跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
分子细胞蛋白质组学。2011年2月；10（2）：M10.004796。
2010年11月22日在线发布。 数字对象标识：10.1074/mcp。M10.004796号
预防性维修识别码：下午033685
PMID：21098080

一种新的蛋白质组学方法鉴定人细胞中氨酰化蛋白及其修饰位点*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

弗雷德里克·加里森，一，b条 路易莎·马鲁什，b条，c（c），d日，e（电子） 马修·库塞尔，c（c），d日 埃里克·邦尼尔，c（c） 西尔万·梅洛切，c（c），（f） 穆尼拉·切尔比·阿利克斯，一，克，小时和皮埃尔·蒂鲍特c（c），d日，克，我，j个
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

小泛素相关修饰物（SUMO）是一组可逆地附着在蛋白质底物上以修饰其功能的蛋白质。哺乳动物细胞中蛋白质SUMO化及其修饰位点的大规模鉴定是一项重大挑战，因为相对较少的体内基底和这种修饰的动态性质。我们在这里报道了一种新的蛋白质组学方法，可选择性地从人类细胞中富集和鉴定SUMO结合物。我们在HEK293细胞中稳定表达了不同的SUMO同源序列，每个同源序列都包含一个His6tag和位于C末端的胰蛋白酶裂解位点，以便于通过亲和富集和质谱法回收和鉴定SUMO化肽。短SUMO残基的色氨酸肽在大规模SUMOylome实验中具有显著优势，包括在CID和ETD激活后生成副log特异性片段离子，以及使用传统数据库搜索引擎（如Mascot）识别修饰肽。我们在12个SUMO蛋白偶联物中鉴定了205个独特的蛋白底物和17个精确的SUMO化位点，包括蛋白早幼粒细胞白血病上的三个新位点（Lys-380、Lys-400和Lys-497）。对未经处理和三氧化二砷处理的细胞的纯化核提取物进行无标签定量蛋白质组学分析，结果表明，所有已鉴定的早幼粒细胞白血病的SUMO化位点在刺激后均发生差异SUMO酸化。

小泛素样修饰物（SUMO）1蛋白质在结构上与泛素相似，尽管它们的序列同源性不到20%(1). 与泛素化一样，蛋白质SUMO化受SUMO活化酶（SAE1/SAE2）、-结合酶（Ubc9）和几个SUMO E3连接酶之一的级联反应调控(例如PIAS1、PIAS3、PIASxα、PIASxβ、PIASy、RanBP2和Pc2）共价连接SUMO到特定蛋白质底物(2，三). SUMO蛋白以未成熟的形式表达，包括一个不变的Gly-Gly基序和一个可变长度的C末端延伸（2-11个氨基酸）。通过sentrin-specific proteases（SENPs）去除C-末端延伸以暴露二甘氨酸基序是SUMO与蛋白质靶点结合的必要条件。这些SUMO蛋白酶能够在成熟SUMO形成过程中裂解一个肽键和一个异肽键来解偶联修饰的蛋白质底物(4). 这种共价修饰是由于蛋白质底物中赖氨酸的ε-氨基与SUMO甘氨酸残基的C末端羧基之间形成了异肽键。SUMO结合经常发生在共有基序ψK内的赖氨酸残基上X（X）E（其中ψ是脂肪族残基X（X）是Ubc9识别的任何氨基酸(5，6). 最近的研究也发现了磷酸化依赖基序（ΨKX（X）E类XX年pSP，其中pS是磷丝氨酸）(7)和负电荷氨基酸依赖基序(8)在基本SUMO共识位点附近携带负电荷以增强蛋白质SUMO化。然而，其他一些SUMOylated蛋白，包括增殖细胞核抗原、E2-25K、Daxx（死亡域相关蛋白）和USP25，在非感觉部位被修饰(9–11). 目前尚不清楚这些类型的位点是罕见的例外，还是反映了其他E2结合酶的存在。

在低等真核生物中，单个SUMO基因被表达(Smt3型在里面酿酒酵母)而在脊椎动物中，三种被指定为SUMO1、SUMO2和SUMO3的副log在所有组织中普遍表达。人类基因组还编码了SUMO4的第四个基因，该基因似乎在脾脏、淋巴结和肾脏中唯一表达(12). 然而，它的作用仍然难以捉摸，因为体内成熟为共轭竞争形式仍不清楚(13). 有趣的是，SUMO2和SUMO3具有97%的序列同源性，并且表达水平远高于SUMO1，而SUMO1和SUMO2只有约50%的同源性(1). 虽然SUMO paralogs使用相同的结合机制，并且目标蛋白的子集部分重叠，但它们对压力的反应不同(14)并且可以通过它们形成自改性聚合物的能力来区分体内和在体外(15，16). SUMO1缺乏共识修饰位点，并且没有形成多SUMO1链体内，尽管据报道RanBP2被SUMO1链超修饰在体外(17). 相反，SUMO2和SUMO3可以形成聚合物链体内和在体外通过他们的共识主题(15)，而SUMO1在聚SUMO2或聚SUMO3共轭物上形成终止链(16).

蛋白质SUMO化是从酵母到哺乳动物的一个基本细胞过程，在细胞内运输、细胞周期、DNA修复和复制、细胞信号和应激反应的调节中起着重要作用(2，18，19). 蛋白质SUMO化通过掩蔽和/或赋予蛋白质相互作用的额外支架表面，在底物蛋白质上产生显著的结构和构象变化。目前，已知数百种蛋白质底物被氨酰化体内这些蛋白质靶点包括基因表达调节器(例如转录因子、共激活物和阻遏物）以及癌基因和抑癌基因，如早幼粒细胞白血病（PML）、小鼠双分钟-2（Mdm2）、c-Myb、c-Jun和p53，这些基因的调控不当会导致肿瘤的发生和转移(20). 越来越多的证据表明蛋白质SUMO化和泛素化过程之间存在相互作用(21，22). 早期报道表明，SUMO酸化可以拮抗核因子κB的泛素化(23)而最近的数据也表明SUMO化可能是泛素化和随后蛋白酶体依赖性降解的先决条件。一个恰当的例子是RNF4的鉴定，RNF4是一种E3泛素连接酶，能特异识别PML的多SUMO链并泛素化(24，25). 有趣的是，使用三氧化二砷（As2O（运行）三)，一种用于治疗急性早幼粒细胞白血病的治疗剂(25–28).

相对较低丰度的蛋白质SUMO化对这种修饰的鉴定和定量是一个重大的分析挑战体内最近的报告描述了通过使用半胱氨酸靶向纯化来富集SUMO化蛋白的小亚群，成功鉴定SUMO候选蛋白(29)，一个与他的串联亲和标签6-抗Lys-C蛋白水解的SUMO蛋白(30)和稳定表达His的细胞6-SUMO构造(31)并使用质谱（MS）和细胞培养中的代谢标记来量化其比例(32). 尽管取得了这些重大进展，但由于SUMO C末端多肽的化学计量比可变，且其存在使相应产物离子光谱的解释复杂化，因此通过MS鉴定SUMO化位点仍然具有挑战性。经胰蛋白酶消化后，SUMO化肽包含一条相对较长的SUMO残链（人类SUMO2,3最多32个氨基酸），附加在修饰的Lys侧链上。与其他蛋白质修饰相比，SUMO残基链产生与目标肽重叠的多个片段离子。因此，由于重叠片段离子的复杂分布，专门用于识别线性肽的标准数据库搜索引擎通常无法指定支链肽的正确序列。沃尔施莱格尔（Wohlschlegel）在早期的报告中也描述了这种限制等。(33)谁说酵母Smt3型在C末端的第三个残基处具有精氨酸的突变体产生与泛素残基的胰蛋白酶肽相同的胰蛋白酶肽，并使用数据库引擎SEQUEST促进其鉴定。为了克服这些限制，不同的数据库搜索策略包括自动识别模式工具（SUMmOn）(34)和组合搜索引擎（ChopNSpice）(35)根据这些大前体离子的MS/MS光谱确定潜在的受体位点。

