对Cap-Trapper选择的cDNA进行归一化和减法以制备全长cDNA文库以快速发现新基因

技术的发展

我们将杂交纳入42°C的甲酰胺中，因为温和的温度显然不会导致cDNA在长时间培养后降解（未显示）。我们检查了在这些条件下是否发生了相关的非特异性杂交，以避免删除相关但不同的序列。我们使用的两个克隆在1554个核苷酸中具有76.8%的同源性，并且同源性也很长，为～85%。这些克隆是小鼠全长微管蛋白Mβ5和一个未知的小鼠cDNA，与中国仓鼠β-微管蛋白mRNA（克隆B3T）相似93%。0.25的杂交米NaCl可以很好地去除特异性杂交克隆，而无需在两个克隆之间进行杂交。

我们的一个主要要求是，我们的方法必须删除大部分RNA驱动程序，这也是删除测试驱动程序混合的必要条件。因此，我们测试了RNA生物素化系统是否能够高效地用生物素标记RNA。最初最有效地去除驱动因子的方法是补骨脂素-生物素化，它可以通过使用链霉亲和素珠去除大多数生物素化的驱动因子。我们通过在卷轴cDNA的3′端杂交5-Kb测试器cDNA来验证我们选择的方法的实用性(Hirotsune等人，1995年)RoT的RNA驱动程序 = 0.2（有关RoT的详细说明，请参见安德森和杨1985). 该方法通过计算cDNA的放射性和可视化电泳涂片的强度来测量，去除了约98%–99%的起始cDNA。由于它的性能与补骨脂素-生物素系统一样好，但更容易使用，我们改用Mirus生物素化试剂盒（Panvera）进行后续的文库制备。为了减去杂交探针，磁性多孔玻璃（MPG）链霉亲和素珠（CPG）在我们手中的工作效果比其他系统更好，例如链霉亲和物苯酚技术；链霉亲和素珠去除率接近或大于99%的测试驱动混合（未显示）。

降低高表达频率 cDNA

在初步实验之后，我们准备了几个归一化和归一化/减法库（表​（表1）。1). 最近生成的cDNA文库被归一化，并使用从重新绘制的非冗余RIKEN cDNA百科全书中衍生的迷你文库和RNA驱动程序进行减法，以减少已经表示的克隆的重复测序浪费。

我们将标准胰腺cDNA文库中的第二链cDNA与其标准化/减法对应物进行了比较（图。​（图2）。2). 在RoT进行归一化 = 10，减法是通过使用一组迷你库完成的，每个迷你库包含1000–2000个冗余的，主要是来自肝脏、肺、大脑或胎盘的丰富克隆。我们通过克隆先前制备的标准化cDNA文库的高表达部分来生成迷你文库。然后使用扩增的cDNA微库来准备减法驱动程序（参见方法）。减法驱动器的RoT等于每200个克隆1 U（例如RoT = 使用1000个克隆时为5）。归一化减去cDNA的平均大小比非归一化未减去cDNA长，这表明在减去步骤中不会发生降解，长cDNA的表达比短cDNA的少。我们经常在其他cDNA中观察到类似的结果。此外，与高表达cDNA相对应的cDNA在标准化亚克隆文库中不存在；电泳图谱显示cDNA标准化（图。​（图2）。2). 使用全长cDNA进一步有助于更好地可视化特定cDNA的去除。我们没有对标准胰腺cDNA文库进行进一步测序，因为极少数cDNA物种具有超强的繁殖能力。图中显示了证明归一化/减法优点的另一种方法​图3。三我们使用来自肺部的第一链cDNA作为模板，将一份等分样本进行归一化或归一化/减法，并克隆另一份未归一化的等分样本。标准化cDNA文库和标准对应物的斑块杂交表明，标准化文库中高表达基因的频率降低。当我们筛选10000个标准化肺文库斑块时，延伸因子1-α的代表性从对照文库的90个斑块减少到标准化文库的10个斑块，羰基还原酶从大约70个减少到3个，子宫珠蛋白从大约510个减少到2个斑块。这些结果强烈表明，归一化文库中高表达cDNA的频率远低于对照。

