侵袭，而RhoGDI-K138R的表达则显著增强了细胞侵袭(图2E类，第页< 0.01). 然后我们比较了肌动蛋白聚合和细胞骨架形态变化。如所示图2F类RhoGDI-K138R的表达显著诱导了F-actin的富集和更多的突起和膜皱褶，而RhoGD1-WT或RhoGDI-K105R的表达则显示出与空载体相比，肌动蛋白聚合减少。因此，这些结果提供了直接证据，证明Lys-138的RhoGDI SUMO化对RhoGDI抑制细胞肌动蛋白聚合、迁移和侵袭的作用至关重要。

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Lys-138的RhoGDI SUMO化对RhoGDI抑制癌细胞迁移、侵袭和肌动蛋白聚合至关重要。 A、，通过Western blotting分析鉴定GFP-RhoGDI-WT、GFP-RhosGDI-K138R、GFP-RohoGDI-K105R和HCT116细胞中的空载体的稳定转染体。B中，比较所示HCT116细胞转染体的伤口愈合能力。C类，通过CellTiter-Glo®发光细胞活性测定试剂盒测定所示细胞系中的增殖率。结果表示为三个重复孔的平均值±S.D。这个星号表明与载体转染剂相比，GFP-RhoGDI-WT转染剂的增殖率显著降低(第页< 0.05).D、，使用细胞迁移分析软件对第4天的伤口面积进行量化，并根据第4天增殖率进行标准化，如C类定量数据显示为相对伤口面积（%，误差线代表S.D。，n个= 3). 这个星号表明与载体转染剂相比，GFP-RhoGDI-WT转染剂的伤口面积显著增加(第页< 0.05).E、，使用BD BioCoat对指定转染子的侵袭能力进行比较TM（TM）Matrigel公司TM（TM）入侵室。结果表示为来自至少三个独立实验的侵袭细胞的平均值±S.D.，每个实验具有重复的孔。这个星号表明与HCT116（载体）细胞相比显著减少(第页<0.01），并且(♣) 表明与HCT116（载体）细胞相比显著增加(第页< 0.01).F、，在共焦显微镜下使用所示转染剂评估细胞肌动蛋白聚合，如GFP-RhoGDI、F-actin和DAPI。

XIAP RING结构域抑制Lys-138的RhoGDI SUMO化

为了进一步验证XIAP对SUMO-RhoGDI的抑制作用，我们用His基因转染GFP-RhoGDI6-SUMO1+FLAG-Ubc9构建到WT、XIAP−/−和XIAP−/−（HA-XIAP）HCT116细胞。如所示图3一个在存在SUMO1+Ubc9的WT细胞中，观察到SUMO-GFP-RhoGDI蛋白的73-kDa条带。如预期，XIAP中SUMO-GFP-RhoGDI显著增加−/−与WT细胞相比，HA-XIAP恢复为XIAP−/−单元格，XIAP−/−（HA-XIAP）明显降低SUMO-GFP-RhoGDI的表达，与WT HCT116细胞中的表达水平相似(图3一个). 这些结果表明XIAP确实对SUMO-RhoGDI有抑制作用。我们最近的结果表明，XIAP可以通过其RING域与RhoGDI相互作用(10). 为了测试RING结构域是否负责XIAP在SUMO-RhoGDI中的抑制作用，我们转染了GFP-RhoGDI，His6-SUMO1、FLAG-Ubc9与包含HA-XIAP、HA-XIARΔRING和HA-XIATΔBIR的结构体之一一起进入293T细胞，并评估RhoGDI SUMO化状态。SUMO-GFP-RhoGDI在HA-XIAPΔRING或HA-vector转染体中的表达水平相当，而在HA-X1AP或HA-XIAPPΔBIR转染体上几乎未检测到(图3B类). HA-XIAP、HA-XIACΔRING和HA-XIARΔBIR在其稳定转染体中的过表达鉴定见输入面板属于图3B类使用抗-HA特异性抗体。这些结果强烈表明，RING结构域对XIAP在抑制Lys-138处RhoGDI SUMO化中的作用至关重要。