在这里，我们提出了一种新的方法，使用三个单独的HEK293细胞系大规模鉴定修饰肽及其结合位点，每个细胞系稳定表达一个SUMO（1、2或3）突变蛋白，该突变蛋白包含一个His6标记和一个战略性定位的胰蛋白酶裂解位点，可以方便地对不同的SUMO副产物进行亲和富集和MS分析。我们在C末端的第六位引入了一个Arg残基，以最小化内源性蛋白质的结构变化。我们确认了His的活性和功能特性6-SUMO突变体使用在体外SUMO酸化分析和免疫荧光。我们分析了SUMOylated蛋白在HEK293细胞中的亚细胞分布，并监测了As作用下SUMOylation的变化2O（运行）三治疗。稳定表达His的模拟和HEK293细胞NTA富集核细胞提取物的MS分析6-SUMO3突变体能够识别独特的SUMO化蛋白底物及其修饰位点，包括蛋白PML上的三个新位点。他的分离6-含有蛋白质的蛋白质选择性地从内源性对应物中富集突变的SUMOylated蛋白质，尽管它们在原始细胞提取物中的存在不会干扰这些分析。此外，我们测量了砷的影响2O（运行）三使用无标签定量蛋白质组学进行靶向修饰，并观察到核提取物中PML SUMO化的增加，这与以前的报告一致(25，27). 在每个SUMO副序列的C末端插入一个Arg残基，不仅有助于通过观察副序列特异性片段离子来鉴定SUMO化肽，而且减少了具有长修饰Lys侧链的肽的MS/MS光谱中观察到的重叠片段离子的丰度和分布。此外，SUMO化蛋白的胰蛋白酶消化过程中形成的五氨基酸SUMO残基也可用于免疫亲和性富集，如最近报道的泛素化胰蛋白酶肽(36).

实验程序

表达SUMO结构的稳定HEK293细胞的质粒构建及产生

他的cDNA6-SUMO野生型（WT）和His6-用含有His的正向引物（5′-gacccaagcttgtaccatggctcatc-3′）通过PCR产生SUMO突变体6tag、KpnI和NcoI限制位点以及包含终止密码子和XhoI限制位点的反向引物。WT和SUMO突变引物序列如下：SUMO1 WT：正向，5′-gacccaagcttgtaccatggctcatc-3′；反面，5′-ctaccgctcgagtaaccccgttttctcgataaaacttc-3′；SUMO1 mut：正向，5′-gacccaagcttggtaccatggctcatc-3′；背面，5′-ctaccgctcgagtaaccccgttttcccgataaaacttc-3′；SUMO2 WT：正向，5′-gacccaagcttggtaccatggctcatc-3′；反面，5′-ctaccgctcgagtaacctcccgtgctgttggaacacatc-3′；SUMO2 mut：正向，5′-gacccaagcttggtaccatggctcatc-3′；背面，5′-ctaccgctcgagtaacctcccgtgctgtcggaaccatc-3′；SUMO3 WT：正向，5′-gacccaagcttggtaccatggctcatc-3′；反面，5′-ctaccgctcgagtaacctcccgtgctgtgggaacacctc-3′；和SUMO3 mut:forward，5′-gacccaagcttggtaccatggctcatc-3′；背面为5′-ctaccgctcgagtaacctcccgtctggttccggaaccgtc-3′。

不同的他6-通过将SUMO旁系同源物的cDNA分别插入pcDNA3或pET28b的KpnI/XhoI或NcoI/XhoI中来产生SUMO构建体。使用pcDNA3 PMLIII和pcDNA3 PMLIII YFP，如Percheracier等。(37). 通过转染pcDNA3-SUMO构建物和随后的新霉素筛选（0.5 mg/ml）获得稳定表达SUMO的HEK293。如前所述，获得了在Lys-65、Lys-160和Lys-490突变的PMLIII WT和PMLIII 3K构建体(37).

作为2O（运行）三治疗和抗体

作为2O（运行）三（西格玛）在1米NaOH，然后进一步稀释至1μ米在生长培养基中，除非另有规定，细胞通常暴露4h。兔多克隆抗SUMO1和多克隆抗PML抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。兔抗SUMO2，3和鸡抗小鼠Alexa Fluor 594缀合的二级抗体来自Invitrogen。单克隆抗-His6抗体来自Clontech。HRP偶联的单克隆抗β-肌动蛋白来自Sigma。HRP结合山羊二级抗体来自Chemicon International。转录中介因子1-β（TIF-1β）抗体是蒙特勒大学M.Aubry博士赠送的。本研究中使用的其他抗体包括组蛋白H3多克隆抗体（细胞信号技术）、聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）抗体（克隆泰克）和层粘连蛋白A/C多克隆抗体。

磺胺酰化蛋白质的富集

稳定表达His的细胞6-SUMO（107细胞）在变性缓冲液A（6米盐酸胍，0.1米不2人事军官4, 0.01米三氯化氢，pH值8，10 m米β-巯基乙醇），超声处理，在16000×g下离心，并与50μl NTA-agrose珠（Invitrogen）孵育3 h(31). 在缓冲液A中清洗后，在缓冲液B（8）中清洗五次米尿素，0.1米不2人事军官4, 0.01米三氯化氢，pH 6.3，10 m米β-巯基乙醇），用300 m洗脱珠米0.15中的咪唑米三重HCl，pH 6.7，30%甘油，0.72米β-巯基乙醇。洗脱液经过4-12%NuPAGE双三凝胶（Invitrogen）处理。

共焦显微镜

HEK293细胞，转染pcDNA3-His6-将SUMO和pcDNA3-PMLIII-YFP固定在4%多聚甲醛中4°C下10分钟，然后通过抗-His抗体和Alexa Fluor 594结合抗体显示。使用Apochro×63/1.32油浸物镜，在徕卡TCS-NT/SP倒置共焦激光扫描显微镜上获得共焦图像。通过使用Leica Confocal Software，LCS（德国海德堡）对图像进行叠加，进行了共缩放实验。不同标记染料的激发和发射滤波器如下：YFP（绿色）：λ前488纳米；λ相对长度单位540/25纳米；德克萨斯红（红色）：λ前，568纳米；λ相对长度单位610/30纳米；和DAPI:λ前405纳米；10%功率。

重组His6-SUMO蛋白的生产和纯化

大肠埃希氏菌不同pET28-His转化的BL21细胞6-用1m诱导表达SUMO的载体米1-硫代-β异丙基-d日-吡喃半乳糖苷5h。细胞在20m内裂解米磷酸盐缓冲液，pH 7.6500 m米氯化钠，30米米通过连续液氮和37°C浴，然后进行超声波处理，得到咪唑。离心后，将上清液装入5 ml NTA HiTra螯合HP柱（GE Healthcare）。根据制造商的说明清洗色谱柱，并使用50–500 m的咪唑梯度洗脱样品米.包含大部分His的分数6-SUMO重组蛋白使用Ultra Centricon浓缩，截止值为30 kDa（Millipore）。

体外SUMO酸化试验

至反应缓冲器（20 m米全日空航空公司4一氧化碳三，pH值9，20 m米氯化钠，0.5米米DTT），1μg重组SUMO蛋白；0.5μg底物E2-25K（Boston Biochem）、GST-RanGAP片段418-587（Boston-Biochen）或GST-PML片段485-495（Biomol International）；0.1μg SASE1/SAE2异二聚体（Boston Biochem）；添加0.5μg结合酶hUbC9（Boston Biochem），添加或不添加5 m米Mg-ATP（波士顿生物化学）。在37°C下孵育1小时后，反应停止10米米EDTA公司。样品通过免疫印迹、考马斯染色或银染和MS进行分析。

磺胺酰化蛋白的细胞分离和大规模纯化

HEK293电池（108细胞/复制）稳定表达His6-SUMO突变体在低渗缓冲液（10m米三氯化氢，pH 7.65，1.5 m米氯化镁2，1米米DTT，20米米 N个-乙基马来酰亚胺、蛋白酶抑制剂），并以3000×g离心。上清液构成细胞质部分。将颗粒重悬于缓冲液A中，超声处理，以16000×克，并添加到500μl NTA-大蒜糖珠中3 h。按照上述洗涤和洗脱步骤进行后，将一等分洗脱液用于免疫印迹，其余（50–60μg/重复）用于MS分析。蛋白质在0.5米内减少米三（2-羧乙基）膦（皮尔斯）在37°C下保持20分钟，然后在50 m内烷基化米氯乙酰胺（Sigma-Aldrich）在37°C下保持20分钟。50米溶液米将二硫苏糖醇添加到蛋白质溶液中，与过量的氯乙酰胺反应。通过Bradford蛋白质测定法对总蛋白质量进行定量。蛋白质在50 m内消化米37°C下，高搅拌速度下，碳酸氢铵与改性胰蛋白酶（Pierce）过夜（酶：底物比1:30）。消化混合物用三氟乙酸（TFA）酸化，用HLB筒（Waters）脱盐，然后在MS分析之前用SpeedVac干燥。

