免疫学杂志。作者手稿；PMC 2011年6月24日发布。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC3123139型
美国国立卫生研究院：NIHMS300630
补体和凝血系统之间的分子相互通讯
，* ，† ，* ，‡ ，§ ，* ，* ，¶ ，* ，§和*
乌姆·阿马拉
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
迈克尔·弗利尔
†科罗拉多大学医学院丹佛健康医疗中心矫形外科，科罗拉多州丹佛市，邮编80204
丹尼尔·里蒂尔施
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
安德烈亚斯·克劳斯
‡德国汉诺威医学院医学微生物学和医院流行病学系
陈慧（音）
§宾夕法尼亚大学医学院病理学和实验医学系，费城，PA 19104
芭芭拉·阿克
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
乌韦·布吕克纳
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
博·尼尔森
¶瑞典乌普萨拉大学Rudbeck实验室临床免疫学部
弗洛里安·格巴德
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
约翰·兰布里斯
§宾夕法尼亚大学医学院病理学和实验医学系，费城，PA 19104
马库斯·休伯·朗
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
*乌尔姆大学医院手、整形和重建外科创伤科
‡德国汉诺威汉诺威医学院医学微生物学和医院流行病学系
†科罗拉多大学医学院丹佛健康医疗中心矫形外科，科罗拉多州丹佛市，邮编80204
§宾夕法尼亚大学医学院病理学和实验医学系，费城，PA 19104
¶瑞典乌普萨拉大学Rudbeck实验室临床免疫学部
向Markus Huber-Lang博士（德国乌尔姆大学医学院手部、整形和重建外科创伤学系，德国乌尔姆施泰因霍夫斯特拉βe 9，89075 Ulm，Deutsche For-schungsgemeinschaft Emmy Noether Research Group负责人，临床和实验创伤免疫学教授）发送信函和转载请求。ed.mlu-kinilkinu@gnal-rebuh.sukram编辑 摘要
补体系统和凝血系统在危及生命的组织损伤和炎症中具有基本的临床意义。两个级联之间的关联已被提出，但精确的分子机制尚不清楚。目前的研究报告了凝血和纤溶级联的各种因素与中央补体成分C3和C5在体外和体外的多重联系。凝血酶、人类凝血因子（F）XIa、Xa和IXa以及纤溶酶均能有效裂解C3和C5。质谱分析确定裂解产物为C3a和C5a，显示出与天然过敏毒素C3a和C6a相同的分子量。裂解产物还分别对人类肥大细胞和中性粒细胞表现出强烈的化学吸引力。所研究的凝血和纤溶因子对C3裂解的酶活性按以下顺序定义：FXa>纤溶酶>凝血酶>FIXa>FXIa>对照。此外，选择性FXa抑制剂磺达肝素和依诺肝素以浓度依赖的方式显著抑制了FXa诱导的C3裂解。在体外将FXa添加到人血清或血浆激活补体中，以生成C3a、C5a和末端补体复合物为代表，并降低补体溶血血清活性，这定义了确切的血清浓度，导致补体介导的50%致敏羊红细胞溶解。此外，在多发伤患者的血浆中(n个=12），发现了凝血（凝血酶-抗凝血酶复合物）和补体活化产物C5a的早期出现和相关性。目前的数据表明，凝血/纤溶蛋白酶可能作为天然C3和C5转化酶发挥作用，产生生物活性过敏毒素，通过复杂丝氨酸蛋白酶系统的多重直接相互作用连接两个级联。
传统上，补体和凝血系统被描述为单独的级联。作为共同祖先途径的后代，两个蛋白水解级联都由具有共同结构特征的丝氨酸蛋白酶组成，例如丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的高度保守催化位点(1，2). 此外，这两个系统都属于复杂的炎症网络(三)并且在其激活剂和抑制剂的特殊功能方面表现出一些类似的特征。特别是，凝血因子[人类凝血因子（F）]XIIa可以激活补体因子C1r，从而启动补体激活的经典途径。反过来，C1酯酶抑制剂不仅抑制所有三种既定的补体途径（经典、凝集素和替代），还抑制固有的凝血级联反应（激肽释放酶、FXIIa）(4，5). 最近，已经表明凝血酶能够在不存在C3的情况下产生补体激活产物C5a(6). 在另一项研究中，Clark等人(7)提示凝血酶和纤溶酶在肝再生过程中可能有助于非传统补体激活，即使在缺乏C4和抑制因子B的情况下也是如此。凝血酶还可作为蛋白激酶C依赖性调节补体衰变加速因子的生理激动剂，从而提供负反馈回路，有助于在炎症期间预防血栓形成(8). 在全身炎症的情况下，凝血级联的激活伴随着补体系统的深度激活，导致过敏毒素C3a和C5a的生成(9，10). 根据以前的报告，C5a诱导人内皮细胞中的组织因子（TF）活性(11)因此可能参与外源性凝血途径的激活。此外，C5a已被证明通过C5aR刺激中性粒细胞上TF的表达，这与较高的促凝血活性有关(12). 最近的一份报告表明，在体外，凝集素途径中甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2能够通过将凝血酶原裂解为凝血酶来促进纤维蛋白原的转换，这进一步证明了补体成分的促凝作用(13). 1986年，Sims等人(14)结果表明，即使在没有FV的情况下，末端补体复合物（TCC；C5b-9）也能催化凝血酶原裂解为凝血酶，从而特异性地提高血小板凝血酶酶活性。相反，C5a被描述为通过上调人肥大细胞系HMC-1中纤溶酶原激活物抑制剂I的表达而具有纤溶作用(15).
