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基因开发。2000年12月1日；14(23): 3065–3073.
数字对象标识：10.1101/gad.182100
预防性维修识别码：PMC317098型
PMID：11114894

Bak在紫外线诱导皮肤癌细胞凋亡中的作用及HPV E6蛋白的消除

莎拉·杰克逊,1 凯瑟琳·哈伍德,1 米兰达·托马斯,2 劳伦斯·班克斯,2和阿兰·斯托利1,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

紫外线B（UVB）损伤被认为是皮肤癌发展中最重要的病因。人乳头瘤病毒（HPV）也与该疾病有关，尽管这些病毒的作用机制尚不清楚。我们在这里提供的证据表明，Bak蛋白参与UVB损伤引起的皮肤细胞凋亡的信号传递，皮肤HPV E6蛋白通过促进Bak蛋白在体外和再生上皮中的降解来靶向和消除Bak功能。此外，与表达Bak的HPV阴性癌相比，HPV阳性皮肤癌的Bak水平检测不到。这项研究支持病毒和UVB在诱导HPV相关皮肤癌中的联系，并揭示了病毒感染细胞的生存机制。

关键词：HPV、皮肤癌、凋亡、紫外线、蛋白水解

细胞凋亡或程序性细胞死亡触发了一系列事件，导致细胞的有效清除。在增殖活跃的组织中，如皮肤表皮，经常会发现凋亡样现象，如毛囊退化(Sieberg等人，1995年；Lindner等人，1997年)和终末分化(McCall和Cohen 1991年；Haake和Polakowska 1993；Polakowska等人，1994年). UVB处理后表皮中常见的“晒伤细胞”的形成具有浓缩细胞核的凋亡特征(Young 1987年；Schwarz等人，1995年)，对UVB辐射的反应部分依赖于p53的表达(Ziegler等人，1994年). 这种p53驱动的反应，通常称为细胞校对，消除而不是修复严重受损的细胞，然而也描述了p53诱导的依赖性途径(Allday等人，1995年；Gniadecki等人，1997年).

太阳UVB辐射对人类的主要环境影响之一(Miralles等人，1998年)导致英国每年新增约40000例非黑色素瘤性皮肤癌（NMSC）病例，美国每年新增约1000000例。尤其是阳光的UVB部分（280–320 nm）通过嘧啶二聚体和光产物的形成刺激体细胞突变的诱导(Herzinger等人，1995年). 有人认为，未能修复这种DNA损伤或通过凋亡去除严重受损的细胞可能导致有害突变的复制，最终导致致癌（有关综述，请参阅Griffiths等人，1998年). 其他因素也可能起作用，包括免疫反应、遗传倾向和HPV等病毒的感染（有关综述，请参阅Proby等人，1996年). HPV-相关NMSC发病风险最大的人群是患有罕见遗传性疾病、疣状表皮发育不良（EV）和免疫抑制患者，尤其是肾移植受者（RTR），他们患皮肤鳞状细胞癌（SCC）的风险增加了50-100倍。在EV和免疫功能低下的患者中，疣和SCC包含多种HPV类型，病毒存在于至免疫功能低下患者和至30%的患者来自免疫功能正常的患者(Storey等人，1998年；Harwood等人，2000年以及其中的参考文献）。疣和癌在阳光照射部位的共同定位表明HPV和UVB照射之间可能存在相互作用（有关综述，请参阅Proby等人，1996).

促凋亡效应因子Bak在人表皮角质形成细胞中表达(Mitra等人，1997年；Tomkova等人，1997年)是肛门生殖器HPV E6蛋白的靶点(托马斯和班克斯1998). 在这里，我们证明皮肤HPV E6蛋白导致Bak功能障碍的影响对皮肤癌的发展具有重要的生理意义。

结果

HPV E6消除UVB照射后Bak的积累 蛋白质

为了研究UVB损伤是否可能是皮肤、原代正常人角质形成细胞（皮肤HPV的天然靶标）、表达野生型p53的HT1080细胞和人p53缺失的角质形成细胞（RTS3b，Rapp等人，1997年)在辐照后0、8、16、24、36和43 h用UVB处理并收获。用SDS-PAGE分离等量的蛋白质提取物，并用Bak和p53特异性抗体进行Western blotting分析。结果表明，UVB是每个被测细胞系（包括RTS3b细胞）中Bak的有效诱导剂，表明这种诱导可以独立于p53发生（图。​（图1A）。1A） ●●●●。