质谱法

所有LC-MS/MS分析均使用LTQ-Orbitrap-Velos混合质谱仪进行，该质谱仪带有纳米电喷雾离子源（加利福尼亚州圣何塞市ThermoFisher）和Eksigent纳米液晶2D泵（加利福尼亚州都柏林）。肽在Optiguard SCX陷阱柱（5μm，300Å, 0.5mm内径×23mm；Optimize Technologies，Oregon City，OR）并在线洗脱至360-μm内径×4-mm C18在150-μm内径×10-cm纳米液晶柱（Jupiter C18，3微米，300Å；Phenomex）。将色氨酸消化液加载到SCX捕集器上，然后使用0、75、250、500、1和2的盐塞依次洗脱米乙酸铵，pH 3.5。在C上吸附后18柱前，在分析柱上使用5-40%乙腈（0.2%甲酸）的线性梯度在53 min内以600 nl/min的流速分离肽。常规MS光谱（测量扫描）在剖面模式下以60000的分辨率获得米/z400.在离子阱中仅使用碰撞诱导解离（CID）或将CID和电子转移解离（ETD）与辅助激活模式结合，以决策树数据相关的方式获得MS/MS光谱(38)对于超过10000计数阈值的多电荷离子。质量校准使用内部锁质量（质子化（Si（CH三)2O） ）6;米/z445.12057），通常为前体离子质量测量提供5 ppm以内的质量精度。ETD激活的前体离子米/z< 650 (3+),米/z<900（4+），以及米/z950 (5+). 对于ETD，前体阳离子自动增益控制目标设置为50000，而荧蒽阴离子群体使用100000的值。离子/离子反应持续时间固定为200毫秒。启用对先前获得的前体离子的动态排除（重复计数，1；重复持续时间，30秒；排除持续时间，120秒）。

使用内部肽检测和聚类软件将Orbitrap原始LC-MS数据文件转换为肽图(39). 使用Δ的聚类参数对属于一个实验的肽图进行聚类和对齐米/z=0.02和±2分钟（宽），±0.5分钟（窄）。肽簇与吉祥物鉴定文件对齐，以分配序列标识。

蛋白质鉴定和生物信息学分析

使用Xcalibur软件（2.0版SR1）采集MS数据。然后使用马斯科特蒸馏器软件（英国伦敦矩阵科学2.1.1版）生成峰值列表，并使用LCQ_plus_zoom脚本实现MS处理。使用Mascot（2.1版，Matrix Science）对包含150858个序列（3.54版，2009年1月发布）的非冗余IPI人类数据库进行数据库搜索。对由IPI人类数据库的正向和反向组合版本组成的串联目标/诱饵数据库进行吉祥物搜索，以确定CID或ETD的临界分数阈值，该阈值通常为25，假阳性率小于2%(第页< 0.02). 前体和碎片离子质量值的误差窗口分别设置为0.02和0.5 Da。胰蛋白酶允许缺失的切割位点数量设置为1，并选择磷酸化（STY）、氧化（Met）、脱酰胺（NQ）、氨基甲酰化（Cys）和SUMO化（Lys）（GGTQE:SUMO1、GGTQQ:SUMO2或GGTQN:SUMO3）作为可变修饰。我们还开发了一个Perl脚本，用于搜索Mascot通用文件（mgf）中的特定SUMO片段离子(例如SUMO1：米/z240.1、258.1、341.1和359.2；SUMO3公司：米/z243.1和344.2；以及SUMO残余物的中性损失），以生成包含潜在SUMO化肽候选物的所有MS/MS光谱的mgf子集文件。使用ChopNSpice生成一个修改后的IPI人类数据库，其中包含每个赖氨酸残基上的五氨基酸SUMO特异性标记，从而获得潜在的SUMO肽候选物(35). 使用SUMmOn进行数据库搜索时，使用了Brian Raught博士（加拿大多伦多大学健康网络）提供的定制软件(34). 人工检查修饰肽的所有MS/MS光谱，以验证分配(补充图S8).

结果

为了方便体内为了鉴定SUMO化蛋白，我们开发了pcDNA3-His-SUMO表达载体，该表达载体包含每个SUMO同源序列C末端的战略性突变(图1一). 这些突变赋予稳定表达的蛋白质产品重要的特性。首先，他的6-带有精氨酸取代的SUMO突变体在修饰Lys残基的侧链上引入了一个方便的胰蛋白酶裂解位点，从而可以通过质量特异性特征片段离子识别单个副log。其次，附加在修饰Lys残基上的短五氨基酸片段(例如SUMO1 mut的EQTGG；图1一)导致Lys侧链中的片段离子更少，这一特性有助于使用传统数据库搜索引擎识别氨酰化肽。短SUMO残基的另一个优点是可以获得一个表位，抗体可以被提高并用于大规模免疫亲和力实验。在本研究的背景下，我们设计了一种亲和富集策略，即先使用NTA柱在变性条件下分离SUMO化蛋白，然后进行胰蛋白酶消化，然后使用MS鉴定SUMO修饰肽(图1b条).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960001.jpg

从人类细胞蛋白提取物中鉴定氨酰化肽的方法概述。 一，泛素的序列(UBI公司)并给出了三个SUMO旁系。产生突变SUMO蛋白；每个包含一个His6N终点处的标签(N位)在C末端的第六个位置有一个Arg残基。b条，净化策略。伊斯6-SUMO突变体在HEK293细胞中表达，并且通过低速离心从HEK293和HEK293 SUMO突变体的细胞裂解物中获得核蛋白。与His结合的蛋白质6-SUMO通过IMAC（Ni2+柱），用胰蛋白酶消化，并用纳米LC-MS/MS进行分析。使用Mascot和内部无标签软件分析蛋白质丰度，并确定目标蛋白质中的SUMO化位点。相对利息。，相对强度；内部。，内源性。

伊斯6-SUMO突变体具有功能，可用于体外和体外监测蛋白质SUMO化

确定定点突变不会损害His的转移6-我们通过SAE1/2-Ubc9接合机制对SUMO突变体进行了在体外使用成熟的蛋白质SUMO化底物进行分析。我们比较了His的SUMO化谱6-SUMO1,2,3 WT和使用RanGAP1和泛素结合酶E2（E2-25K）的相应突变体，这两种蛋白质是SUMOylated体外和在体外(11，40). 将完整的E2-25K和GST标记的C末端RanGAP1蛋白片段（氨基酸418–587）进行SUMOylated在体外如前所述(40，41) (图2一). 相应反应的银色凝胶表明6-SUMO突变体的接合效率与WT-SUMO蛋白相当。在存在ATP的情况下，几乎所有蛋白质底物都转化为SUMOylated RanGAP1和E2-25K产品。有趣的是，我们观察到所有His的多糖基化链6-SUMO突变体和与RanGAP1结合的WT蛋白，包括不含ψK的SUMO1X（X）E共识主题。MS分析在体外消化产物证实了RanGAP1在全蛋白结构中对应于Lys-524残基的所有SUMO副产物上的SUMO化(补充图S1). Lys-11上鉴定出His的多糖基化6-SUMO2,3突变体及其WT蛋白。我们还观察到His的SUMO化6-SUMO1位于Lys-23、Lys-37、Lys-39和Lys-48位点，其中两个（Lys-37和Lys-39）之前由Cooper报告等。(42)在在体外实验(补充图S2).体外SUMO化分析证实了His的共价连接6-E2-25K赖氨酸-14的SUMO1–3突变体(图2b条). 每个人都是他的6-SUMO突变体通过特异片段离子（b*2，b个*三，b个*2−H2O、 b条*三−小时2O、 等）源于SUMO侧链对前体离子的裂解米/z离子阱中碎片<750(⅓ 碎片离子传输规则）。使用提取的离子色谱图对这些独特片段离子进行关联，有助于在复杂的胰蛋白酶消化物中识别潜在的磺胺酰化肽。值得注意的是，所有被检测的SUMO酰化蛋白，包括融合蛋白GST-PML（485-495），都被SENP1有效地去SUMO酰基化，从而证实突变位点没有损害SUMO异肽酶的酶活性(补充图S3).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960002.jpg