在单独的窗口中打开

图2

可视化去除高度丰富的全长cDNA。左侧，用对照胰腺cDNA制备第二链cDNA；正确的，在归一化/减法后，用相同胰腺cDNA的等分样品制备cDNA。高度丰富的cDNA用箭头表示，并在标准化/减去的cDNA中去除。

在单独的窗口中打开

图3

含有对照肺cDNA文库（左）或标准化肺cDNA库（右）的复制品的菌斑杂交。在右侧面板（标准化）中，一个箭头指示我们计数的斑块。

提高发现稀有物种的频率 基因

为了验证稀有cDNA的富集情况，对文库进行大规模测序是最具指示性的测试，因为我们预计序列冗余会减少，新基因的发现会增加。我们准备了几个库（表​（表1）1)并通过检查滴度、cDNA插入物的平均大小、全长cDNA的存在、冗余度（通过对插入物的3′末端进行测序）和新基因/EST的恢复来对其进行评估。评估序列冗余度是我们对归一化/减法过程效率的最终评估。从等分起始cDNA制备的标准库（序列22-、23-、26-和31-）显示用于比较（表​（表11)。

根据Lib.32，我们开发了一种新的克隆载体，它可以包含长cDNA插入，从而提高长cDNA的克隆效率，并通过使用cre-lox公司系统（P.Carninci，预备）。纳入该克隆系统的标准化/减法文库比以前制备的文库更深，其中主要克隆了短cDNA。在使用我们的新克隆系统成功的标准化提取cDNA文库（例如来自睾丸组织的Lib.49）中，对8900个克隆进行测序后，来自3′端的序列冗余度低至1.63（通过将不同簇的数量除以测序总次数计算）。在复杂组织（例如睾丸、大脑和胸腺）的成功cDNA文库中，预计存在<2.0 in>10000–15000个3′末端序列的冗余。此外，归一化/减法cDNA文库有助于有效和增加未知基因的恢复。例如，22–100、23–100、26–100和31–100库每次测序反应产生的新数据量大约是标准库22–000、23–000、26–000和31–000的两倍或两倍以上（表​（表1，1，no-EST和no-NT列）。

从不同文库中对几个cDNA进行测序表明，与标准cDNA文库相比，标准化子文库中的序列冗余度相对减少（图。​（图4）。4). 在给定的测序过程中，标准化将新基因发现的频率提高到标准库的近两倍。相比之下，使用非冗余、重新排列的驱动程序进行减法可以消除各种组织之间的冗余cDNA，从而提高项目过程中新基因发现的速度。

在单独的窗口中打开

图4

在标准cDNA文库（-000文库）中，序列冗余（或新基因发现的减少）急剧增加，但在标准化/减法全长cDNA文库中（-100文库），冗余增加得慢得多。在给定的cDNA文库中，新基因（%）被称为单体（%）。

迄今为止，通过对929814个克隆进行测序，我们已经能够将128671个3′端序列聚类到不同的组中。由于不断监测每个给定cDNA文库的基因发现率（P.Carnichi，提交），归一化/减法cDNA文库比标准文库更受欢迎。此外，从标准化/减法cDNA文库的829017次测序运行中收集到60941个单克隆（仅出现一次的克隆簇）。目前，我们重新设计了大约30000个cDNA克隆，用于为小鼠cDNA百科全书项目的新cDNA库准备RNA驱动程序(http://genome.rtc.riken.go.jp/). 到目前为止，我们已经在RoTs>200的条件下制备了标准化的减去cDNA文库，与70000个不同的cDNA簇进行比较时，通过3′端读取，根据我们的内部数据库生成了20%-30%的新序列。