因此，现在越来越清楚的是，这两个级联可能会以比先前预期更大的规模相互作用(16，17). 然而，许多潜在的分子机制仍不清楚。如上所述，凝血/纤溶级联的几个因素和补体系统的成分显示出类似的丝氨酸蛋白酶特性。在当前的研究中，我们假设凝血/纤溶级联的各种丝氨酸蛋白酶组分直接裂解补体蛋白，挑战了两个系统是独立级联的经典教条，并提出了一个复杂丝氨酸蛋白酶网络模型。
材料和方法
试剂
除非另有说明，试剂从Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）购买。纯化的人C3和C5来自奎德尔（加利福尼亚州圣地亚哥）。人凝血因子（F）VII、VIIa、IXa、Xa、Xia和（活化）蛋白C购自Calbiochem（德国达姆施塔特）。rFX、rFXI和rTF是从R&D Systems（德国威斯巴登）收购的。依诺肝素钠和磺达肝素钠是从赛诺菲安万特公司（德国法兰克福）获得的。
C3和C5的体外裂解
体外实验是在37°C下，在不存在或存在各种凝血因子[FXa、rFX、FXIa、rXXI、FIXa、FVIIa、FVIII、TF、蛋白C、活化蛋白C、凝血酶（FIIa）、纤溶酶原和纤溶酶原酶原]的情况下，在Dulbecco的PBS（DPBS）中培养天然C3（100μg/ml）或C5（100µg/ml），以剂量和时间依赖性的方式进行的，然后进行ELISA和Western blot分析。在没有或存在选择性FXa抑制剂（依诺肝素钠和磺达肝素钠）的情况下重复实验。将人血清和血浆在37°C下与FXa（0–100μg/ml）孵育90分钟，并使用Western blot和ELISA分析评估C3a和C5a的产生以及TCC的组装。
C3a和C5a的Western blot分析
样品和对照品在还原条件下通过SDS-PAGE分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上（Schleicher&Schuell，Keene，NH）。用1:1000多克隆兔抗人C3a IgG（Calbiochem）或1:1000兔抗人C5a IgG-（Calbiochem）在4°C下培养这些印迹过夜。清洗后，使用碱性磷酸酶结合山羊抗兔IgG（1:5000；宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove）将膜培养1小时。对于显影，使用碱性磷酸酶底物显色缓冲液（Bio-Rad，Hercules，CA）。
C3a、C5a和TCC（C5b-9）的ELISA分析
为了定量分析C3a、C5a和TCC（C5b-9），根据制造商的说明，使用了商用ELISA试剂盒（德国马尔堡Quidel和DRG Diagnostics）。
趋化性测定
如前所述，进行HMC-1（人类肥大细胞系）和中性粒细胞趋化性分析(18). 简言之，HMC-1细胞用2′，7′-双（2-羧乙基）-5-（和6）-羧基荧光素乙酰氧基甲酯（Molecular Probes，Eugene，OR）进行荧光素标记，并使用5μm多孔过滤器（NeuroP-robe，Gaithersburg，MD）进行趋化性测定。标记HMC-1细胞（5×106细胞/ml）加载到96周装置（NeuroProbe）的上腔中，下腔中不存在或存在浓度增加的凝血/纤溶因子。糖基化的人C3a（100 ng/ml）作为阳性对照。
从健康志愿者的全血中分离出人类中性粒细胞（经德国乌尔姆大学独立伦理委员会批准，编号44/06，所有人书面知情同意）。从肘前静脉抽取全血，注入含有抗凝柠檬酸-葡萄糖的注射器（1:10；Baxter Health Care，Deerfield，IL）。采用Ficoll-Paque梯度离心法（瑞典斯德哥尔摩法玛西亚生物技术公司）分离中性粒细胞，然后采用右旋糖酐沉淀步骤。残余红细胞低渗溶解后，中性粒细胞重新悬浮在HBSS中，荧光素标记为2′，7′-双（2-羧乙基）-5-（和6）-羧基荧光素乙酰氧基甲酯（分子探针），在37°C下保持30分钟。标记的中性粒细胞（5×106细胞/ml）加载到96 well设备（NeuroProbe）的上腔中，并用孔隙度为3μm的聚碳酸酯过滤器（Neuro Probe）分离。在不存在或存在凝血/纤溶因子浓度增加的情况下，将重组人C5a（100 ng/ml，阳性对照）或C5装入下腔。在37°C下培养30分钟后，通过细胞荧光测定法（Cytofluor II，Per-Septive Biosystems，马萨诸塞州弗雷明翰）测定通过聚碳酸酯膜迁移的细胞数量。
MALDI-TOF质谱分析
PNGase F脱糖
PNGase F从新英格兰生物实验室（马萨诸塞州伊普斯威奇）购买。对于聚糖裂解，程序遵循产品指南。蛋白质样品在56°C下用5 mM DTT减少45分钟。然后，将1μl酶PNGase F添加到样品中，并将溶液在37°C下孵育过夜。经过C18 Ziptips（Millipore，Billerica，MA）脱盐和富集后，脱糖蛋白质可用于质谱（MS）分析。
MALDI-TOF MS分析
蛋白质样品通过MALDI-TOF分析。光谱是在MALDI-Micro MX（Waters，Milford，MA）上以线性模式采集的。该仪器配备了一个发射波长为337 nm的N2紫外激光器、一个脉冲离子提取源、一个有效路径长度为2.3 m的静电反射器、一个具有实时峰值显示和快速双微通道板探测器的2 GHz 8位瞬态模数转换器。将所有样品溶液以1:2体积比与基质溶液（10 mg/ml芥子酸溶于4:6乙腈/0.1%三氟乙酸中）混合。然后，将0.8μl每个样品基质混合物点在靶板上，并在中等真空下干燥1分钟。将30个单次激发质谱相加，得到一个复合光谱。使用Waters MassLynx软件（Waters）重新处理所有数据。使用定义的肽混合物（胰岛素、细胞色素c、血红蛋白、肌红蛋白和胰蛋白酶原）对质量秤进行外部校准。
补体溶血血清活性
如前所述，在无FXa和有FXa（100μg/ml）的情况下评估人血清的溶血活性(19，20). 简言之，用溶血素（科罗拉多州丹佛科罗拉多血清公司，CO）对绵羊红细胞（Oxoid，Wesel，德国）进行致敏，并将其暴露于TBS中稀释的血清样品中（pH 7.35，37°C，60分钟）。通过添加冰镇TBS，然后进行离心步骤（700×克，5分钟）。通过分光光度法在541nm处测定上清液的吸收值。补体溶血血清活性（CH50）定义了导致50%致敏羊红细胞补体介导溶解的确切血清浓度。
人类多发伤后早期凝血酶-抗凝血酶复合物和C5a的测定
根据乌尔姆大学独立地方伦理委员会（批准号44/06）的规定，根据共识标准，12名多发伤后患者（10名男性，2名女性，中位年龄：38岁，范围：19-74岁）的中位损伤严重程度评分为48（范围：25-60）。所有患者均获得知情同意。如果患者因镇静或精神状态改变而无法做出决定，则在康复后获得知情同意。在乌尔姆大学医院急诊室入院后1小时内抽血，测定凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）和过敏毒素C5a的浓度（见上文）。采用夹心ELISA法测定血浆TAT水平。在涂有抗人凝血酶的微孔中捕获TAT，并使用HRP偶联的抗人抗凝血酶抗体进行检测（两种抗体均来自印第安纳州南本德酶研究实验室）。使用通过在正常柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖血浆中稀释合并的人血清制备的标准品。使用纯化凝血酶和抗凝血酶产生的TAT复合物校准标准品。数值以毫克每升表示。
统计分析
所有值均表示为平均值±SD。ELISA和趋化性分析的数据集按等级采用Kruskal-Wallis ANOVA进行分析；然后使用多重比较程序（Dunn方法）比较实验组之间平均值的差异。为了进行相关分析，确定了皮尔逊系数。当第页< 0.05.