一，在体外RanGAP（Lys-524）和E2连接酶（Lys-14）的SUMO酸化分析。b条，MS确认E2-25K中修改的Lys-14用于单个SUMO Paralog。

我们比较了体外His的SUMO化效率6-SUMO突变体及其在HEK293细胞中的WT对应物。我们首先检测了用1μ米作为2O（运行）三持续4小时As2O（运行）三已知可增强急性早幼粒细胞白血病细胞中PML和PML维甲酸受体α融合蛋白的SUMO化和随后的降解(25–28). 以前曾报道过PML中的三个SUMO化位点（Lys-65、Lys-160和Lys-490）(43)，尽管As只需要Lys-1602O（运行）三-触发降级(28，44). 免疫印迹显示His的PML多糖基化增加6-SUMO WT和As上的突变体2O（运行）三处理(图3一，上部面板). PML SUMO化的增加还伴随着WT和突变SUMO3中未修饰PML的耗尽。使用NTA柱纯化的蛋白质提取物的免疫印迹清楚地证明了PML的SUMO化(图3一，底部面板). 值得注意的是，与SUMO1相比，PML通过SUMO3和SUMO2的SUMO化作用增加，这种情况导致PML的泛素依赖性蛋白水解降解(45).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960003.jpg

His-SUMO WT和突变株与磺酰化PMLIII的比较，以及与PML在NB上的共定位。 一，输入的免疫印迹(上部面板)和他的下拉(下部面板)共转染PMLIII和WT或突变SUMO的HEK293细胞提取物，并用As处理或不处理2O（运行）三.b条联合转染YFP-PMLIII和His-SUMO WT的HEK293细胞或使用抗-His抗体显示的突变体的免疫荧光。比例尺，10微米。

PML是0.2–1.0μm亚核结构的组织者，称为PML核体（NB）。PML-NB存在于大多数哺乳动物细胞核中，其形成需要SUMO。这些NB参与调节不同的细胞过程，包括诱导凋亡和细胞衰老、抑制增殖、维持基因组稳定性和抗病毒反应(46，47). 我们通过PML检查了每个His的招募情况6-His共转染HEK293细胞中SUMO突变体和NB上相应的WT6-SUMO和YFP-PMLIII构造(图3b条). His的免疫荧光染色6-SUMO突变体证实了它们与YFP-PML在PML NBs的多个致密核病灶中的共同定位，与His的特征相似6-SUMO WT.此外，As2O（运行）三两种His在NBs中诱导SUMO化PML聚集6-SUMO1 WT和突变体与未处理细胞的比较(补充图S4). 总之，这些实验证明6-SUMO突变体的功能特征与WT突变体相似。

As诱导蛋白质SUMO化的亚细胞分布2O（运行）三

为了确定SUMOylated蛋白的全球分布，我们进行了亚细胞分离，从稳定表达突变型His的HEK293细胞中分离出胞浆和核提取物6-SUMO1,3。使用抗His抗体对这些提取物进行免疫印迹分析表明，在表达His的细胞核部分发现了较高比例的SUMOylated蛋白6-SUMO1和他的6-SUMO3突变体(图4一，车道4和6). 虽然在这两个副产物的高分子量条带中观察到多SUMO化链，但在用His修饰的蛋白质中发现了更高的聚合水平6-SUMO3与以前的报告一致(48). 有趣的是，释放他的6-SUMO1和他的6-与核提取物相比，SUMO3在胞浆中更丰富(图4一，车道3和5)如Seeler和Dejean之前所述(49). 值得注意的是，抗-His免疫印迹也显示在模拟HEK293细胞的核提取物中存在非特异性蛋白质(图4一，车道1和2). 对这些NTA纯化的核提取物（见下文）进行MS分析，确定了几种非特异性蛋白质，包括叉头盒和同源盒蛋白、Pit-Oct-Unc（POU）域转录因子、含有多个His序列的组氨酸三联体核苷酸结合蛋白，以及已知与Ni结合的锌金属结合蛋白2+离子(补充表S1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960004.jpg

对照HEK293和HEK293His-SUMO细胞NTA纯化提取物的免疫印迹。 一，胞浆的比较(C类)和核能(N个)使用抗-His抗体提取。b条，增加蛋白质SUMO化反应As2O（运行）三发现使用了抗PML、抗SUMO1和抗SUMO2,3抗体。

还评估了经砷处理或未经砷处理的细胞的NTA纯化核提取物中蛋白质SUMO化的总体变化2O（运行）三(图4b条). His的蛋白质SUMO化增强6-SUMO1和他的6-SUMO3突变体导致对应的SUMO1和SUMO2，3免疫印迹的高分子量蛋白质的多条带模式。值得注意的是，内源性和突变蛋白质的混合SUMO链可以实现多重聚合，其分布取决于它们的相对比例体外有趣的是，相同NTA亲和纯化提取物的PML免疫印迹清楚地显示内源性PML对As的SUMO化增加2O（运行）三处理(图4b条，上部面板). 相应的带型几乎与SUMO1和SUMO2,3免疫印迹重叠，表明PML代表As上的主要SUMO化底物2O（运行）三处理(图4b条，底部面板). 注意，在缺少As的情况下2O（运行）三即使使用更长的暴露时间（数据未显示），内源性PML也几乎无法检测到。虽然我们确定TIF-1β、层粘连蛋白A/C、PARP1和组蛋白H3为SUMO修饰的蛋白质（见下文），但我们无法通过免疫印迹检测这些内源性蛋白质的SUMO化（数据未显示）可能是因为它们的SUMO化对应物在核提取物中的丰度低和/或抗体结合的表位不可接近。在所有测试的蛋白质中，只有内源性PML对As的反应表现出增强的SUMO酸化2O（运行）三(图4b条，底部面板).

蛋白质SUMO化的大规模鉴定

为了鉴定核提取物中存在的氨酰化蛋白，我们对表达His的HEK293细胞进行了大规模NTA亲和纯化实验6-SUMO3突变体是否暴露于As2O（运行）三在模拟HEK293细胞上也进行了类似的实验，以确定与NTA亲和柱非特异性结合的蛋白质。我们通常从108HEK293细胞在任何条件下和所检测的生物复制品中。NTA纯化后的蛋白质提取物（2μg/注射液）使用二维纳米液相色谱系统（SCX/C）进行MS分析18)连接至LTQ-Orbitrap Velos仪器。使用CID和ETD以决策树的方式获取串联质谱，以提高识别的总体数量(38). 总的来说，我们获得了15000多个MS/MS光谱，对应于使用吉祥物数据库搜索引擎识别的6282个独特肽。为了减少模棱两可的鉴定数量，我们比较了在每种情况下由至少两个肽鉴定的蛋白质，错误发现率小于2%。通过使用这些保守的选择标准，我们共鉴定出639个独特的蛋白质，其中232个蛋白质（36%）是所有三种不同细胞提取物的共同蛋白质(图5一). 常见蛋白质被分配到从NTA柱共同纯化的非特异性结合物中，包括含有多个His序列的蛋白质和锌金属结合蛋白。值得注意的是，这些蛋白质中的一些，如E3 SUMO蛋白连接酶RanBP2、锌指蛋白OZF和DNA拓扑异构酶1（Top1）以前曾被报道为SUMOylated，它们从模拟HEK293 NTA提取物中偶然分离出来，不能完全排除其内源性SUMOylation。更重要的是，我们鉴定了205个对HEK293 SUMO3突变体（含砷和不含砷）提取物特异的蛋白质2O（运行）三)包含已知SUMO化底物，如PML、TIF-1β、PARP1、异质核核糖核蛋白（hnRNP）亚型F和hnRNP C1/C2。每种疾病的蛋白质提取物中发现的蛋白质列表见补充表S1需要注意的是，SUMO化蛋白的明确分配依赖于在修饰Lys残基上识别包含五个氨基酸SUMO残基的胰蛋白酶肽，这种情况仅适用于潜在SUMO蛋白的较小子集（见下文）。我们还使用软件Protein analysis through Evolutionary Relationships（PANTHER）对HEK293 SUMO3突变提取物中富含的生物过程相关术语进行了基因本体分析(http://www.pantherdb.org网站/). 这些分析表明，潜在的SUMO化靶点在涉及染色质重塑、细胞器组织和核转运的蛋白质中显著富集(补充图S5).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960005.jpg