全长cDNA比率

最重要的是，经过归一化/减法步骤后，全长cDNA含量达到最大。事实上，在表中​表1，1，我们可以了解各种cDNA文库中全长cDNA的比例。评估按照总结进行（Y.Sugahara等人提交）。然后，我们从标准化的子库中测序了数百个克隆。对命中小鼠“完整mRNA”序列的序列进行比对，并检查是否存在启动子ATG。引发剂ATG的存在是评估5′端质量的因素，而不是我们克隆与已发表的5′序列的准确重叠。事实上，由于启动子/转录起始位点使用和克隆技术的不同，公开的“完整”序列可能与Cap-Trapper序列不同。相反，起始剂ATG的存在可靠地表明给定克隆实际上是全长的。在我们的大多数cDNA库中（表​（表1），1)，80%–100%的克隆包含第一个ATG，在这里介绍的库中平均为88.1%。该平均值接近标准Cap-Trapper cDNA文库，其中报告了约95%的全编码cDNA(Carninci等人，1996年)，尽管之前分析中使用的数据集不同，因为我们包括了小鼠与其他脊椎动物同源基因的比较。用cap开关法获得成功的囊胚cDNA文库(Sasaki等人，1998年)得分相似（94%的克隆包含第一个ATG），但在这个文库中，我们在3995个测序通路中只能聚类937个基因。在另一个项目的数据中(Marra等人，1999年)，在三个非标准化全长寡核苷酸cDNA文库中(Maruyama和Sugano 1994)，约77%的克隆包含第一个ATG（Sugahara等人提交）。当EST候选序列与注释为全长的序列在50 bp内匹配时，将EST候选基因视为5′端全长，这些寡核苷酸库在5′端的全长得分为65%–70%(Marra等人，1999年)，而其余标准库和主要规范化库中的EST(Bonaldo等人，1996年)5′端全长率约为27%(Marra等人，1999年). 不幸的是，寡核苷酸库中的基因多样性减少了：分别为Unigene数据库中聚集的“mewa”、“mkia”和“mlia”库获得了2159/8231、4463/21594和2648/18792个“聚类与分类EST”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Mm.Home.html)2000年7月18日。

关于稀有植物的大小 mRNA

我们反复观察到，在碱性凝胶和质粒大小检查中，减去的正常cDNA似乎比标准库中的插入物长。这一发现可能不是我们的标准化提取方法的伪影，因为我们在测试实验中使用磁珠有效地减去了长cDNA；新基因的发现率证实了这一趋势。此外，标准化提取cDNA文库的插入长度不短于使用相同起始RNA制备的标准文库。这一结果表明，我们的方法保留了减去后cDNA的完整性，并通过后续序列分析进行了验证。这一观察进一步表明，很少表达的mRNA的平均长度比体细胞mRNA的长度长。支持长全长cDNA插入物的生产和克隆的协议似乎提高了全长cDNA文库中新基因的发现率。在全长cDNA文库的生成过程中，特别令人关注的是，在cDNA文库繁殖期间，难以构建克隆短cDNA和长cDNA的载体，其效率和稳定性与长质粒载体相同。尽管存在这些困难，我们预计当至少7000个克隆测序时，一个令人满意的全长、标准化/减法cDNA文库的测序冗余度将小于1.5，而15000个克隆的测序重复度将小于2.0。