结果
人凝血酶体外裂解C3
如最近所述，凝血酶能够在没有C3的情况下裂解C5并生成C5a(6). 为了评估凝血酶是否也能将C3裂解为C3a，将人C3（5μg；浓度：100μg/ml）与增加浓度的凝血酶（0–10μg/ml）在37°C下培养90分钟或指定的时间段。虽然所使用的补体浓度确实反映了生理条件，但添加的凝血酶浓度却表现出超生理状态。然而，在某些病理生理条件下，如多组织损伤，激活的凝血因子水平被认为要高得多，特别是在繁殖期和治疗应用时(21). 此外，在目前的体外机械实验和类似研究中(22)使用较高浓度的活化凝血因子来最大化信号。然后用Western blot和ELISA技术分析C3a的生成量。如所示C3a的产生与凝血酶的添加量有关。当C3在没有凝血酶的DPBS中孵育时，没有检测到C3a。使用人C3a的多克隆Abs，在糖基化C3a的预测分子量处发现一条带(). 当使用人类C3a单克隆抗体时，获得了相同的结果（数据未显示）。这些数据通过样本的平行ELISA分析得到了证实(). 为了确定凝血酶介导的裂解的时间依赖性，将5μg/ml凝血酶与100μg/ml C3孵育，作为时间的函数（0-480分钟）。孵育约60分钟后，C3裂解似乎达到一个平台(). HMC-1细胞用于评估凝血酶诱导裂解产物的生物（趋化）活性，其与生成的C3a量呈正相关（数据未显示）。为了比较凝血酶诱导的C3裂解和C5裂解，使用相同的体外条件评估了C5的裂解，这与以前的研究结果一致(6)ELISA检测到大量C5a产生().
凝血酶诱导的C3和C5裂解。将人C3（5μg；浓度100μg/ml）在DPBS中孵育90分钟，不存在或存在浓度增加的人凝血酶。A类使用多克隆抗C3a IgG作为检测抗体，在凝血酶存在下对C3裂解产物进行Western blot分析。确保所有样品的蛋白质负载量相等。描述的斑点代表n个=3个实验。B类、ELISA法检测DPBS中与凝血酶和C3共培养样品中的C3a(n个= 3).C类培养C3（100μg/ml）和凝血酶（5μg/ml。D类，凝血酶存在下C5裂解的Western blot分析*第页与对照组相比<0.05。
人FXa体外裂解C3和C5
FXa是凝血系统内、外途径的结合点，对其裂解C3的能力进行了评估。当人C3和人FXa在37°C下孵育90分钟并进行C3a的Western blot分析时，发现9 kDa处有一条单一带。该条带的强度最初与FXa的添加量相关，在2μg/ml FXa时达到峰值(). 当使用超生理浓度的FXa（20–100μg/ml）时，这些条带出现在分子水平稍低的位置，表明最有可能在C3a的C末端位置进一步裂解。当用于检测C3a的多克隆抗体被重组人C3a预先阻断时，C3a条带明显变弱，证实了西方技术检测C3a时的特异性（数据未显示）。ELISA数据也表明了类似的体外切割模式，其中所使用的Abs在比天然C3a更低的分子量下可能检测不到进一步的C3切割产物(). 反映出这些结果，FXa生成的C3a以浓度依赖的方式诱导HMC-1细胞的趋化性，在2μg/ml FXa时达到峰值，在较高浓度时下降().
FXa介导的C3和C5裂解以及随后的C3a和C5a代。人类C3或C5（5μg；浓度100μg/ml）在37°C下，在没有或存在FXa浓度增加的情况下，在DPBS中培养90分钟。A类，在C3暴露于FXa后对C3a进行Western blot检测。确保所有样品的蛋白质含量相等。印迹是至少三个独立实验的代表。B类，FXa与天然C3共培养后对C3a进行ELISA评估*第页<0.05与对照组(n个= 3).C类，使用HMC-1细胞进行趋化性分析，以确定C3-洗脱产物暴露于FXa后的生物活性(n个= 6). 重组人C3a（100 ng/ml）作为阳性对照。D类，使用抗C5a IgG对C5暴露于FXa后的样品进行Western blot分析。非糖基化的rC5a作为阳性对照。Blot是三个独立实验的代表。E类，ELISA评估中描述的制剂D类. *第页与对照组相比<0.05。F类，使用人类中性粒细胞评估C5+FXa制剂的趋化活性。重组人C5a（100 ng/ml）作为阳性对照。对于每个实验条件，n个= 6.