对照HEK293细胞和稳定表达His的HEK291细胞核提取物中SUMO化蛋白的质谱分析6-带和不带As的SUMO32O（运行）三治疗。 一维恩图显示了每个细胞提取物中蛋白质的重叠分布。至少有两种肽的蛋白质被用于比较。b条，在HEK293 His中鉴定的肽离子的强度分布6-SUMO3作为2O（运行）三-受刺激和非刺激细胞。散点图显示了包含Lys-490残基的PML胰蛋白酶肽的丰度变化。c（c）前体离子的MS/MS光谱米/z523.524+使用ETD碎片。SUMO3异肽键的残基和c型片段离子特征如红色相对利息。，相对强度。

表达His细胞NTA富集蛋白提取物的比较6-标记SUMO3突变体能够识别模拟HEK293细胞中未检测到的至少205个SUMOylated候选蛋白。为了确定蛋白质底物上SUMO化位点的位置，我们使用了Mascot、SUMmOn和ChopNSpice搜索引擎。我们还开发了一个脚本，利用特定的SUMO片段离子检索潜在SUMO化肽候选物的所有MS/MS光谱（“实验程序”）。从这些大规模蛋白质组学实验中，我们总共在12种不同的蛋白质底物上鉴定了17个独特的SUMO化位点(表一). 手动验证所有MS/MS光谱(补充图S8)由SUMO3侧链（GGTQN）的特征片段组成。根据三种不同的数据库搜索引擎，确定的残留物数量分布见补充表S2我们确认了先前已知的蛋白质SUMO化位点，如PML（Lys-490）和TIF-1β（Lys-750和Lys-779），以及SUMO2上的交联位点（Lys-11和Lys-41代表SUMO3，Lys-42代表SUMO2）。这些分析还揭示了以前未报告的核底物上的新SUMO化位点，如组蛋白H3.1（Lys-24）、层粘连蛋白（Lys-420）、SAFB2（Lys-524）、RSF1（Lys-287）和WIZ1（Lys-1523），以及与SUMO4（Lys-11）和泛素（Lys-11）的交联位点。

表一

HEK293 His富含NTA的核蛋白中已确认的氨酰化肽列表6-SUMO3突变体
蛋白质现场一状态b条功能
组蛋白3.1赖氨酸-24未知核小体组装
组蛋白4赖氨酸-14未知核小体组装
高速F4B赖氨酸-288未知DNA结合蛋白；约束HSEc（c）; 调节转录
拉明A/C赖氨酸-420未知核纤层
PML公司Lys-380、Lys-400，赖氨酸-490，Lys-497未知/已知(43)PML核机构组织者
RSF1（RSF1）赖氨酸-287未知RSF染色质重塑复合体组装规则核小体
SAFB2公司赖氨酸-524未知与支架/基质附着区DNA结合；也可以抑制细胞增殖
畅通节能法-1βLys-750、Lys-779已知(56)与KRAB域TF形成复合物并增加KRAB介导的抑制
WIZ1型赖氨酸-1523未知可将EHMT1和EHMT2连接至CTPP增压机
泛素赖氨酸-11未知交叉链接
SUMO2公司Lys-11、Lys-42已知(15，42)交叉链接
SUMO3公司Lys-11、Lys-41已知(15，42)交叉链接
SUMO4系列赖氨酸-11预期交叉链接

一位点是指蛋白质序列，包括启动Met残基。粗体表示已知站点。

b条状态指示以前是否报告了站点以及相应的参考。

分析As处理细胞后显示差异调节的蛋白质2O（运行）三，我们比较了表达His的HEK293细胞提取物消化液中确定的肽离子的丰度6-来自对照和刺激细胞的SUMO3突变体。6790个肽离子的丰度分布如图5b条并且表明，92%以上的离子在细胞刺激后表现出少于3倍的丰度变化。PML的变化最为显著，该蛋白在As作用下增加了15倍以上2O（运行）三治疗。我们获得了该蛋白43%的序列覆盖率，发现一些PML胰蛋白酶肽被SUMO3突变修饰。例如，四重质子化肽离子的产物离子(米/z523.5）使用ETD碎片获得，如所示图5c（c）并证实了Lys-490残基的SUMO化。MS/MS光谱主要由肽骨架的c型和z型片段离子以及SUMO3突变侧链裂解产生的特定片段离子控制(例如c（c）*2，c*三和c*4). 如所示图5b条，As处理的细胞样品中该肽的丰度增加2O（运行）三.残基Lys-490是已知的三个PML SUMO化位点之一；另外两个是Lys-65和Lys-160(43). 然而，我们无法在任何被检测的细胞提取物中识别含有这两个修饰残基的胰蛋白酶肽，可能是因为相应肽相对较大的分子量和疏水性阻碍了C18色谱法。

我们的MS分析还显示在Lys-380、Lys-400和Lys-497存在三个新的PML SUMO化位点。残基Lys-380和Lys-400以前被鉴定为as引起的多泛素化位点2O（运行）三(25). 定点突变表明Lys-400的突变延迟但不阻止PML泛素化及其随后蛋白酶体介导的降解(25). 残基Lys-380和Lys-400位于B盒结构域和核定位序列之间，而Lys-497紧邻PML的核定位信号(图6一). 为了确认这些新SUMO化位点的鉴定，我们首先用转染的PML及其SUMO酸化位点突变体检测了不同SUMO同系物的可能位点特异性。我们比较了体外PMLIII WT中每个SUMO WT paralog和与不同PML和SUMO构建物共转染的HEK293细胞提取物中PMLIII 3K突变体（K65R、K160R、K490R）的SUMO化效率(图6b条). 抗-PML免疫印迹显示，当细胞暴露于砷时，SUMO2和SUMO3使PMLIII WT SUMO化增加2O（运行）三与图3一这一点在使用NTA柱纯化的相同蛋白质提取物中得到了明确证明(图6b条，参见他的下拉菜单）。值得注意的是，使用更敏感的ECL免疫印迹进行的类似实验显示，SUMO1对PML的SUMO化，但低于SUMO2和SUMO3的水平(补充图S6). 在所有病例中，与其他SUMO同系物相比，SUMO3的PML显示出显著更高的SUMO化水平。相比之下，PMLIII 3K与His共转染细胞提取物的免疫印迹分析显示一条带6-SUMO WT是否经As处理2O（运行）三（参见图6b条，右上面板，参见输入）。有趣的是，这些样品的NTA蛋白提取物表明，在His-SUMO3中观察到PMLIII 3K的残留SUMO化，在As2O（运行）三处理（参见图6b条，右中面板，参见他的下拉菜单）。这些实验表明，在没有三个已知的SUMO化位点（Lys-65、Lys-160和Lys-490）的情况下，PML仍然是SUMO化的，尽管这种修饰的程度明显低于对PMLIII WT观察到的修饰程度。因此，鉴定的新位点可以解释在PML中观察到的剩余SUMO化。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zjw0021137960006.jpg

PML蛋白中新SUMO化位点的鉴定。 一PMLIII的结构显示了蛋白质结构域以及已知和新的SUMO酰化位点的位置。b条使用抗PML抗体，对联合转染PMLIII WT和PMLIII 3K的HEK293细胞的蛋白提取物以及NTA富集前后不同的SUMO同系物进行免疫印迹。考马斯染色SDS-PAGE凝胶用于比较样品装载量。c（c），提取离子色谱图米/z523.524+, 392.543+、和米/z835.892+分别对应于修饰的Lys-490、Lys-400和Lys-380 PML胰蛋白酶肽。d日前体离子的MS/MS光谱米/z392.543+和米/z835.892+分别通过ETD和CID激活获得。荷兰统计局，核定位信号；相对利息。，相对强度。

HEK293 His NTA纯化蛋白提取物中胰蛋白酶消化物的LC-MS/MS分析6-SUMO3突变细胞鉴定出三个额外的PML SUMO化位点，这些位点被As调控2O（运行）三。Lys-490、Lys-400和Lys-380残基处修饰的胰蛋白酶肽对应的多电荷离子的提取离子色谱图见图6c（c）并表明，在As刺激细胞后，所有三种肽都上调了至少10倍2O（运行）三在As作用下，含有SUMOylated Lys-490和Lys-497残基的胰蛋白酶肽也大量增加2O（运行）三治疗（数据未显示）。前体离子的MS/MS光谱米/z392.543+和米/z835.892+显示了丰富的片段离子，从中可以清楚地确定修饰残基的位置。值得注意的是，修饰的Lys-380和Lys-400残基不是共有基序ψK的一部分X（X）（E/D）。我们还使用在修饰Lys残基上带有五肽SUMO残基的合成肽验证了这些分配。相应肽的MS/MS光谱如下所示补充数据并产生了可与天然肽重叠的片段模式，从而证实了PML上两个先前未知的SUMO化位点(补充图S7).