cDNA合成

在24μL的总体积中，我们结合了5–10μg mRNA和5μg第一链引物，其中包含巴姆HI和上海I限制位点（5′-（GA）₅AAGGATCAAGAGCTC（T）₁₆VN-3′）和11.2μL 80%甘油。对于肝库、肺库和迷你库，我们使用了包含Xho公司I站点（5′（GA）₈ACTCGAG（T）₁₆VN-3′），其产生反向定向的cDNA文库。RNA-聚合酶混合物在65°C下变性10分钟。同时，我们将最终体积合并为76μL；18.2μl 5×第一链合成缓冲液；9.1μL 0.1 M DTT；6.0μL 10 mM（每个）dTTP、dGTP、dATP和5-甲基-dCTP（代替dCTP）；29.6μL饱和海藻糖（～80%，金属含量低；Fluka生化）；和10.0μL上标II逆转录酶（200 U/μL）。我们放置1.0μl[α-³²P] 第三根管子中的dGTP。将mRNA、甘油和引物与含有上标的溶液混合在冰上，并将等分（20%）快速添加到含有[α-³²P] dGTP。第一链cDNA合成在带加热盖的热循环器中（例如，MJ Research）按照以下程序进行：步骤1，45°C，持续2分钟；第二步，梯度退火：冷却至35°C超过1分钟；第三步，完全退火：35℃，2min；步骤4，50°C持续5分钟；步骤5，56°C，持续60分钟。结合放射性使我们能够估计cDNA的产量(Carninci和Hayashizaki 1999). cDNA经蛋白酶K、苯酚/氯仿和氯仿萃取处理，并以乙酸铵为盐沉淀乙醇(Carninci和Hayashizaki 1999)。

cDNA生物素化

在生物素化之前，RNA帽和3′端的二醇组在最终体积为50μL的条件下被氧化，其中含有再悬浮的第一链cDNA，66 m米醋酸钠（pH 4.5）和5 m米次碘酸钠₄样品在冰上黑暗培养45分钟。然后通过添加0.5μL 10%十二烷基硫酸钠、11μL氯化钠和61μL异丙醇沉淀cDNA。在冰上黑暗培养45分钟或在−20°或−80°C培养30分钟后，以15000 rpm离心10分钟。最后，我们用70%乙醇冲洗cDNA两次，并将其重悬在50μL水中。随后，通过添加5μL，在最终体积为210μL的瓶盖中进行生物素化米醋酸钠（pH 6.1）、5μL 10%十二烷基硫酸钠和150μL 10m米生物素酰肼长臂（载体生物系统）。

在室温（22°–26°C）下培养过夜（10–16小时）后，通过添加75μL 1沉淀cDNA米乙酸钠（pH 6.1），5μL 5米NaCl和750μL无水乙醇，在冰上培养1小时或在−20°至−80°C下培养30分钟。cDNA通过15000 rpm离心10分钟制成颗粒；然后，我们用70%乙醇和80%乙醇清洗一次颗粒。我们将cDNA重新悬浮在70μL 0.1×TE（1 m米Tris[pH 7.5]，0.1 m米EDTA）。

捕获和释放全长 cDNA

我们将500μL MPG链亲和素珠和100μg不含DNA的tRNA混合，并将混合物在冰上孵育30分钟，偶尔混合。通过使用磁性支架将珠分离3分钟，并去除上清液。然后用500μL洗涤/结合溶液（2米氯化钠，50米米乙二胺四乙酸（pH 8.0））。

同时，我们向制造商提供的缓冲液中的cDNA样品中添加每微克起始mRNA 1 U RNase I（Promega）（最终体积200μL）；将样品在37°C下培养15分钟。为了停止反应，我们将样品放在冰上，并添加100μg tRNA和100μL的5米氯化钠。为了捕获全长cDNA，我们将生物素化、RNase I处理的cDNA和洗涤珠结合在一起，洗涤珠再悬浮在400μL洗涤/结合溶液中。混合后，在室温下轻轻旋转试管30分钟。全长cDNA保留在珠子上，而短cDNA没有。用磁力搅拌器将珠子从上清液中分离出来。我们轻轻清洗珠子，以去除非特定吸附的cDNA：用洗涤/结合溶液洗涤两次；一种含有0.4%十二烷基硫酸钠，50μg/mL tRNA；一个10米米三氯化氢（pH 7.5），0.2 m米EDTA，40μg/mL tRNA，10 m米氯化钠和20%甘油；和一个含有50μg/mL tRNA的水溶液。