随后，评估了人FXa体外裂解人C5（5μg；浓度：100μg/ml）的能力。样品在37°C下培养90分钟，然后进行C5a的Western blot和ELISA分析。在~14kDa处出现与抗人C5a IgG反应的C5裂解产物(). 谱带强度取决于添加的FXa浓度。使用单克隆抗C5a IgG确认这些结果（数据未显示）。在缺乏人FXa的情况下，没有高压灭菌的证据。为了进一步明确获得的卵裂产物，用重组人C5a预先阻断了抗C5a检测抗体，这导致预期卵裂产物出现微弱的条带（数据未显示）。使用C5a-ELISA分析确认FXa浓度增加时产生的C5a量(). 最后，对FXa暴露后C5裂解产物进行功能分析。卵裂产物显示了人类血液中性粒细胞趋化性吸引力的明确证据().
FXa诱导的裂解产物C3a和C5a的鉴定
为了在分子水平上鉴定FXa诱导的裂解产物，进行了MALDI-TOF MS分析。C3（100μg/ml）或C5（100微克/毫升）与FXa（10微克/毫克）孵育。FXa生成的C3-裂解产物的分子质量与9090Da天然C3a的预测分子质量完全匹配(). 作为内部对照，用组氨酸标签（MRGSHHHHGS）表达的C3a来自大肠杆菌减去组氨酸标签的质量后，发现相同的分子质量为9090Da（数据未显示）。
FXa诱导C3和C5裂解产物的MS分析。FXa孵育后C3和C5裂解产物的MALDI-TOF MS分析。A类，FXa诱导C3裂解产生的C3a的质量大小。B类，脱糖基重组人C5a的质量大小(上部面板)和C5与FXa孵育产生的C5a(下部面板).
由于C5a的N-连接糖基化，在MS分析之前需要进行C5a的脱糖基化。使用从人类血浆中纯化的C5a（由德克萨斯州泰勒市Complement Tech善意提供）作为标准。脱糖C5a标准品的分子质量(，上部面板)与FXa诱导的裂解产物C5a相同(，底部面板).
人纤溶酶裂解C3和C5
纤溶酶作为纤维蛋白溶解级联反应的中心因子，不仅能切割纤维蛋白，还能切割纤连蛋白、血小板反应蛋白、层粘连蛋白和血管性血友病因子(23). 为了确定纤溶系统是否也与补体级联相互作用，将人纤溶酶与人C3或C5孵育成浓度函数。如使用抗C3a-IgG的Western blot分析检测到的，发现质粒将C3裂解为C3a片段()和定量ELISA测量(). 纤溶酶诱导的C3a生成在20μg/ml纤溶酶时达到峰值，在较高浓度时下降(). 此外，纤溶酶衍生C3a剂量依赖性地诱导HMC-1细胞的趋化活性()表明获得的C3裂解产物具有生物活性。
纤溶酶诱导的C3和C5裂解。人类C3或C5（每种浓度为5μg；浓度为100μg/ml）在不存在或存在增加浓度的纤溶酶的DPBS中培养90分钟（37°C）。A类和D类、暴露于纤溶酶后C3或C5样品的Western blot分析。作为阳性对照，使用50 ng rC3a或rC5a。描述的斑点代表n个=3个独立实验。B类和E类纤溶酶孵育后C3或C5样品的C3a-或C5a-ELISA测量(n个= 3).C类，使用HMC-1细胞与越来越多的纤溶酶孵育后C3制剂的趋化活性分析。重组人C3a（100 ng/ml）作为阳性对照(n个= 6).F类在C5与越来越多的纤溶酶孵育后，样品对分离的人类中性粒细胞起到趋化刺激作用。C5a（100 ng/ml）用作阳性对照。n个=每实验条件6*第页与对照组相比<0.05。
当人纤溶酶与人C5孵育时，通过蛋白质印迹和ELISA评估，发现C5的浓度依赖性切割(). 当纤溶酶浓度高于2μg/ml时，发现纤溶酶诱导的C5a生成量最大。同样，根据中性粒细胞趋化性测定，生成的C5a具有生物活性().
凝血因子C3-和C5-水解活性的表征
为了确定上述凝血和纤溶因子是否表现出不同程度的催化活性，进行酶活性分析。因此，使用浓度增加的C3或C5作为底物，而添加恒定浓度为80 nM的每个因子作为酶。各种凝血因子（TF、FVIIa、FVII、纤溶酶原和活化蛋白C）未能产生C3或C5裂解活性（数据未显示）。相反，FXa和纤溶酶最有效地裂解C3和C5(). 酶活性分析(n个分别为5）显示出以下顺序：FXa>纤溶酶>凝血酶>FIXa>FXIa>C3对照组和纤溶酶>FXa>FIXa=FXIa>凝血酶>C5对照组。
各种凝血因子（FXa、FIXa、FXIa、纤溶酶、凝血酶）的C3和C5蛋白水解活性。A类和B类通过ELISA测量在底物浓度增加的情况下90分钟内产生的C3a和C5a（10、54、108、270、540、810和1080 nM C3或C5），评估各种凝血/纤溶因子（每个为80 nM）的C3-和C5-促蛋白溶解活性。每个蛋白水解活性值代表基于五个独立实验的重复测量的平均值。
Fxa激活血清补体：抗凝剂抑制
为了确定体外获得的结果是否可以转移到更复杂的生物系统中，体外研究了FXa激活血清补体系统的能力。我们还试图确定体外切割过程是否能够在体外组装TCC，这是由CH50评估的。健康志愿者的人血清（50μl）在不存在或存在浓度增加的FXa（0-100μg/ml）的情况下孵育，并通过ELISA分析产生的C3a和C5a。服用FXa后，血清C3a和C5a水平均呈浓度依赖性升高(). 同样，血清与FXa（100μg/ml）孵育后，TCC显著生成（384±24 ng/ml TCC），功能上反映为血清溶血活性轻微但显著降低().