讨论

蛋白质底物上SUMO酰化位点的识别是一个重要的分析挑战，因为其化学计量相对较低，并且这种修饰具有动态性质。在哺乳动物细胞中，胰蛋白酶消化后修饰的赖氨酸残基上残留的SUMO副产物的大肽残基进一步加剧了这一困难。在这种情况下，构建包含His标签和C末端战略定位的Arg残基的SUMO Paralog为富集和鉴定含有SUMO特异性残基的短肽提供了一种方便的方法。C末端精氨酸残基的明智定位对于维持SUMO副记录的功能，同时与内源性蛋白质相比，将结构变化降至最低非常重要。因此，在SUMO同源序列的C末端用单碱基取代构建质粒，以生成成熟蛋白，其中Arg残基位于C末端的第六个位置，与酵母Smt3蛋白中发现的蛋白类似。

体外用众所周知的蛋白质底物如RanGAP1和E2-25K进行SUMO化分析证实了His的功能6-SUMO突变体及其通过SAE1/2-Ubc9共轭机制的有效转移。酶产品的MS分析不仅确定了这些底物上的预期修饰位点，还确定了每个副产物的多糖基化位点。除了之前在SUMO2和SUMO3蛋白上报道的Lys-11位点外，我们还鉴定了SUMO1上Lys-23、Lys-37、Lys-39和Lys-48的多SUMO化位点，尽管SUMO1聚合链的生理相关性目前尚不清楚。事实上，SUMO1缺乏共识基序ψKX（X）（E/D），虽然最近的研究表明它可以盖住聚SUMO2,3链，但还没有形成聚合物链的报道(50). 我们的分析还表明，修饰肽的MS/MS光谱提供了主链序列离子以及来自CID和ETD激活的短SUMO特异性片段离子，这些离子可以被有利地用于证实SUMO化肽。副log特异性片段离子的存在，如米/z240.1（b）*2−H2O） ，第341页。2（b）*三−H2O） 针对SUMO1突变体，以及米/z243.1（b）*2)和343.2（b）*三)SUMO3突变体可用于此处所示的确认目的，或通过数据依赖性采集来靶向识别这些修饰肽。来自修饰Lys侧链的片段离子数量相对有限，也有助于使用常见数据库搜索引擎（如Mascot）进行蛋白质鉴定(补充表S2).

使用免疫印迹和免疫荧光实验对SUMOylated蛋白进行亚细胞定位，结果表明大部分底物为核，这一观察也解释了这种修饰在转录、DNA修复、核体和核质转运中的重要作用。尽管细胞质、质膜、线粒体和内质网中也存在大量底物，但这种分布在一定程度上归因于SUMO修饰酶在该隔室中的富集(51). 我们对稳定表达His的模拟和HEK293细胞的核蛋白提取物进行了大规模蛋白质组学分析6-SUMO3突变体，用于识别SUMO化底物的性质，包括可由As调节的底物2O（运行）三通过使用严格的比较标准，我们发现了超过205个His特有的蛋白质6-SUMO3突变，如参与染色质重塑、细胞器组织和核转运的蛋白质(补充图S5). 有趣的是，我们发现了一些参与核糖体生物发生调控的蛋白质，包括hnRNP、RNA解旋酶和核糖体亚单位，表明SUMO3修饰可能调节这些大分子复合物的组装。最近的报告表明，在核仁提取物中发现了其中一些底物，并且似乎通过泛素蛋白酶体途径进行调节，这表明SUMO化可能以未组装的核糖体蛋白为目标进行降解(52，53).

我们的蛋白质组学分析还能够鉴定蛋白质中的几个新的SUMO化位点，如H3.1（Lys-24）、层粘连蛋白（Lys-420）、SAFB2（Lys-524）、RSF1（Lys-287）和WIZ1（Lys-1523），以及与SUMO4（Lys-11）和泛素（Lys-11）的交联位点。一些修饰蛋白参与转录，如TIF-1β、HSF4B和PML。特别令人感兴趣的是PML，这是一种定位于NB的蛋白质，在NB中还通过调节p53对致癌信号的反应发挥肿瘤抑制作用(54). 定量蛋白质组学显示，经As刺激后，PML的丰度增加了15倍以上2O（运行）三.回应As2O（运行）三，PML通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径磷酸化，导致其从核质转移到核基质，PML SUMO化和NB大小增加(44，55). 氨酰化PML招募含有RING结构域的泛素E3连接酶RNF4，通过泛素蛋白酶体途径导致其降解(24，25).

有趣的是，一种PMLIII 3K结构，其中所有三个已知的SUMO酰化位点都突变为Arg，但仍转移到核基质中，但对As具有抗性2O（运行）三-诱导PML降解(44). PML以SUMO依赖于As的方式转移到核基质的确切机制2O（运行）三治疗尚不清楚，但可能涉及其先前的磷酸化。值得注意的是，当对照组和As的总提取物时，磺胺酰化形式的PML几乎无法检测到2O（运行）三-用抗PML抗体（参考文献。44和图6b条). 此外，我们观察到，蛋白质提取物的NTA富集显示了SUMO3对PMLIII 3K的残留SUMO化，而SUMO2和SUMO3的PMLIII 3G的SUMO化度随着As的增加而增加2O（运行）三我们的数据表明As2O（运行）三-PMLIII的介导SUMO化仍可能发生在三个已知残基Lys-65、Lys-160和Lys-490以外的位点。详细的蛋白质组学分析能够明确地将Lys-380、Lys-400和Lys-497鉴定为受as调节的额外SUMO化位点2O（运行）三治疗。有趣的是，其中两个位点（Lys-380和Lys-400）以前被证明是泛素化的在体外(24). 需要进一步调查以确定这些新站点对PML功能的重要性。

可在人类细胞中稳定表达的功能性SUMO突变体的可用性为大规模SUMOylome分析开辟了新的途径。SUMO化肽的富集可以通过使用NTA柱进行单一亲和纯化来实现，如本文所示，也可以通过使用识别修饰胰蛋白酶肽SUMO残基的特定抗体结合额外的免疫亲和富集步骤来实现。我们预计，与单独使用NTA相比，结合双亲和力富集方法将产生更大比例的SUMO化胰蛋白酶肽。修饰Lys残基侧链上存在短的副log特异性肽段，这提供了特征片段离子，有助于从复杂细胞消化物中鉴定和确认磺胺酰化肽。本方法提供了一种方便的工具，用于识别每个SUMO paralog修饰的底物，并在全球范围内确定多SUMO化链的性质，或用于SDS-PAGE分离的特定蛋白质。此方法是对Matic描述的最新方法的补充等。(30)使用抗Lys-C的SUMO2突变体，该突变体在该蛋白的C末端也含有Arg残基。这些碎片离子可用于MS数据相关实验的设计，以更有效地确定其识别目标。虽然这些修饰的胰蛋白酶肽的MS/MS光谱包含SUMO残留物特有的光谱特征，但使用传统搜索引擎（如Mascot）可以有效地实现相应肽的数据库搜索。本方法的分析优势和进行定量蛋白质组学分析的可能性将极大地促进大规模实验，以揭示蛋白质SUMO化的复杂调控。

致谢

我们感谢Brian Raught博士和Tharan Srikumar（加拿大多伦多大学健康网络）在使用SUMmOn软件识别磺胺酰化底物方面提供的宝贵帮助。我们非常感谢Muriel Aubry博士（加拿大蒙特利尔蒙特勒大学）的宝贵意见和讨论。免疫与癌症研究所得到了加拿大商业化和研究卓越中心、加拿大创新基金会和魁北克圣母基金会的部分支持。

脚注

*这项工作得到了国家科学与工程研究委员会、加拿大卫生研究院、加拿大研究主席计划（给P.T.和S.M.）和法国国立癌症研究院的运营拨款的部分支持。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充表S1和S2以及图S1-S8.