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UVB诱导Bak和E6蛋白消除Bak途径。(A类)用UVB（15 mJ/cm2)0～43h收获细胞（24h后只有人原代角质形成细胞存活）。用SDS-PAGE分析等蛋白样品，用单克隆抗体进行Western blotting检测Bak、p53和α-微管蛋白水平。(B类)用UVB（15 mJ/cm）处理HT1080 E6多克隆细胞系2)24小时后收获细胞。蛋白质检测为A类在显影前，将膜暴露在X射线胶片上1分钟。(C)p53的多态形式B类在10%PAG上进行解析，并像以前一样进行检测。(D类)在紫外线处理（15 mJ/cm）后5 min，用60μg/mL环己酰亚胺处理HT1080 E6细胞2). 在环己酰亚胺处理后的指定时间点制备蛋白质提取物，并通过Western blotting测定Bak水平。在显影之前，将膜暴露在X射线胶片上20分钟，以检测低水平的Bak。

然后，我们询问来自HPV类型谱的E6蛋白是否可以消除UVB治疗后Bak蛋白水平的增加。我们选择研究来自不同HPV群的E6蛋白，包括HPV 5（发现于EV皮肤癌中）、HPV 10（发现于良性疣和RTR的SCC中）和HPV 77（发现于SCC和RTR中疣的新类型），并将其活性与肛门生殖器型HPV 18的活性进行比较。紫外线照射表达不同E6蛋白的HT1080细胞(杰克逊与故事2000)与之前一样，HT1080载体控制细胞中的Bak蛋白水平增加，但表达E6蛋白的细胞中没有增加（图。​（图1B）。1B） ●●●●。在HPV18 E6细胞中，p53蛋白在紫外线照射后未能积累，因为其降解被肛门生殖器型HPV有效促进(Scheffner等人，1990年；Werness等人，1990年)从而阻断p21的诱导。相比之下，皮肤E6蛋白不能降解p53的HPV 5、10和77 E6表达细胞，在UVB损伤后p53和p21蛋白水平增加。这表明皮肤E6蛋白的活性与其他粘膜HPV不同，是专门针对Bak而非p53的。此外，对Bcl-2家族的另外两个促凋亡成员Bax和Bik的分析没有被UVB诱导，也没有被E6靶向降解（S.Jackson和A.Storey，未公开）。p53密码子72的常见多态性导致该位置的精氨酸或脯氨酸，精氨酸更容易受到肛门生殖器HPV E6蛋白促进的蛋白水解降解(Storey等人，1998年). 由于HT1080细胞表达两种p53亚型，这两种亚型很容易通过凝胶上的不同流动性进行识别，因此我们测试皮肤E6蛋白是否也能够优先靶向精氨酸形式。p53亚型在低百分比聚丙烯酰胺凝胶上的分辨率表明，两者都不是皮肤HPV E6蛋白降解的靶点（图。​（图11C） ●●●●。

Northern blotting对Bak mRNA的分析表明，在上述所有类型的细胞中，Bak mRNA均呈低水平表达，并且在UVB处理后没有增加（数据未显示），这意味着上述检测到的Bak蛋白的增加是由于蛋白的稳定。为了证实这一点，在UVB照射的HT1080细胞中检测了Bak的半衰期（图。​（图1D）。1D） ●●●●。UVB辐射细胞与环己酰亚胺孵育后的Bak分析表明，Bak半衰期显著延长。与我们之前的观察结果一致，在表达HPV5或HPV18 E6蛋白的细胞中没有发现Bak半衰期的增加。在HPV5 E6表达细胞中，UVB处理后的Bak半衰期降低到未经处理的载体控制细胞中的水平，而HPV18 E6在有或无UVB照射的情况下进一步降低。