FXa诱导血清补体激活。在37°C条件下，在有或无FXa浓度增加的情况下培养人血清90分钟。C3a血清样本评估(A类)和C5a(B类)使用ELISA分析FXa孵育后的浓度*第页<0.05与对照组(n个= 3).C类在存在或不存在100μg/ml FXa的情况下，在人血清中评估CH50。数据代表了12个独立的实验*第页与对照组相比<0.05。在FXa-选择性抑制剂磺达肝素钠含量增加的情况下，C5a与FXa（40μg/ml）孵育后血清样本的ELISA分析(D类)或依诺肝素钠(E类). *第页与对照组相比<0.05；n个= 6.F类，多发伤后早期（<1h）患者血浆中生成的TAT复合物与补体活化产物C5a的相关性分析。
使用磺达肝素和依诺肝素这两种FXa选择性抑制剂，进一步评估血清中FXa依赖性过敏毒素生成的特异性。在不断增加的磺达肝素浓度的共同作用下，血清与FXa孵育可显著抑制C5a的产生(). 当使用不同的FXa蛋白酶活性抑制剂依诺肝素时，也发现了类似的结果(). 用人血浆代替人血清的其他实验表明，在FXa存在的情况下，C3a和C5a的生成模式相似（数据未显示）。总之，这些数据表明FXa对C3和C5的功能性离体切割。
为了首次将报告的体外研究结果转移到相关的临床环境中，对12名多发伤患者创伤后1小时内的血浆进行凝血和补体系统激活分析（有关患者的详细人口统计数据，请参阅参考文献。24). 根据之前对多个受伤患者的研究(25)发现凝血系统非常早期激活（和功能障碍），TAT复合物显著形成。随后的分析确定了TAT复合物中的这些变化是否与补体激活有关。创伤后早期（伤后1小时内），TAT复合物的生成与血浆中过敏毒素C5a浓度呈正相关（相关系数对= 0.697;第页= 0.012;n个= 12;). 目前的体外和体内结果以一个简化的方案进行了总结().
丝氨酸蛋白酶系统的简化模型。描述凝血/纤溶级联反应与补体系统之间的复杂相互作用。补体、凝血和纤溶系统的丝氨酸蛋白酶均以黄色突出显示。黑色虚线箭头条显示了这些系统以前已知的相互作用。红色箭头通过凝血/纤溶因子识别补体激活的新途径，从而产生C3a和C5a。aPC，活化蛋白C；MAC，膜攻击复合物；MBL，甘露聚糖结合凝集素；PK，前激肽释放酶。
讨论
在目前的研究中，我们研究了凝血/纤溶级联反应与体内外补体系统之间的相互作用。C3暴露于凝血酶导致体外C3a的生成与时间和浓度相关。C5也被凝血酶裂解产生C5a。在平行实验中，用FXa或纤溶酶培养C3和C5可产生C3a和C5a。由此产生的裂解产物表现出完整的趋化活性，经MS评估，与天然C3a或C5a没有区别。用FXa孵育血清或血浆导致C3a和C5a的浓度依赖性生成，并降低溶血血清活性。
严重组织损伤似乎同时触发凝血/纤溶级联和补体系统(26，27)，急性创伤(28)或全身炎症期间(9). 病理生理学上，凝血级联反应激活后损伤部位凝血酶的形成不仅可以提供抵抗入侵微生物的物理屏障(29)同时也触发补体系统。局部产生的过敏毒素有助于激活细胞免疫反应(30). 因此，天然丝氨酸蛋白酶系统及其三个主要柱，即凝血、纤溶和补体，可能对有效防止出血和入侵病原体至关重要。然而，当损伤负荷过大时，补体和凝血/纤溶系统可能会发生不受控制的同时激活。特别是，已知过多的C5a在全身感染期间会产生不良影响(31，32). 因此，人们很容易推测各种凝血因子是否可能在局部和全身促成C3a和C5a的生成，而C3a和C3a又反过来作为吞噬细胞的化学引诱剂到达炎症部位，这些细胞在炎症部位释放组织损伤蛋白酶、活性氧物种、，和细胞因子/趋化因子(15，18，33，34). C5a/C5aR信号在纤溶系统中也有重要作用(35). 最后，许多促炎细胞因子可导致多种抗凝蛋白水平降低，包括血栓调节蛋白、内皮细胞蛋白C受体和蛋白S(36)，导致炎症、促凝状态。甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2是一种具有补体激活凝集素途径特征的蛋白酶，可通过将凝血酶原裂解为活性凝血酶来触发凝血(13). 当抗凝机制被抑制时，补体的促凝血活性增加；例如，C4b结合蛋白和蛋白S之间形成复合物导致蛋白S作为抗凝蛋白C途径的辅因子的可用性降低(37). 此外，凝血酶原复合物激活羧肽酶B，进而阻断C5a以抵消血管损伤部位产生的炎症介质(38). 补体系统对凝血系统有着深刻的影响，一些先天性调节因子（如C1-抑制剂或凝血酶激活的纤溶抑制剂）也有相反的影响。后者是一种有效且具有广泛活性的羧肽酶(39)由血栓调节蛋白-凝血酶复合物生成，并以抗凝方式反应(40). 它不仅能减缓纤溶，还具有一些抗炎作用，因为它能够通过去除这些成分中的羧基末端精氨酸残基来灭活C3a和C5a(41). 因此，我们现在开始了解到，凝血/纤溶系统和补体级联相互之间广泛地相互串扰，并相互微调其激活状态，而不是作为独立的级联作用(16，17).
此前，C3的存在被认为是C5-转化酶组装生成C5a所必需的。令人惊讶的是，最近在活化的C3缺乏血清中发现了C5a的存在，其中凝血酶（活化凝血系统的主要成分）水平的提高导致C5转化为C5a(6). 在目前的研究中，我们发现在补体充足的人血清中凝血酶介导的C3裂解为C3a的证据具有剂量和时间依赖性。根据这些发现，Kalowski等人(42)1975年有报道称，注射到兔子体内的凝血酶和凝血活酶以某种方式导致补体的激活，而补体似乎部分依赖于血小板。与凝血酶类似，激肽释放酶和纤溶酶被描述为直接裂解C3(43，44).