1使用的缩写如下：

SUMO公司
小泛素相关修饰物
作为2O（运行）三
三氧化二砷
E2-25K系列
E2泛素连接酶，25千道尔顿
电子数据交换
电子转移裂解
hnRNP公司
异质核核糖核蛋白
注
核体
NTA公司
硝酸镍
第1部分
聚ADP-核糖聚合酶1
皮亚斯
活化STAT蛋白抑制剂
PML公司
早幼粒细胞白血病
跑步BP2
Ran-binding蛋白2
跑步GAP1
Ran GTPase激活蛋白1
环
真有趣的新基因
RNF4（参考号4）
无名指4蛋白
RSF1（RSF1）
重塑和间距因子1
美国汽车工程师协会
SUMO激活酶
SAFB2公司
脚手架装配系数B2
SENP公司
sentrin特异性蛋白酶
畅通节能法-1β
转录中介因子1-β
Ubc9公司
泛素样蛋白SUMO1结合酶
多用途终端
突变体
Bis-Tris公司
2-[双（2-羟乙基）氨基]-2-（羟甲基）丙烷-1,3-二醇
SCX公司
强阳离子交换
IPI公司
国际蛋白质指数
HSE公司
热冲击元件
全面禁试计划
C末端结合蛋白。

参考文献

1Kerscher O.、Felberbaum R.、Hochstrasser M.（2006年）泛素和泛素样蛋白对蛋白质的修饰.每年。Rev.细胞发育生物学.22, 159–180 [公共医学][谷歌学者]
2Meulmeester E.、Melchior F.（2008）细胞生物学：SUMO.自然 452, 709–711 [公共医学][谷歌学者]
三。Guo B.、Yang S.H.、Witty J.、Sharrocks A.D.（2007年）信号通路与SUMO修饰的调控.生物化学。社会事务处理.35, 1414–1418 [公共医学][谷歌学者]
4Mukhopadhyay D.，Dasso M.（2007）反向修饰：SUMO蛋白酶.生物化学趋势。科学.32, 286–295 [公共医学][谷歌学者]
5Lin D.、Tatham M.H.、Yu B.、Kim S.、Hay R.T.、Chen Y.（2002）Ubc9上底物识别位点的识别.生物学杂志。化学.277, 21740–21748 [公共医学][谷歌学者]
6Sampson D.A.、Wang M.、Matunis M.J.（2001）小泛素样修饰物-1（SUMO-1）共有序列介导Ubc9结合，对SUMO-1修饰至关重要.生物学杂志。化学.276, 21664–21669 [公共医学][谷歌学者]
7Hietakangas V.、Anckar J.、Blomster H.A.、Fujimoto M.、Palvimo J.J.、Nakai A.、Sistonen L.（2006）PDSM，磷酸化依赖性SUMO修饰的基序.程序。国家。阿卡德。科学。美国.103, 45–50[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Yang S.H.、Galanis A.、Witty J.、Sharrocks A.D.（2006）扩展的共识基序增强了SUMO对底物修饰的特异性.欧洲工商管理硕士J.25, 5083–5093[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9Hoege C.、Pfander B.、Moldovan G.L.、Pyrowolakis G.、Jentsch S.（2002）RAD6依赖性DNA修复与泛素和SUMO对PCNA的修饰有关.自然 419, 135–141 [公共医学][谷歌学者]
10林登毅、黄亚生、郑建中、郭华瑜、张春春、赵天堂、何春秋、陈永川、林天平、方海一、洪春秋、孙春生、黄敏杰、张国顺、毛国刚、施华明（2006）SUMO相互作用基序在Daxx-SUMO修饰、亚核定位和抑制sumoylated转录因子中的作用.分子电池 24, 341–354 [公共医学][谷歌学者]
11Pichler A.、Knipscheal P.、Oberhofer E.、van Dijk W.J.、Körner R.、Olsen J.V.、Jentsch S.、Melchior F.、Sixma T.K.（2005）泛素结合酶E2-25K的SUMO修饰.自然结构。分子生物学.12, 264–269 [公共医学][谷歌学者]
12郭D.，李M.，张勇，杨P.，埃肯罗德S.，霍普金斯D.，郑伟，普罗希特S.，波多尔斯基R.H.，缪尔A.，王J.，董仲，布鲁斯科T.，阿特金森M.，波齐利P.，泽德勒A.，拉斐尔L.J.，雅各布C.O.，朴Y.，塞拉诺·里奥斯M.，拉拉德M.T.，张Z.，加雄H.J.，巴赫J.F.，罗特J.I.，舍J.，王春云（2004）SUMO4的一种功能变体，一种新的IκBα修饰因子，与1型糖尿病有关.自然遗传学.36，837–841[公共医学][谷歌学者]
13Owerbach D.、McKay E.M.、Yeh E.T.、Gabbay K.H.、Bohren K.M.（2005）SUMO-4特有的脯氨酸-90残基阻止成熟和sumoylation.生物化学。生物物理学。Res.Commun公司.337, 517–520 [公共医学][谷歌学者]
14Golebiowski F.、Matic I.、Tatham M.H.、Cole C.、Yin Y.、Nakamura A.、Cox J.、Barton G.J.、Mann M.、Hay R.T.（2009）应对热冲击，对SUMO修改进行全系统更改.科学。信号.2，ra24。[公共医学][谷歌学者]
15Tatham M.H.、Jaffray E.、Vaughan O.A.、Desterro J.M.、Botting C.H.、Naismith J.H.、Hay R.T.（2001）SUMO-2和SUMO-3的聚合物链通过SAE1/SAE2和Ubc9与蛋白质底物偶联.生物学杂志。化学.276, 35368–35374 [公共医学][谷歌学者]
16Matic I.、van Hagen M.、Schimmel J.、Macek B.、Ogg S.C.、Tatham M.H.、Hay R.T.、Lamond A.I.、Mann M.、Vertegaal A.C.（2008）高精度质谱法在体内鉴定人小泛素样修饰物聚合位点及体外到体内策略.分子细胞。蛋白质组学 7, 132–144[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
17Pichler A.、Gast A.、Seeler J.S.、Dejean A.、Melchior F.（2002）核穿孔蛋白RanBP2具有SUMO1 E3连接酶活性.单元格 108, 109–120 [公共医学][谷歌学者]
18Hay R.T.（2005）SUMO：修改的历史.分子电池 18, 1–12 [公共医学][谷歌学者]
19Bossis G.、Melchior F.（2006）SUMO：调节调节器.细胞分裂 1, 13.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Hoeller D.，Dikic I.（2009年）肿瘤治疗中泛素系统的靶向性.自然 458, 438–444 [公共医学][谷歌学者]
21Schimmel J.、Larsen K.M.、Matic I.、van Hagen M.、Cox J.、Mann M.、Andersen J.S.、Vertegaal A.C.（2008）泛素蛋白酶体系统是SUMO-2/3循环的关键组成部分.分子细胞。蛋白质组学 7, 2107–2122 [公共医学][谷歌学者]
22Denuc A.、Marfany G.（2010年）SUMO和泛素路径收敛.生物化学。社会事务处理.38, 34–39 [公共医学][谷歌学者]
23Desterro J.M.、Rodriguez M.S.、Hay R.T.（1998）SUMO-1修饰IkappaBalpha抑制NF-kappaB活化.分子电池 2, 233–239 [公共医学][谷歌学者]
24Tatham M.H.、Geoffroy M.C.、Shen L.、Plechanovova A.、Hattersley N.、Jaffray E.G.、Palvimo J.J.、Hay R.T.（2008）RNF4是一种多-SUMO-特异性E3泛素连接酶，用于砷诱导PML降解.自然细胞生物学.10, 538–546 [公共医学][谷歌学者]
25Lallemand-Breitenbach V.、Jeanne M.、Benhenda S.、Nasr R.、Lei M.、Peres L.、Zhou J.、Zhu J.、Raught B.、de ThéH.（2008）砷通过SUMO触发的RNF4/泛素介导途径降解PML或PML-RARalpha.自然细胞生物学.10, 547–555 [公共医学][谷歌学者]
26陈国强、史晓刚、汤伟、熊S.M.、朱杰、蔡欣、韩志刚、倪J.H.、史国勇、贾P.M.、刘M.M.、何克力、牛C.、马J.、张P.、张T.D.、保罗P.、纳奥T.、北村K.、米勒W.、瓦克斯曼S.、王志毅、德·H、陈S.J.、陈Z.（1997）三氧化二砷（As2O（运行）三)在急性早幼粒细胞白血病（APL）的治疗中：I.As2O（运行）三对APL细胞的剂量依赖性双重效应.血液 89, 3345–3353 [公共医学][谷歌学者]