通过添加50μL 50 m米氢氧化钠，5米米EDTA，在室温下培养10分钟，偶尔混合。然后用磁力去除珠子，将洗脱的cDNA转移到含有50μL 1的试管中米三氯化氢，pH 7.5。用50μL 50 m的等分样品重复一次或两次洗脱循环米氢氧化钠，5米米EDTA，直到我们从珠子中回收了大部分cDNA（80%–90%，通过手持监测器监测放射性来测量）。

为了去除以后可能干扰生物素化RNA驱动程序的微量RNA，我们迅速添加了100μL的1米Tris-HCl，pH 7.0，1μL RNase I（10U/μL）到冰上回收的cDNA；然后将样品在37°C下孵育10分钟。用蛋白酶K、苯酚/氯仿萃取和反萃取处理cDNA。然后，我们添加2–3μg糖原和乙醇，将样品沉淀在硅化管中。或者，可以通过使用Microcon 100（Millipore）在2000 rpm下进行一轮超滤40–60分钟来浓缩样品。如果乙醇沉淀，cDNA可以在20μl 0.1×TE中重新溶解。

cDNA的CL-4B自旋柱分离

我们用CL-4B色谱法处理cDNA样本(Carninci和Hayashizaki 1999)或S-400自旋柱（Amersham-Pharmacia），基本上如制造商所述。

第一流的低聚-dG尾矿 cDNA

我们将cDNA样品、5μL的10×TdT缓冲液（2米二碳酸钾[pH 7.2]，10米米氯化镁₂，10米米2-巯基乙醇），5μL，50μ米dGTP，5μL，10 m米氯化钴₂和40 U末端脱氧核苷酸转移酶，最终体积为50μL。样品在37°C下培养30分钟。最后，用EDTA 20 m停止反应米用蛋白酶K消化cDNA，用苯酚-氯仿萃取，乙醇沉淀。样品最终在TE中重新溶解。我们按照描述检查了尾部长度(Carninci等人，1999年)之后，将cDNA用于第二链合成，以用于检查库（参见下文）或进行归一化/减法。

规范化驱动因素

由一小份起始mRNA组成的mRNA驱动程序被称为“正常化驱动程序”。为了计算正常化驱动的浓度，我们假设第一链合成的掺入率反映实际的mRNA浓度，从而近似计算起始mRNA中的核糖体/结构RNA污染，因此假设底漆和伸长率为100%。假设mRNA转化为第一链cDNA的比例与有效mRNA浓度相对应，我们忽略了小于全长cDNA的原因，通常并非所有mRNA都被激活。稍微超出正常化驱动程序，不太可能像缺少驱动程序那样严重干扰正常化过程。因此，我们假设样品中的mRNA数量与第一链cDNA的产量相同。

减法驱动因素

减法驱动因素包括使用T7和T3 RNA聚合酶从克隆的小型文库中制备的大量径流转录物和从非冗余RIKEN cDNA百科全书中重新绘制的文库。

迷你文库包含从先前的标准化实验中获得的约1000–2000个cDNA克隆。通过采用标准方案，我们从归一化实验的副产品捕获的等分（丰富的cDNA片段）中制备了微型文库。归一化后，用50 m米氢氧化钠/5米米乙二胺四乙酸；中和后制备第二链cDNA。克隆的完成方式与前面描述的类似(Carninci和Hayashizaki 1999). 然后对质粒进行大批量扩增，在琼脂糖/氨苄西林上扩增每个小型文库1000–2000个克隆。对于驾驶员准备，我们在SOB-琼脂糖/氨苄西林上培养20000–50000个菌落，并在37°C下培养培养板过夜。我们在存在再悬浮溶液（Wizard DNA提取试剂盒；Promega）的情况下从平板上刮下细菌细胞，然后遵循制造商的方案。