E6促进 贝克

为了研究HPV5 E6和HPV18 E6是否促进Bak的蛋白水解降解，将细胞系与蛋白酶体活性的特异性抑制剂乳胱氨酸蛋白酶孵育(Fenteany等人，1994年,1995；Dick等人，1996年；Craiu等人，1997年). 图中的结果​图2A2A表明，尽管UVB损伤后载体控制细胞中的Bak蛋白水平增加，但仅用UVB处理的HPV5和HPV18 E6细胞中未发现Bak蛋白增加。只有在收获前向UVB处理的E6表达细胞中添加乳胱氨酸时，才能检测到与对照细胞相当的Bak水平，这表明，至少在这些细胞中，启动Bak积累需要额外的DNA损伤。通过TUNEL染色测定，E6表达细胞中Bak水平的恢复也伴随着凋亡细胞数量的增加（图。​（图2B）。2B） ●●●●。进一步分析在碘乙酰胺存在下从经乳酰蛋白酶处理的UVB照射细胞中提取的蛋白质，发现存在许多分子量更高的修饰Bak物种（图。​（图2C）。2C） ●●●●。

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紫外线处理后Bak的泛素依赖性蛋白水解降解和诱导凋亡。(A类)Western blot分析HT1080载体控制细胞、5E6细胞和18E6细胞中内源性Bak水平，这些细胞在有（+）和无（-）UVB（15 mJ/cm2)治疗。在24小时细胞收获时间点前2小时添加乳酸菌素。(B类)接种在玻璃盖玻片上的细胞平行培养物经紫外线和乳酸菌素处理，如A类细胞固定在多聚甲醛中，TUNEL检测凋亡细胞（放大倍数200倍）。(C)HT1080细胞暴露于UVB（15 mJ/cm2)并在细胞收获前在有（+L）和无（−L）乳酰蛋白酶的条件下生长2小时，如A类细胞在UVB后24小时在含有碘乙酰胺（10 mM）的RIPA缓冲液中稀释的SDS样品缓冲液中溶解，Western blotting检测泛素化Bak。

Bak是由UVB在正常皮肤中诱发的 辐射

我们将单层细胞培养中的观察结果扩展到UVB处理的正常皮肤标本。皮肤取自腹部活检，随后保存在器官培养中，UVB照射（45和225 mJ/cm2)并进行免疫组织化学处理。我们观察到整个表皮都有强烈的p21染色，这与其在终末分化中的作用一致(Ponten等人，1995年；Missero等人，1996年). UVB损伤后p53和Bak蛋白的诱导并不局限于角质形成细胞分化的特定阶段，而是发生在皮肤的整个表皮层，包括可能存在干细胞的基底细胞隔室（图。​（图3）。三). 在非UVB处理的皮肤中很少检测到自发凋亡的细胞；然而，在UVB照射下，TUNEL染色很容易在整个表皮检测到凋亡细胞，染色集中在浓缩的染色质边缘。

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UVB对正常皮肤的烘焙诱导作用。用45或225 mJ/cm照射皮肤样本2治疗后24小时UVB和速冻用于免疫组织化学分析。使用TUNEL检测凋亡细胞（原始放大倍数，100倍，插入物，400倍）。

HPV抑制再生人Bak积累和凋亡 皮肤

紫外线上调皮肤中Bak的表达，再加上紫外线处理后E6蛋白促进Bak蛋白水解，这一发现表明E6的表达可能在调节皮肤暴露于紫外线下的细胞反应方面具有显著作用。为了进一步探讨这一点，我们使用了一种更符合生理学的器官型细胞培养系统，该系统允许在体外再生分层分化上皮，并可用于模拟病毒感染。将HPV77或HPV18的E6和E7基因转染原代人角质形成细胞。对于HPV基因转染的培养物，除E6外，还需要E7基因以获得最佳上皮再生。然后用紫外线照射重组表皮片，使移植皮肤发生凋亡，24小时后处理。正如预期的那样，未转染HPV基因的对照细胞在紫外线处理后的所有细胞层中均显示出强烈的p53和Bak诱导，通过TUNEL染色评估，在整个表皮中检测到许多凋亡细胞（图。​（图4）。4). 相反，转染HPV77或HPV18的HPV E6和E7基因的角质形成细胞在照射后Bak水平没有增加。与我们在单层培养中的研究结果一致，p53水平在对照组和HPV77转染细胞中均升高，但在转染HPV18基因的细胞中没有升高。然而，尽管HPV77转染细胞中的p53水平增加，但从转染HPV77或HPV18的角质形成细胞再生的上皮细胞层中未检测到凋亡细胞（图。​（图4）。4). 为了进一步了解E6在再生皮肤模型中降解Bak的机制和因果效应，我们使用了不能被蛋白水解降解（ΔC）或信号凋亡（ΔGD）的HA标记的Bak突变体(Chittenden等人，1995年)研究体外再生上皮是否需要Bak降解。用表达ΔC或Bak的质粒转染原代角质形成细胞导致凋亡死亡。与野生型蛋白相比，ΔC突变体的活性没有被HPV18或HPV77 E6的共转染所抑制（图。​（图5A）。5A） ●●●●。只有ΔGD-或ΔGD/E6转染的细胞存活下来，然后将其接种到真皮上。两者都形成了分化的上皮，具有角化的迹象，在组织学上与正常的原代角质形成细胞相当。使用抗HA单克隆抗体在ΔGD转染细胞中容易检测到标记蛋白，紫外线照射后表达没有增加（图。​（图5B）。5B） ●●●●。相比之下，即使经过紫外线处理，E6转染细胞中也未检测到ΔGD蛋白。