27Müller S.、Matunis M.J.、Dejean A.（1998）与泛素相关修饰物SUMO-1结合调节PML在细胞核内的分配.欧洲工商管理硕士J.17, 61–70[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28朱杰、科肯·M·H·H、奎农·F·、切尔比·阿利克斯·M·K·、德戈斯·L·、王振毅、陈振和·德·塞·H·（1997）砷诱导的PML靶向核体：对急性早幼粒细胞白血病治疗的意义.程序。国家。阿卡德。科学。美国.94, 3978–3983[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Blomster H.A.、Imanishi S.Y.、Siimes J.、Kastu J.、Morrice N.A.、Eriksson J.E.、Sistonen L.（2010）通过标记标签和半胱氨酸靶向亲和纯化在体内鉴定sumoylation位点.生物学杂志。化学.285, 19324–19329[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Matic I.、Schimmel J.、Hendriks I.A.、van Santen M.A.、van de Rijke F.、van Dam H.、Gnad F.、Mann M.、Vertegaal A.C.（2010）细胞中SUMO-2靶点的位点特异性鉴定揭示了一个反转的SUMO酰化基序和一个疏水簇SUMO基序.分子电池 39, 641–652 [公共医学][谷歌学者]
31Tatham M.H.、Rodriguez M.S.、Xirodimas D.P.、Hay R.T.（2009）体内蛋白质SUMO化的检测.自然协议.4, 1363–1371 [公共医学][谷歌学者]
32Vertegaal A.C.、Andersen J.S.、Ogg S.C.、Hay R.T.、Mann M.、Lamond A.I.（2006）定量蛋白质组学揭示的SUMO-1和SUMO-2靶蛋白组的不同和重叠.分子细胞。蛋白质组学 5, 2298–2310 [公共医学][谷歌学者]
33Wohlschlegel J.A.、Johnson E.S.、Reed S.I.、Yates J.R.，第3期（2006年）使用C末端SUMO突变体和定制蛋白酶消化策略改进SUMO附着位点的鉴定.蛋白质组研究杂志.5, 761–770[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Pedrioli P.G.、Raught B.、Zhang X.D.、Rogers R.、Aitchison J.、Matunis M.、Aebersold R.（2006）使用质谱和SUMmOn模式识别软件自动识别SUMO化位点.自然方法 三, 533–539 [公共医学][谷歌学者]
35萧H.、穆尔米斯特E.、弗兰克B.T.、梅尔基奥F.、乌尔劳布H.（2009）“ChopNSpice”，一种质谱方法，可用于鉴定内源性小泛素样修饰共轭肽.分子细胞。蛋白质组学 8, 2664–2675[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
36Xu G.、Paige J.S.、Jaffrey S.R.（2010）泛素残基免疫亲和性分析法对赖氨酸泛素化的整体分析.自然生物技术.28, 868–873[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
37Percherancer Y.、Germain-Desprez D.、Galisson F.、Mascle X.H.、Dianoux L.、Estephan P.、Chelbi-Alix M.K.、Aubry M.（2009）SUMO在RNF4介导的早幼粒细胞白血病蛋白（PML）降解中的作用：PML的SUM酰化及其在活细胞中切割的SUMO结合结构域的磷酸化开关控制.生物学杂志。化学.284，16595年–16608年[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Swaney D.L.、McAlister G.C.、Coon J.J.（2008）鸟枪蛋白质组学的决策树驱动串联质谱.自然方法 5, 959–964[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Marcantonio M.、Trost M.、Courcelles M.、Desjardins M.、Thibault P.（2008）酶和数据挖掘相结合的综合磷蛋白组分析方法：应用于干扰素-γ刺激巨噬细胞的细胞信号事件.分子细胞。蛋白质组学 7，645–660[公共医学][谷歌学者]
40Matunis M.J.、Coutavas E.、Blobel G.（1996）一种新的泛素样修饰调节Ran-GTPase激活蛋白RanGAP1在胞浆和核孔复合体之间的分配.细胞生物学杂志.135, 1457–1470[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
41Rogers R.S.、Horvath C.M.、Matunis M.J.（2003）STAT1的SUMO修饰及其在PIAS介导的基因激活抑制中的作用.生物学杂志。化学.278, 30091–30097 [公共医学][谷歌学者]
42Cooper H.J.、Tatham M.H.、Jaffray E.、Heath J.K.、Lam T.T.、Marshall A.G.、Hay R.T.（2005）傅里叶变换离子回旋共振质谱法分析小泛素样修饰物（SUMO）修饰：鉴定在E3自SUMO化反应中修饰的RanBP2和SUMO中的赖氨酸.分析。化学.77, 6310–6319 [公共医学][谷歌学者]
43Kamitani T.、Kito K.、Nguyen H.P.、Wada H.、Fukuda-Kamitani T.、Yeh E.T.（1998）PML中三个主要sentrinization位点的鉴定.生物学杂志。化学.273, 26675–26682 [公共医学][谷歌学者]
44Lallemand-Breitenbach V.、Zhu J.、Puvion F.、Koken M.、HonoréN.、Doubeikovsky A.、Duprez E.、Pandolfi P.、Puvin E.、Freemont P.、de ThéH.（2001）早幼粒细胞白血病（PML）sumolation在核体形成、11S蛋白酶体募集和As中的作用2O（运行）三-诱导PML或PML/维甲酸受体α降解.《实验医学杂志》.193, 1361–1371[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
45Weisshaar S.R.、Keusekotten K.、Krause A.、Horst C.、Springer H.M.、Göttsche K.，Dohmen R.J.、Praefcke G.J.（2008）三氧化二砷刺激SUMO-2/3修饰，导致RNF4依赖的PML蛋白水解靶向.FEBS信函.582, 3174–3178 [公共医学][谷歌学者]
46Bernardi R.、Pandolfi P.（2007）早幼粒细胞白血病核体的结构、动力学和功能.自然修订分子细胞生物学.8, 1006–1016 [公共医学][谷歌学者]
47Everett R.D.、Chelbi-Alix M.K.（2007）PML和PML核体：抗病毒防御的意义.生物化学 89, 819–830 [公共医学][谷歌学者]
48Saitoh H.、Hinchey J.（2000）小泛素相关蛋白修饰物SUMO-1与SUMO-2/3的功能异质性.生物学杂志。化学.275, 6252–6258 [公共医学][谷歌学者]
49Seeler J.S.，Dejean A.（2003）SUMO的核功能和不明确的功能.自然修订分子细胞生物学.4，690–699[公共医学][谷歌学者]
50Martin S.、Wilkinson K.A.、Nishimune A.、Henley J.M.（2007）蛋白质SUMO酸化在神经元功能和功能障碍中的核外作用.神经科学自然评论.8, 948–959[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Geiss-Friedlander R.，Melchior F.（2007）苏美化的概念：十年.自然修订分子细胞生物学.8, 947–956 [公共医学][谷歌学者]
52Matafora V.、D’Amato A.、Mori S.、Blasi F.、Bachi A.（2009年）蛋白酶体抑制后核仁SUMO-1靶蛋白的蛋白质组学分析.分子细胞。蛋白质组学 8, 2243–2255[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
53Lam Y.W.、Lamond A.I.、Mann M.、Andersen J.S.（2007）核仁蛋白动力学分析揭示核糖体蛋白的核降解.货币。生物.17, 749–760[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
54Pampin M.、Simonin Y.、Blondel B.、Percherancer Y.、Chelbi-Alix M.K.（2006）脊髓灰质炎病毒感染期间PML和p53的相互作用：抗病毒防御的意义.J.维罗尔.80, 8582–8592[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
55Hayakawa F.，Privalsky M.L.（2004）丝裂原活化蛋白激酶对PML的磷酸化在三氧化二砷介导的细胞凋亡中起关键作用.癌细胞 5, 389–401 [公共医学][谷歌学者]
56Mascle X.H.、Germain-Desprez D.、Huynh P.、Estephan P.、Aubry M.（2007）转录中介因子1beta（TIF1beta）是KRAB多指蛋白的共同阻遏物，其Sumoylation对其转录活性是必需的，并受KRAB结构域的调控.生物学杂志。化学.282, 10190–10202 [公共医学][谷歌学者]
文章来自分子和细胞蛋白质组学：MCP由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会