丝氨酸蛋白酶的特征是在这些蛋白酶的活性中心有丝氨酸残基(45)参与肽键水解的催化机制(46). 在生理条件下，补体C3和C5被C3转化酶和C5转化酶在C3和C4α链中77和75位的单个精氨酸-氨基酸肽键上裂解，分别释放C3a和C5a(47，48). 同样，凝血因子FXa、FXIa、FIXa、纤溶酶和凝血酶是已知的有效丝氨酸蛋白酶(49)对其天然底物的精氨酸-X肽键具有特异亲和力(50)这导致了我们提出了上述假设。在目前的研究中，我们的假设得到了凝血酶、FXa-FXIa-、FIXa-和纤溶酶介导的C3和C5裂解产物的鉴定的支持。通过蛋白水解活性分析，进一步比较了这些丝氨酸蛋白酶对C3和C5裂解的蛋白水解效果，确定凝血因子FXa是最有效的因子。有趣的是，在较低浓度（分别为2μg/ml和20μg/ml）下，通过FXa或纤溶酶实现的C3最大裂解比C5裂解峰值（20–100μg/ml。事实上，当丝氨酸蛋白酶浓度较高时，FXa和纤溶酶介导的C3裂解急剧下降。在这种情况下，很容易推测C3a的C末端发生进一步的裂解，因为ELISA系统的C3a/C3a-des-arg新表位Ab未能检测到裂解产物。这一点得到了化学疗法活性的显著丧失的支持，已知这种化学疗法活性特别依赖于C3a的C末端部分。因此，当凝血/纤溶系统的成分仅被适度触发时，补体级联的激活可能主要通过C3的裂解实现，而当凝血/纤维蛋白溶解被大量激活时，C5可能是裂解的主要靶点。
切割纯化补体蛋白所需的凝血因子浓度似乎是超生理的，这可能表明补体和凝血之间的这种相互作用与体内情况无关。然而，本研究中的数据并不支持这一结论。许多研究表明，辅因子和生物表面对血浆酶的活性具有重要影响(51，52). 与FXa和凝血酶原相比，凝血酶酶复合物（由FXa、FVa和带负电荷的表面组成）增加FXa活性，将凝血酶蛋白裂解为凝血酶300000倍。此外，对于凝血系统过度激活时（例如，在出血性休克和严重组织创伤后弥散性凝血病期间）局部和全身产生的活化凝血/纤溶因子的病理生理浓度知之甚少。在这方面，在血凝块中发现了C3a样片段，表明局部补体激活和沉积(53). 值得注意的是，临床上建立的针对FXa的抗凝血剂依诺肝素和磺达肝素具有高度抑制补体激活的能力。因此，选择性FXa抑制剂和理论上的其他抗凝剂也可能充当免疫调节剂，这是一个鲜为人知的新功能。
据我们所知，目前的研究首次对补体系统和凝血/纤溶级联之间的通讯进行了系统评估，为其复杂的相互作用提供了新的见解。我们研究的局限性包括，我们的发现是否可以外推到人类更复杂的体内环境中，还有待确定。作为对体外研究结果潜在可转移性的初步评估，本研究结果通过使用血清和血浆样本的更精细的体外系统进行评估。基于FXa存在时CH50的显著变化和TCC的生成，激活的凝血系统可能在体外不同分子水平上与补体级联反应密切相互作用，不仅产生过敏毒素，还产生调理素C3b和C5b-9。多个受伤患者的凝血（TAT复合物）和补体激活（C5a）产物的早期同步出现，反映了这一点。然而，由于相关性不是必要的诱因，这些发现必须在标准化的体内实验环境中得到证实。在目前的研究中，组织因子途径的因子未能影响补体系统，而接触激活途径的丝氨酸蛋白酶能够显著激活补体系统。现在越来越清楚的是，凝血级联中内在和外在凝血途径的区别代表了对试管凝血的过时描述，并不能反映体内生理凝血(54). 因此，建立了基于细胞的凝血模型(55)它似乎更好地模拟了体内细胞和血浆成分的复杂相互作用。凝血和纤溶级联反应与各种细胞的复杂相互作用进一步使它们与补体系统的相互作用复杂化。因此，揭示凝血/纤溶、各种细胞和补体系统之间的精确通信将是未来科学的重大挑战。此外，针对一个级联的治疗干预可能会对另一个级联和所涉及的细胞产生到目前为止未预料到的不利不利影响。
总之，据我们所知，我们为激活补体级联的途径提供了第一个证据，这些途径将凝血/纤溶级联与补体系统紧密相连(). 因此，本研究没有将它们视为单独的级联，而是提出了一个通用丝氨酸蛋白酶网络的概念，强调了两个级联之间的广泛串扰。
致谢
这项工作得到了I.European Shock Society Award Grant 2005、Deutsche Forschungsgemeinschaft HU 823/2、部分美国国立卫生研究院拨款GM062134、AI30040和AI068730以及Deutsche For schungsgemeinschaft KFO 200和HU 823/3-1的支持。
我们感谢Sonja Albers提供的出色技术援助。
本文中使用的缩写
| 个人电脑 | 活化蛋白C |
| 50瑞士法郎 | 补体溶血血清活性定义了导致50%致敏羊红细胞补体介导溶解的确切血清浓度 |
| DPBS公司 | Dulbecco的PBS |
| F类 | 人凝血因子 |
| 雨衣 | 膜攻击复合物 |
| MBL公司 | 甘露聚糖结合凝集素 |
| 毫秒 | 质谱法 |
| PK（主键） | 前激肽释放酶 |
| 周转时间 | 凝血酶-抗凝血酶复合物 |
| TCC（变矩器离合器） | 末端补体复合体 |
| TF公司 | 组织因子 |
工具书类
1Krem MM，Di Cera E.酶级联从胚胎发育到凝血的进化。生物化学科学趋势。2002;27:67–74.[公共医学][谷歌学者] 2Esmon CT。炎症反应对凝血的影响。血栓研究。2004;114:321–327.[公共医学][谷歌学者] 三。Rittirsch D，Flierl MA，Ward PA。败血症的有害分子机制。Nat Rev免疫学。2008;8:776–787. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Davis AE，III，Mejia P，Lu F.C1抑制剂的生物活性。分子免疫学。2008;45：4057–4063。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Ghebrehiwet B、Silverberg M、Kaplan AP。Hageman因子片段激活补体经典途径。《实验医学杂志》。1981;153:665–676. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Huber-Lang M、Sarma JV、Zetoune FS、Rittirsch D、Neff TA、McGuire SR、Lambris JD、Warner RL、Flierl MA、Hoesel LM等。在缺乏C3的情况下生成C5a：一种新的补体激活途径。自然医学。2006;12:682–687.[公共医学][谷歌学者] 7Clark A、Weymann A、Hartman E、Turmelle Y、Carroll M、Thurman JM、Holers VM、Hourcade DE、Rudnick DA。小鼠肝脏再生过程中补体因子C3非传统激活的证据。分子免疫学。2008;45:3125–3132. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Lidington EA、Haskard DO、Mason JC。凝血酶通过蛋白酶激活受体1和蛋白激酶C依赖途径诱导衰变加速因子保护血管内皮细胞免受补体介导的损伤。鲜血。2000;96:2784–2792.[公共医学][谷歌学者] 9Levi M，van der Poll T，Büller HR。炎症和凝血之间的双向关系。循环。2004;109:2698–2704.[公共医学][谷歌学者] 10Hecke F，Schmidt U，Kola A，Bautsch W，Klos A，Köhl J.多发性创伤患者的循环补体蛋白与损伤严重程度、脓毒症发展和预后的相关性。关键护理医学。1997;25:2015–2024.[公共医学][谷歌学者] 11Ikeda K、Nagasawa K、Horiuchi T、Tsuru T、Nishizaka H、Niho Y.C5a诱导内皮细胞上的组织因子活性。血栓止血。1997;77:394–398.[公共医学][谷歌学者] 12Ritis K、Doumas M、Mastellos D、Micheli A、Giaglis S、Magotti P、Rafail S、Kartalis G、Sideras P、Lambris JD。中性粒细胞中一种新型C5a受体-组织因子串扰将先天免疫与凝血途径联系起来。免疫学杂志。2006;177:4794–4802.[公共医学][谷歌学者] 13Krarup A、Wallis R、Presanis JS、Gál P、Sim RB。MBL相关丝氨酸蛋白酶2同时激活补体和凝血。《公共科学图书馆·综合》。2007;2：e623。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Wiedmer T、Esmon CT、Sims PJ。补体蛋白C5b-9通过血小板凝血酶原刺激促凝血活性。鲜血。1986;68:875–880.[公共医学][谷歌学者] 15Wojta J、Kaun C、Zorn G、Ghannadan M、Hauswirth AW、Sperr WR、Fritsch G、Printz D、Binder BR、Schatzl G等。C5a刺激人肥大细胞和嗜碱性粒细胞中纤溶酶原激活物抑制剂-1的产生。鲜血。2002;100:517–523.[公共医学][谷歌学者] 17Markiewski MM、Nilsson B、Ekdahl KN、Mollnes TE、Lambris JD。互补与凝聚：陌生人还是犯罪伙伴？趋势免疫。2007;28:184–192.[公共医学][谷歌学者] 18Hartmann K、Henz BM、Krüger-Krasagakes S、Köhl J、Burger R、Guhl S、Haase I、Lippert U、Zuberbier T.C3a和C5a刺激人类肥大细胞的趋化性。鲜血。1997;89:2863–2870.[公共医学][谷歌学者] 19Flierl MA、Perl M、Rittirsch D、Bartl C、Schreiber H、Fleig V、Schlaf G、Liener U、Brueckner UB、Gebhard F、Huber-Lang MS。C5a在实验性钝性胸部创伤后先天免疫反应中的作用。震惊。2008;29:25–31.[公共医学][谷歌学者] 20Flierl MA、Rittirsch D、Nadeau BA、Day DE、Zetoune FS、Sarma JV、Huber Lang MS、Ward PA。败血症期间补体成分C3和C5的功能。美国财务会计准则委员会J。2008;22:3483–3490. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Poon MC、d'Oiron R、Hann I、Négrier C、de Lumley L、Thomas A、Karafoulidou A、Demers C、Street A、Huth-Kühne A等。重组因子VIIa（NovoSeven）在Glanzmann血栓患者中的应用。Semin血液学。2001;38（4，补充12）：21–25。[公共医学][谷歌学者] 22Bono F、Schaeffer P、Hérault JP、Michaux C、Nestor AL、Guillemot JC、Herbert JM。因子Xa通过EPR-1和PAR-2之间的受体级联激活内皮细胞。动脉硬化血栓血管生物学。2000;20：E107–E112。[公共医学][谷歌学者] 23Bonnefoy A，Legrand C.通过纤溶酶、白细胞组织蛋白酶G和弹性蛋白酶对内皮下粘附性糖蛋白（纤维连接蛋白、血小板反应蛋白和血管性血友病因子）的蛋白质降解。血栓研究。2000;98:323–332.[公共医学][谷歌学者] 24Amara U、Kalbitz M、Perl M、Flierl MA、Rittirsch D、Weiss M、Schneider M、Gebhard F、Huber-Lang M。人类多发伤后白细胞补体调节蛋白（CRegs）和C5a受体（CD88）的早期表达变化。震惊。2010;33:568–575.[公共医学][谷歌学者] 25Lampl L、Helm M、Specht A、Bock KH、Hartel W、Seifried E.【凝血参数作为多发性创伤的预后因素：临床价值能否作为早期诊断帮助？】Zentralbl Chir.公司。1994;119:683–689.[公共医学][谷歌学者] 26Lasser EC、Slivka J、Lang JH、Kolb WP、Lyon SG、Hamblin AE、Nazareno G.补体和凝血：对比灾难中的病因考虑。AJR Am J伦琴诺。1979;132:171–176.[公共医学][谷歌学者] 27Bazarrgin F，Albrektsson A，Yahyapour N，Braide M。低分子肝素可改善腹膜超滤，阻断补体和凝血。Perit拨号国际。2005;25:394–404.[公共医学][谷歌学者] 28Brohi K，Cohen MJ，Ganter MT，Schultz MJ，Levi M，Mackersie RC，Pittet JF。创伤急性凝血病：低灌注诱导全身抗凝和高纤溶。创伤杂志。2008;64:1211–1217.讨论1217。[公共医学][谷歌学者] 29Sun H.病原体与宿主凝血系统之间的相互作用。生理学（贝塞斯达）2006;21:281–288.[公共医学][谷歌学者] 30Peng Q，Li K，Anderson K，Farrar CA，Lu B，Smith RA，Sacks SH，Zhou W.补体的局部产生和激活通过C3a-C3aR相互作用上调树突状细胞的同种异体刺激功能。鲜血。