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XIAP环结构域对XIAP抑制RhoGDI SUMO化至关重要。WT、XIAP−/−和XIAP−/−（HA-XIAP）HCT116细胞(一个)和293T电池(B类)转染GFP-RhoGDI、His-SUMO1和FLAG-Ubc9(一个)以及所示的各种构造(B类). 细胞提取物用于镍-硝基三乙酸(氮基三乙酸)通过Western印迹鉴定沉淀和下拉蛋白。IB公司，免疫印迹。

Lys-138的RhoGDI SUMO化在抑制小Rho GTPase活性中起重要作用

小的Rho-GTP酶以其激活肌动蛋白聚合的能力而闻名，而RhoGDI是Rho-GTP酶激活的关键负调控因子。为了探讨SUMO-RhoGDI对HCT116细胞中Rho-GTPase活性是否有影响，我们使用Rho/Rac/Cdc42活化分析组合试剂盒监测小Rho-GTP酶的活化。如所示图4一个，与空载体中的相比，RhoGDI-WT的表达减弱了小的Rho-GTPase激活（Cdc42除外），而RhoGDI-K138R的表达增加了RhoA、Cdc42和Rac1的激活。定量数据显示在Western印迹带下(图4一个). 这些结果表明，Lys-138的RhoGDI-SUMO化促进了RhoGDI作为抑制小GTPase激活的抑制剂的功能。

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XIAP RING结构域在抑制Rho GTPase活性中起着重要作用。 A–C，稳定转染GFP-RhoGDI-K138R或GFP-RhosGDI-WT或空载体的HCT116细胞裂解物(一个)或来自WT、XIAP−/−和XIAP−/−（HA-XIAP）(B类)，或来自XIAP−/−（HA-Δ环）和XIAP−/−（HA-ΔBIRs）HCT116细胞(C类)按照制造商的说明用于小GTPase活性测定。GTPγS和GDP分别用于阳性和阴性对照。活性（RBD/PBD-结合）蛋白质的密度分析被确定为与GTPγS-结合形式蛋白质的相对比率。显示的结果代表了三个独立实验。D类和E、，XIAP公司−/−用Rac1表达载体转染细胞，然后感染SUMO1过表达病毒（Ad-SUMO1 Q94P）或对照病毒（Ad-LacZ）。使用抗Rac抗体结合琼脂糖珠进行免疫沉淀。免疫复合物用免疫印迹法检测(D类)进行密度分析，以显示免疫复合物和Input中SUMO-RhoGDI蛋白与未SUMO化RhoGDI的比率(E类).

RING结构域对XIAP抑制小Rho GTPases激活至关重要

为了评估XIAP在调节小GTPase激活中的作用，我们监测了WT和XIAP中Rho GTPase的激活−/−细胞。如所示图4B类XIAP中观察到的活化RhoA、Cdc42和Rac1水平−/−HCT116细胞与WT细胞相比显著减少。XIAP中XIAP表达的恢复−/−单元格，XIAP−/−（HA-XIAP）导致Rho GTPase的小活化重新获得与WT细胞相当的水平(图4B类). 这些结果表明，通过耗尽XIAP而增加的SUMO-RhoGDI水平促进了RhoGDI对GTPase活性的抑制作用，这一致支持了我们的结论，即RhoGDI-SUMO酸化是RhoGDI功能上调的原因。此外，我们还比较了XIAP之间的Rho GTPase活性−/−（HA-ΔBIR）和XIAP−/−（HA-ΔRING）转染剂。结果表明，XIAP的RING结构域在Rho GTPases活性的上调中起着重要作用，尽管杆状病毒IAP重复域不是必需的(图4C类). 为了进一步测试SUMO-RhoGDI是否增加了RhoGDI与Rho-GTPase的结合活性，我们将Rac1转染到XIAP中−/−细胞随后感染Ad-SUMO1 Q94P，这是一种表达双His-S-SUMO1-Q94P/IRES/HA-Ubc9蛋白的病毒，能够增加蛋白质的全局SUMO化(18). 然后，我们使用抗Rac1抗体结合琼脂糖树脂进行联合免疫沉淀分析，并比较免疫复合物中SUMOylated和未修饰RhoGDI的蛋白质水平。如所示图4D类，Rac1可以如预期的那样降低RhoGDI。更重要的是，在免疫复合物中也发现了SUMO-RhoGDI，与输入中的相比，它与未修饰形式的RhoGDI的比率要高得多(图4E类). 这些数据表明，SUMO RhoGDI蛋白对小Rho GTPase的结合亲和力比未修饰的RhoGDI蛋白高得多，这可能是SUMO RhoGDI高活性的原因，尽管它只代表一小部分。需要注意的是，除SUMO-RhoGDI外，RhoGDI上其他形式的蛋白质修饰也可能与Rac1结合，因为当用抗RhoGDI抗体探测时，在Rac1下拉试验中观察到一些移位的蛋白质带(图4D类). 总之，我们的结果有力地证明了RING结构域对XIAP抑制RhoGDI SUMO化的作用至关重要，XIAP通过该作用增加Rho GTPase活性，进而促进肌动蛋白聚合，进而促进癌细胞运动(图5).