非冗余cDNA文库的制备 驾驶员

全长cDNA百科全书中的单个克隆(http://genome.rtc.riken.go.jp/)为减法重新拍摄。从384孔板中，将重新绘制的cDNA涂布在SOB-琼脂糖/氨苄西林板上。对微型文库进行质粒提取、DNA切割和RNA制备。

我们使用Pvu公司当迷你库被克隆时Xho公司3′端位点的I或上海当库被克隆到上海我的网站。RNA是通过使用T3或T7 RNA聚合酶（生命技术）合成的，这取决于用于制备驱动程序的结构图，以制备感测径流RNA。我们使用T3聚合酶Pvu公司I-裂解迷你文库（多达14个）和T7聚合酶上海I-cleaved迷你图书馆（15个及以下）。根据制造商的说明，使用RNA聚合酶（生命技术）制备RNA。用1–2μL DNaseI（RQ1，无RNase，Promega）进行广泛消化30分钟。然后进行蛋白酶K消化，然后用苯酚/氯仿和氯仿萃取，并沉淀cDNA。

归一化/减法RNA的生物素标记 驱动程序

为了在标记之前进一步清理RNA驱动程序，我们根据制造商的说明使用了RNeasy试剂盒（QIAGEN）。随后，我们使用了制造商描述的Mirus核酸生物素化试剂盒（Panvera）。例如，将10μg RNA混合物与10μL标签it试剂和10μL标记缓冲液A结合，以100μL的最终体积进行标记。我们在37°C下培养反应1小时，然后通过添加1/20体积的5M NaCl和两个体积的99%乙醇沉淀生物素化RNA。在标准乙醇沉淀后，用80%乙醇清洗一次颗粒，再悬浮在20μL的1×Mirus标记缓冲液A中，并在−80°C下保存直至使用。或者，根据制造商的说明，使用补骨脂素-生物素化试剂盒（Ambion）标记mRNA。

归一化/减法

RNA驱动程序和cDNA使用蛋白酶K脱蛋白，然后进行苯酚/氯仿萃取、氯仿萃取和乙醇沉淀。使用寡核苷酸尾cDNA作为底物，将其与RNA驱动因子和阻断寡核苷酸（生物素-dG₁₆)与减法驱动器中的C-拉伸区杂交，并与寡核苷酸-dT引物杂交以阻断polyA序列。根据实验结果，在含有80%甲酰胺（来自去离子原料）的缓冲液中，以5–500的RoT值进行杂交，缓冲液长度为250 m米氯化钠，25米米HEPES（pH值7.5）和5 m米EDTA公司。在42°C的干燥箱中进行杂交；即使体积小至5μL，也不需要矿物油覆盖层。杂交后，我们通过添加2.5体积的无水乙醇沉淀样品，并在冰上培养30分钟。样品以15000 rpm离心10 min，并用70%乙醇清洗一次；我们小心地将cDNA重新悬浮在10μL冰上的水中。

混合动力的拆卸

同时，我们为每1μg生物素化驱动RNA制备50μl CPG磁珠；5μL珠可以结合>400 ng的生物素化驱动器。对于每50μL的珠子，我们添加10μg tRNA作为阻断剂，然后在室温下培养珠子10–20分钟或在冰上培养30–60分钟，偶尔摇晃。我们用一个磁性支架去除珠子，我们用超过1倍的量清洗了三次米氯化钠，10米米EDTA并将其重悬于体积为1米氯化钠，10米米EDTA相当于胎圈悬浮液的原始体积。

我们将阻塞的珠子与再溶解的测试仪/驱动器混合物混合，并在室温下培养整个样品15分钟，偶尔轻轻混合。使用磁力支架取出珠子3分钟后，我们回收了上清液，其中包含单链标准化/减法cDNA。用过量的结合缓冲液（1）清洗珠子一次米氯化钠，10米米EDTA）以回收任何剩余的ssDNA。我们测量了程序前后标记样品的放射性，以估计归一化/减法的产率。