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辐射对在器官型培养中生长的HPV18和77 E6/E7转染角质形成细胞的影响。紫外线治疗24小时后（45 mJcm），用免疫组织化学方法检测HPV18和77 E6/E7培养物中内源性p53、p21、Bak和Bcl-xL蛋白水平-2个)并与对照PHK筏培养物进行比较（原始放大倍数，100倍）。

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体外再生表皮需要抑制Bak凋亡活性而不是降解。(A类)将Bak或ΔGD或ΔC突变体单独或与HPVE6/E7一起转染正常角质形成细胞。使用EGFP作为转染的标志物。转染后16小时，监测细胞凋亡的形态学迹象（膜起泡、核浓缩和碎裂）（放大倍数，200倍；插入物，400倍）。(B类)将ΔGD和ΔGD/E6/E7细胞接种到去表皮真皮上，使其重新形成上皮。用45 mJcm照射细胞−2UVB，在治疗后8小时采集并进行免疫组织化学处理。切片用苏木精复染。阳性染色细胞用箭头表示。（放大倍数，200倍）

Bak在非黑色素瘤皮肤中的表达 癌症

不同的E6蛋白清除表皮中的Bak激活了一种机制，通过这种机制，这些不同的病毒类型可能在皮肤癌的发展中发挥作用。为了验证这一想法，我们启动了一项初步研究，以调查HPV阳性皮肤病变是否具有可检测到的Bak蛋白水平。HPV分型后，选择HPV阳性或阴性的SCC活检进行分析。免疫组织化学显示，Bak蛋白在HPV阳性病变中不存在，但与此相反，在所有五次检测的HPV阴性活检中均检测到不同程度的Bak蛋白（表​（表1）。1). HPV阴性肿瘤中的p53阳性染色表明，这可能反映了p53基因突变，因为这些突变经常出现在皮肤病变中(Ziegler等人，1994年；Jonason等人，1996年；Ren等人，1996年). 相反，即使在没有检测到p53的情况下，在所有处理过的活检中，p21蛋白水平都很高。有趣的是，Bcl-x的蛋白质水平L（左）Bak的抗凋亡搭档在所有检测的活检中都可以忽略不计。总之，在5/5 HPV阴性的SCC病变中检测到Bak蛋白，而在显著对比的5/5 HPV-阳性的SCC活检中Bak蛋白的水平可以忽略不计(P（P） = 0.004). 这些结果表明，含有HPV的肿瘤可能具有较高的增殖潜能。增殖标记物Ki67的染色和TUNEL染色显示，尽管HPV阳性和阴性肿瘤的Ki67表达水平相似，但与HPV阳性肿瘤相比，HPV阴性肿瘤含有更多的凋亡细胞。

表1

TUNEL和内源性p53、p21、Bak、Bcl-xL（左）HPV阳性/阴性皮肤中免疫染色检测的Ki67水平 损伤

活检代码
莱辛
HPV类型
第53页
第21页
贝克
Bcl-x公司L（左）
基辅67
隧道
HPV阳性病变
第7页合同专用条款37−+++−−++++
7升合同专用条款10, 23++−−−++/−
7J型鲍文氏/发育不良RTR公司 × 32++−−−+++
第7页角化病77, 与 92–1, 14−−−−+−
第9页合同专用条款粒子群算法 × 1 +/− （焦点）+++−−+++
HPV阴性病变
9E（东经）合同专用条款−+ （焦点）−+/−−++++
9公里合同专用条款−−+++−−++
9小时合同专用条款−−++++−++++
7小时SCC/鲍恩氏−+/−+++/−−+++++
7伏合同专用条款−+++++++++−++++

鳞状细胞癌。HPV阳性和阴性病变之间Bak染色的Fisher精确检测：P（P） = 0.004. 