2008;111:2452–2461.[公共医学][谷歌学者] 31PA病房。脓毒症中C5a的黑暗面。Nat Rev免疫学。2004;4:133–142.[公共医学][谷歌学者] 32Laudes IJ、Chu JC、Sikranth S、Huber-Lang M、Guo RF、Riedemann N、Sarma JV、Schmaier AH、Ward PA。抗-c5a改善脓毒症大鼠模型中凝血/纤溶蛋白的变化。《美国病理学杂志》。2002;160:1867–1875. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Huber-Lang M、Younkin EM、Sarma JV、Riedemann N、McGuire SR、Lu KT、Kunkel R、Younger JG、Zetoune FS、Ward PA。吞噬细胞产生C5a。《美国病理学杂志》。2002;161:1849–1859. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Czermak BJ、Sarma V、Bless NM、Schmal H、Friedl HP、Ward PA。体外和体内趋化因子生成对C5a和TNF-α的依赖性。免疫学杂志。1999;162:2321–2325.[公共医学][谷歌学者] 35Shushakova N、Tkachuk N、Dangers M、Tkachuk S、Park JK、Zwirner J、Hashimoto K、Haller H、Dumler I.尿激酶诱导的gp130/Tyk2/Stat3通路激活通过表达过敏毒素C5a受体介导人类系膜细胞的促炎效应。[公布的勘误表出现在2007年。《细胞科学杂志》120:2137.]细胞科学杂志。2005;118:2743–2753.[公共医学][谷歌学者] 36堪萨斯州基尔戈尔Shebuski RJ。炎症介质在血栓形成中的作用。药理学实验与治疗杂志。2002;300:729–735.[公共医学][谷歌学者] 37Rezende SM、Simmonds RE、Lane DA。凝血、炎症和凋亡：蛋白质S和蛋白质S-C4b结合蛋白复合物的不同作用。鲜血。2004;103:1192–1201.[公共医学][谷歌学者] 38Nishimura T、Myles T、Piliponsky AM、Piliposky AM和Kao PN、Berry GJ和Leung LL。凝血酶激活的羧肽原酶B调节体内激活的补体C5a。[公布的勘误表出现在2007年。血液109:3632。]鲜血。2007;109:1992–1997. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Bajzar L.凝血酶激活的纤溶抑制剂和抗纤溶途径。动脉硬化血栓血管生物学。2000;20:2511–2518.[公共医学][谷歌学者] 40Esmon CT。炎症和凝血之间的相互作用。英国血液学杂志。2005;131:417–430.[公共医学][谷歌学者] 41Myles T、Nishimura T、Yun TH、Nagashima M、Morser J、Patterson AJ、Pearl RG、Leung LL。凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂，一种潜在的血管炎症调节因子。生物化学杂志。2003;278:51059–51067.[公共医学][谷歌学者] 42Kalowski S、Howes EL，Jr、Margaretten W、McKay DG。血管内凝血对补体系统激活的影响：血小板的作用。《美国病理学杂志》。1975;78:525–536. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Thoman ML、Meuth JL、Morgan EL、Weigle WO、Hugli TE。C3d-K是iC3b的激肽释放酶裂解片段，是一种有效的细胞增殖抑制剂。免疫学杂志。1984;133:2629–2633.[公共医学][谷歌学者] 44Goldberger G、Thomas ML、Tack BF、Williams J、Colten HR、Abraham GN。豚鼠前C3（第三补体成分的前体）的NH2末端结构和裂解。生物化学杂志。1981;256:12617–12619.[公共医学][谷歌学者] 45Yousef GM、Kopolovic AD、Elliott MB、Diamandis EP。丝氨酸蛋白酶的基因组概述。生物化学与生物物理研究委员会。2003;305:28–36.[公共医学][谷歌学者] 46Polgár L.丝氨酸肽酶的催化三联体。细胞分子生命科学。2005;62:2161–2172.[公共医学][谷歌学者] 47Sandoval A，Ai R，Ostresh JM，Ogata RT。经典途径转化酶的远程识别位点位于补体成分C5的C345C/netrin模块中。免疫学杂志。2000;165:1066–1073.[公共医学][谷歌学者] 48Sahu A，Lambris博士。补体蛋白C3的结构和生物学，天然免疫和获得性免疫之间的联系。免疫学评论。2001;180:35–48.[公共医学][谷歌学者] 49Hayashi K、Takehisa T、Hamato N、Takano R、Hara S、Miyata T、Kato H。南瓜族蛋白酶抑制剂对凝血系统丝氨酸蛋白酶的抑制作用。生物化学杂志。1994;116:1013–1018.[公共医学][谷歌学者] 50Jackson CM，Nemerson Y.凝血。生物化学年度收益。1980;49:765–811.[公共医学][谷歌学者] 51Mann KG、Krishnaswamy S、Lawson JH。表面依赖性止血。赛明血液。1992;29:213–226.[公共医学][谷歌学者] 52Komiyama Y、Pedersen AH、Kisiel W.重组人因子VIIa对人因子IX和X的蛋白水解激活：钙、磷脂和组织因子的影响。生物化学。1990;29:9418–9425.[公共医学][谷歌学者] 53Sundsmo JS，Fair DS。补体、激肽、凝血和纤溶系统之间的关系。斯普林格塞姆免疫病理学。1983;6:231–258.[公共医学][谷歌学者] 54Rossaint R、Cerny V、Coats TJ、Duranteau J、Fernández-Mondéjar E、Gordini G、Stahel PF、Hunt BJ、Neugebauer E、Spahn DR。创伤晚期出血护理的关键问题。震惊。2006;26:322–331.[公共医学][谷歌学者] 55Hoffman M，Monroe DM，III A基于细胞的止血模型。血栓止血。2001;85:958–965.[公共医学][谷歌学者] 