为了将cDNA溶液浓缩至～50μL，我们使用了制造商（Millipore）描述的Microcon 100超滤。随后，使用标准异丙醇程序造粒cDNA；将颗粒重新悬浮在44μL的0.1中 × TE，其中添加5μL RNase I缓冲液和1 U RNaseⅠ，体积为50μL。然后将样品在37°C下培养20分钟，然后我们添加400μL 0.2%SDS以灭活RNase I。用Microcon 100过滤器在2000 rpm和25°C下超滤去除降解RNA、阻断寡核苷酸、SDS和缓冲液的痕迹，直到体积减至<20μL。样品通过添加400μl 0.1脱盐 × 然后按上述方法离心，共洗三次。我们通过将过滤器倒置在新试管中并以9000 rpm离心1分钟来回收cDNA。

第二链cDNA 合成

对于标准化/减法cDNA、标准对照库和迷你库，第二链合成和克隆步骤相同。这个Xho公司含I底漆5′-（GA）₇TTCTCGAGTTAATTAATATAATTAATC公司₁₃-使用标准技术制备并纯化3′，作为第一链cDNA引物。对于肺部和肝脏图书馆以及迷你图书馆上海含I引物5′-（GA）₉GAGCTCACTAGTTAATTAATTAATC公司₁₁-第二条引物为3′。为了制备第二链反应，我们将寡核苷酸尾cDNA与6μl 100 ng/μl第二链引物适配器、6μl EX-Taq第二链缓冲液（Takara）和6μl 2.5 mM（每个）dNTP混合。然后通过在65°C的热循环器中添加3μl 5 U/μl ExTaq聚合酶（Takara）进行热启动。混合后，退火温度通过负斜坡达到45°CXho公司I底漆和35°C上海I底漆。在退火温度下10分钟后，第二链cDNA在68°C孵育20分钟期间被延长。再次重复退火-延长循环，然后在72°C下最终延长10分钟。在热启动开始时，我们将5μL等分样品与0.5μL[α³²P] dGTP或[α³²P] dCTP将遵循公司注册。我们在反应结束时使用标记的等分样品来可视化cDNA并计算第二链产量(Carninci和Hayashizaki 1999年)。

cDNA克隆

用蛋白酶K处理二级cDNA，用酚-氯仿和氯仿萃取，并按照标准程序沉淀乙醇。然后，我们用25 U/μg的上海我和Xho公司I（肺和肝图书馆和图书馆18–31）或巴姆HI和Xho公司I（图书馆编号32-64）。消化后，用蛋白酶K处理cDNA，用酚氯仿提取，并在CL-4B旋转柱（法玛西亚）上纯化。乙醇沉淀后，我们基本上克隆了cDNA(Carninci和Hayashizaki 1999). 用于克隆cDNA Lib.32-64的载体将在别处介绍（P.Carnichi，预备）。

我们将此作品献给这篇文章的合著者Yuichi Sugahar，他在一次事故中过早死亡。我们感谢克劳迪奥·施耐德的多次讨论和鼓励；Tomoko Hirozane、Toshiyuki Shiraki和Kenjiro Sato的杰出技术贡献；以及基因组科学实验室的所有成员收集数据。本研究得到了日本科技公司（JST）RIKEN基因组探索研究项目、进化科学与技术核心研究（CREST）和ACT-JST（先进计算科学与技术应用研究与开发）的特别协调基金和研究拨款的支持。Y.H.由日本政府科技署资助。这项工作还得到了教育、科学和文化部优先领域科学研究和人类基因组计划赠款的支持，以及卫生和福利部向Y.H.提供的第二期癌症控制十年综合战略赠款的支持。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，根据《美国法典》第18卷第1734节，本篇文章必须标记为“广告”，以表明这一事实。