讨论

我们以前的研究表明，皮肤E6蛋白抑制p53依赖性和p53依赖型凋亡途径(杰克逊与故事2000). 这种整体效应可能通过改变增殖和凋亡之间的平衡来影响病变的发展，而增殖和凋亡是决定肿瘤净生长的关键因素(Arends等人，1994年). 我们证明，正常人角质形成细胞和经UVB处理的HT1080细胞都显著增加了半衰期增加所带来的Bak蛋白水平，这表明Bak在促进UVB损伤皮肤的凋亡中发挥了作用。相反，表达肛门生殖器和皮肤HPV E6蛋白的HT1080细胞系在UVB损伤后Bak水平没有增加。Bak是第一个确定的皮肤E6蛋白靶点。与肛门生殖器HPV共有的降解机制表明，皮肤E6蛋白能够区分p53和Bak作为靶点。这对HPV77至关重要，因为它利用转录活性p53增加病毒基因转录(Purdie等人，1999年). 对人类皮肤中克隆性p53突变细胞斑块的分析表明，它们几乎没有癌前潜能(Jonason等人，1996年；Ren等人，1996年). 我们的结果表明，E6消除Bak蛋白会导致紫外线照射细胞的凋亡减少，这反过来可能会促进肿瘤的形成。这就提出了一个问题，即UVB损伤后E6蛋白废除Bak的机制是什么。我们从使用蛋白酶体抑制剂乳酸菌素的实验中得出结论，E6蛋白促进了Bak的蛋白水解降解。

为了将Bak的UVB诱导置于生理学意义上，我们研究了UVB处理皮肤中的Bak诱导，因为Bak似乎不是由γ辐射诱导的(Burger等人，1998年). UVB在整个表皮层诱导Bak和p53。这些发现以及我们的细胞实验表明，HPV E6蛋白可能具有抑制UVB损伤后Bak诱导的皮肤细胞凋亡的潜力，导致有害突变的积累，从而进一步增加含HPV病变的遗传不稳定性。为了验证这个假设，我们在皮肤器官型模型中表达E6和E7基因。从HPV转染的角质形成细胞再生的表皮的照射表明，细胞不能积累Bak并且没有发生凋亡。这突出了消除紫外线损伤细胞的重要性，以及这些细胞如何在HPV感染的病变组织中持续存在。我们的结果表明，Bak的凋亡功能必须在组织发育中受到严格调控。虽然体外再生表皮需要低水平的Bak，但ΔGD突变不能发出凋亡信号，不会干扰角质形成细胞的末端分化，这一事实表明，获得再生皮肤并不需要Bak降解本身。

HPV对凋亡反应的干扰对NMSC的发展具有重要的临床意义。活检免疫染色显示，大多数HPV阴性SCC的Bak染色呈阳性。相反，所有HPV阳性SCC的Bak蛋白水平可以忽略不计。尽管这项初步试验研究规模较小，需要进一步扩大，但它表明，在HPV阴性肿瘤中检测到Bak可能反映出，仍存在一些内源性生长控制反应措施，以促进这些癌症中的活性细胞死亡。这与人类结肠癌中Bak蛋白的检测与细胞凋亡的发生呈正相关的报道一致(Partik等人，1998年). 在HPV阳性肿瘤中检测不到内源性Bak蛋白，与HPV阴性肿瘤相比，凋亡细胞数量显著减少，增殖标记物持续表达，表明在含有HPV的病变中，凋亡和增殖之间的平衡发生了改变。HPV相关NMSC主要发生在暴露于阳光下的身体部位，这一事实表明，正是E6消除紫外线诱导的细胞凋亡，而不是自发的细胞凋亡在含HPV病变的肿瘤形成和进展中起着重要作用。