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XIAP调节的RhoGDI SUMO酸化信号通路调节细胞运动的模型。SUMO-RhoGDI下调Rho GTPase（RhoA、Rac1和Cdc42）活性。XIAP通过其RING结构域与RhoGDI结合，并抑制Lys-138处的RhoGDI-SUMO化，从而激活GTPases，XIAP通过GTPases促进肌动蛋白聚合，促进细胞迁移、侵袭和转移。

讨论

在这项研究中，我们首次确定了Lys-138处的RhoGDI SUMO化，这正调控了RhoGDI在控制细胞运动中的功能。此外，我们一致表明，XIAP的RING结构域通过直接结合对Lys-138的RhoGDI SUMO化具有抑制作用。总之，我们得出结论，Lys-138的RhoGDI SUMO化是XIAP调节癌细胞迁移和侵袭功能的主要介质。

已经鉴定出数百种SUMO化底物，其中大多数是核蛋白和核周蛋白(9，19). 最近，一些细胞质蛋白也被报道以SUMO化形式存在(20，21). RhoGDI通过控制细胞膜循环来调节Rho GTPases的功能。根据我们的结果，在正常生长条件下，内源性SUMO-RhoGDI的水平低至RhoGDI总蛋白的5%(10)这与大多数SUMO修饰的蛋白质在稳定状态下只占很小比例的概念一致(9). 然而，SUMOylated蛋白的小库产生了强大的生物效应，因为SUMOylation是一种非常快速、可逆和高度动态的修饰，因此会及时影响构象变化或蛋白质之间的相互作用。K138R点突变对RhoGDI SUMO化的损害促进了HCT116细胞的细胞迁移、侵袭和肌动蛋白聚合，以及细胞骨架的形成。此外，与未经SUMO修饰的RhoGDI相比，SUMO-RhoGDI优先与Rho-GTP酶结合，下调Rho-GTPase活性和细胞运动。因此，我们得出结论，SUMO-RhoGDI是RhoGDI的一种活性形式，负责RhoGDI在细胞运动中的调节作用。

Malliri和同事(22)根据这两项研究的结果，发现Rac1（Rho-like GTPase）可以被SUMO E3连接酶PIAS3（活化STAT3的蛋白抑制剂）修饰体内和在体外分析。通过质谱法将人类Rac1的假定SUMO化位点定位到Lys-188、Lys-183和Lys-184或Lys-186。将这些残基替换为精氨酸会导致GTP结合减少、跛足褶曲形成减少以及细胞迁移减少(22). 因此，作者得出结论，尽管SUMOylated Rac1仅占总Rac1的一小部分，但它对维持Rac1活性GTP-结合形式做出了巨大贡献，这是由于与GEF的结合增加或与GTPase激活蛋白的解离，最终促进了Rac1在细胞迁移和侵袭中的功能(22). 在我们的研究和Malliri及其同事的研究中有两个共同的发现(22). 首先，我们都同意，尽管这类修饰在总蛋白库中所占比例相对较小，但氨酰化形式的蛋白质是对其生物功能贡献最大的部分。第二，我们都预计SUMOylation偶联通过结构改变或改变蛋白质相互作用影响蛋白质功能。