总之，我们已经表明，Bak在一种途径中发挥作用，该途径可清除因UVB损伤而导致的表皮癌前细胞。证据表明，HPV阳性的NMSC病变具有检测不到的Bak蛋白水平，结果表明肛门生殖器和皮肤HPV可能具有使用共同抗凋亡机制的能力，提出令人兴奋的可能性，即HPV E6蛋白消除Bak是促进病毒感染细胞存活的常见手段。这可能为干预携带多种HPV类型的皮肤损伤提供一个有用的靶点。

材料和方法

细胞和转染

如前所述，制备表达HPV 5、10、18和77 E6的HT1080多克隆细胞系(杰克逊与故事2000). 编码HA标记Bak、ΔGD和ΔC突变体的质粒（0.5μg）(Chittenden等人，1995年)使用TransFast（Promega）将不同HPV类型的E6和E7基因（3μg）转染到人类表皮角质形成细胞的原代培养物中。人类原代角质形成细胞和p53全角质形成淋巴细胞（RTS3b，Rapp等人，1997年)在DMEM/Ham的F12（3）中生长 : 1） 补充10%的FCS和生长因子。用于免疫组织化学的组织标本冷冻在Cryobed贴片中，并保存在−70°C。使用Transfast（Promega）转染角质形成细胞，根据EGFP质粒共转染产生的荧光判断，转染效率为～90%。器官型培养物基本上是在去表皮真皮上制备的，如下所述Prunerias等人（1983年）简单地说，网状真皮表面由人成纤维细胞重新填充，角质形成细胞接种在真皮乳头表面，形成融合单层。文化随后被传播开来–收获前，液体界面再保持14d。必要时，使用UVP CL-1000紫外线交联剂和F8T5灯泡用UVB照射细胞，在312 nm处产生光谱峰。

抗体

所用的单克隆抗体为Bak（Ab-2，Calbiochem）、p53（D01，ICRF）、p21（Santa Cruz）、Ki67（Dako）、α-Tubulin（Calbiochelm）和抗HA（12CA5，ICRF。Bcl-x兔多克隆抗体来自Calbiochem。

蛋白质印迹分析

在收获前，将细胞与裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.4，250mM NaCl，0.1%Nonidet-P40和1×鸡尾酒蛋白酶抑制剂[Boehringer Mannheim]）在4°C下培养20分钟。上清液通过SDS-PAGE溶解，并按照标准程序转移到PVDF膜上。用特异性抗体探测膜，并根据制造商的说明使用Amersham ECL+Plus试剂盒进行开发。

对于泛素化Bak的Western印迹分析，细胞在RIPA缓冲液中稀释的SDS样品缓冲液中裂解（1 : 3） 如前所述，含有碘乙酰胺（10 mM）(Rodriguez等人，1999年).

半衰期测量

对HT1080 E6细胞进行紫外线照射（15mJ/cm2)在添加60μg/mL环己酰亚胺之前5分钟，将细胞培养至指定的时间段。蛋白质提取物在裂解缓冲液中制备，Bak水平通过Western blotting测定。

免疫组织化学

将活检切片切成5μm的切片，置于APES（3-氨基丙基三乙氧基硅烷/丙酮）涂层的载玻片上，并固定在甲醇/丙酮中（1 : 1） 在室温下保持10分钟。在室温下用1%过氧化氢/PBS处理20分钟，去除内源过氧化物酶。切片在4°C下与一级抗体孵育过夜，二级和三级抗体在ABC PK-6200通用试剂盒（Vector Laboratories）中提供，并按照制造商的说明使用。载玻片在DAB中显影（6 mg DAB-四盐酸盐、10μL 30%过氧化氢、100μL 0.1 M氯化镍、10 mL PBS）。按照制造商的说明（Promega，DeadEnd比色凋亡检测系统）对组织切片进行TUNEL染色，使用5μg/mL蛋白酶K培养5分钟。如前所述，对活检进行HPV分型(Storey等人，1998年).

致谢

我们感谢R.Cerio和A.G.Quinn对组织活检病理学的建议，感谢E.Rugg对本手稿的批判性阅读，以及R.Hay的有益建议。我们感谢T.Chittenden提供编码Bak和Bak突变体的质粒。这项工作得到了生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC）和罗氏产品有限公司（英国韦尔文花园城）向S.J.提供的学生奖学金的部分支持。L.B.感谢意大利协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro）的支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。

脚注

电子邮件ku.tenci.frci@yerots.a; 传真：44-207-882-7171。

文章和出版物位于www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.182100.

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社