此外，根据RING结构域（HA-ΔBIRs）足以恢复XIAP中Rho GTPase活性的观察结果，我们一致表明RING结构段在抑制Lys-138处RhoGDI SUMO化中发挥了重要作用−/−细胞，而环结构域缺失（HA-ΔRING）没有显示这种恢复。这些数据，以及我们之前的发现，RhoGDI通过XIAP RING域与XIAP结合(10)，表明XIAP RING域和Rho GTPases之间存在信号串扰。蛋白质SUMO酸化是一个由SUMO化结合酶和脱SUMO酶平衡的复杂过程(10，17). 去SUMO化酶的丰富性和稳定性导致了这种蛋白质修饰的高度不稳定和短暂性(10，17). 虽然我们的研究报告为SUMO-RhoGDI的XIAP负调控提供了明确的证据，但我们没有直接证据表明XIAP-RhoGDI相互作用是否会导致RhoGDI去SUMO酰化过程的增加或SUMO酰基结合的减少。我们实验室目前正在调查这个问题。

RING结构域通常作为赋予泛素蛋白连接酶（E3）活性的调节剂发挥作用(23). Rajalingam及其同事的发现(24，25)显示XIAP或c-IAP的缺失导致c-RAF和Rac1的稳定以及一组肿瘤细胞系中的细胞迁移。然而，在我们的实验系统中，我们没有观察到HCT116 XIAP中Rac1表达的明显降低−/−细胞。XIAP在调节小GTPase表达方面的差异效应可能是由于各种研究中使用的不同细胞系所致。这一预测得到了同一研究获得的数据的支持(25). Rajalingam及其同事(25)据报道，XIAP缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞仅在早期传代中引起Rac1的显著增加，而在后期传代中，这种现象可能是由于c-IAP1的上调或伴侣机制的激活而无法再现。

据报道，泛素和SUMO的结合更倾向于赖氨酸残基，在某些情况下，它们会相互竞争以修饰相同的赖氨酸残留物(26). 在我们的研究中，我们没有发现WT和HCT116 XIAP之间RhoGDI泛素化有任何明显降低−/−细胞，4表明XIAP可能与RhoGDI泛素上调无关。然而，我们不能排除Lys-138的潜在RhoGDI泛素化。

本文描述了三个重要的新发现。1） RhoGDI可以在赖氨酸138处被氨酰化；XIAP RING结构域减弱Lys-138处的RhoGDI SUMO化。2） SUMO-RhoGDI增加其对小Rho-GTP酶的负调控，最终影响肌动蛋白聚合、癌细胞迁移和侵袭。3） SUMO-RhoGDI优先与Rho GTPase结合并下调GTPase的活性，但非非SUMO化的RhoGDI。总之，我们的研究证明了XIAP RING结构域在调节Rho GTPase激活、肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥作用的一种新的分子机制。

致谢

我们感谢Colin S.Duckett博士和Mark R.Philips博士慷慨赠送质粒，感谢Germanán Rosas-Acosta博士提供SUMO1 Q94P病毒，感谢Bert Vogelstein博士赠送野生型和XIAP病毒−/−HCT116细胞。

*这项工作得到了NCI国家卫生研究院拨款CA112557和NIEHS拨款ES000260、ES010344的全部或部分支持。本研究还得到了国家科学基金资助项目NSFC30928023和NSFC30971516的支持。

4J.Liu、D.Zhang、W.Luo、J.Yu、X.Zhang，J.Chen、X.Wu和C.Huang，未发表的数据。

三使用的缩写如下：

RhoGDI公司
Rho-GDP解离抑制剂
SUMO公司
小泛素样修饰物
XIAP公司
X连锁凋亡蛋白抑制剂
GTPγS
鸟苷5′-3-O（运行）-（硫代）三磷酸盐。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会