生物化学杂志。2010年12月31日；285(53): 41961–41971.
调节重编程因子的微RNA的鉴定第28行胚胎干细胞和癌细胞*
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黄启红
这个§宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所，19104
乔治·库科斯
从‡卵巢癌早期检测和治疗研究中心，
这个¶妇产科，以及
这个‖宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所，宾夕法尼亚州费城，19104和
林章（Lin Zhang）
从‡卵巢癌早期检测和治疗研究中心，
这个¶妇产科，以及
从‡卵巢癌早期检测和治疗研究中心，
这个¶妇产科，以及
这个‖宾夕法尼亚大学艾布拉姆森家族癌症研究所，宾夕法尼亚州费城，19104和
这个§宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所，19104
收到日期：2010年7月28日；2010年10月14日修订
- 补充资料
补充数据
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摘要
第28行（与秀丽隐杆线虫lin-28基因）是一种进化上保守的RNA结合蛋白，是控制胚胎干细胞多能性的主调节器。与一起华侨城4号，SOX2标准、和NANOG公司，第28行可以对体细胞进行重新编程，产生诱导的多能干细胞。的表达式第28行仅限于胚胎干细胞和发育中的组织。在人类肿瘤中，第28行上调，并作为一个致癌基因促进恶性转化和肿瘤进展。然而第28行基本上仍不为人所知。检测抑制第28行表达式，组合生物信息学本研究采用预测和miRNA文库筛选方法。四种miRNAs直接调节第28行(let-7，密尔-125，mir-9、和mir-30型)最初通过该方法鉴定，并通过定量RT-PCR、Western blot分析和第28行3′-UTR报告分析。我们发现这四种miRNAs的表达水平聚集在一起，与第28行胚胎干细胞分化过程中的表达。此外，这些miRNAs的表达在第28行-阳性肿瘤细胞与第28行-阴性肿瘤细胞。重要的是，我们证明这些miRNAs能够调节let-7，调解人第28行综合起来，我们的研究表明miRNAslet-7，mir-125型，mir-9、和mir-30型直接抑制第28行在胚胎干细胞和癌细胞中的表达。这些miRNAs的全球下调可能是第28行人类癌症中的再激活。
关键词：胚胎干细胞，微RNA，癌基因，肿瘤，肿瘤抑制因子，LIN28，转录后调节
介绍
LIN28是一种进化上保守的RNA结合蛋白，具有两个RNA结合结构域（一个冷休克结构域和逆转录病毒型CCHC锌指基序），首次被鉴定为发育时间的关键调节因子秀丽隐杆线虫(1，2). 哺乳动物的同源物秀丽线虫-28基因(第28行和LIN28B系列)在胚胎发生等过程中很重要(三)，骨骼肌发生(4)，生殖细胞发育(5，6)和神经胶质生成(7，8). 全基因组关联研究表明林28b控制人类身高和月经初潮时间的基因座(9，–13). 这一发现已成功地在表达诱导因子的转基因小鼠模型中进行了现象复制第28行(14). 越来越多的证据表明第28行也可能是控制ES细胞多能性的主调节器(15，–18).第28行，与华侨城4号，SOX2标准、和NANOG公司（“重编程因子”），可以将体细胞重编程为诱导的多能干细胞(19). 几份报告表明第28行与mRNA结合，调节其稳定性和翻译(4，16，17). 此外，林28可以与miRNA前体的末端环结合let-7，从而阻止let-7变成成熟的形式(7，8，20，–26). 重要的是第28行仅限于ES2细胞和发育中的组织，随着分化的进行，其表达显著降低(2，4，5，8，14，27，–29). 在人类肿瘤中，LIN28/LIN28B系列上调/重新激活，并作为致癌基因促进恶性转化和肿瘤进展(30，–37). 然而，哺乳动物的转录和转录后调控第28行基本上仍不得而知。
miRNAs是内源性～18-25核苷酸非编码小RNA，通过降解靶mRNAs或抑制蛋白质翻译以序列特异的方式调节基因表达(38，–40). 除了Alu重复序列中的miRNA，它们由RNA聚合酶III转录(41)，大多数miRNA来自聚合酶II转录的初级miRNA转录物，包含5′端帽和聚（a）尾(42，43). 初级miRNA转录物在细胞核内被一种称为微处理器的多蛋白复合物切割成一种约70核苷酸发夹状前体，称为前miRNA，该复合物由RNase III酶Drosha和双链RNA-结合域蛋白DGCR8/Pasha组成(44，–47). 接下来，前miRNA通过Exportin-5通过Ran-GTP-依赖机制被导入细胞质(48，–50). 前miRNA被RNase III酶Dicer与人类细胞中的伴侣TRBP/Loquacious和PACT进一步切割成成熟的~22核苷酸miRNA-miRNA*双链体(51，52). 随后，一种称为RISC的RNA诱导沉默复合物与Argonaute 2组装在一起(53，54). miRNA链选择性地并入RISC(55，56)并通过碱基对映相互作用引导复合物特异性地指向其mRNA靶点。
实验程序
细胞培养
癌细胞株A2780、T47D、MCF7和HeLa在添加10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）和1%青霉素/链霉素（Invitrogen）的RPMI1640（Cellgro）中培养。小鼠胚胎成纤维细胞在含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Invitrogen）中培养。将小鼠胚胎干细胞系R1（ATCC）和C57BL/6J-693（The Jackson Laboratory）维持在明胶包被的烧瓶上，该烧瓶含有含15%ES细胞FBS（Invitrogen）的DMEM中的丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞米 我-谷氨酰胺（Invitrogen）、1%MEM非必需氨基酸（Invitro）、1%青霉素/链霉素、0.1 m米2-巯基乙醇（Invitrogen）和1000单位/ml小鼠白血病抑制因子（Chemicon）。
质粒构建
在黄启宏博士（Wistar Institute）的实验室中生成了全基因组miRNA表达库。人类的全长序列第28行利用罗氏应用科学公司（Roche Applied Science）的Expand High Fidelity PCR系统从人类基因组DNA中克隆了3′-非翻译区（3′-UTR）。PCR产物连接到PCR2.1 TOPO克隆载体（Invitrogen），然后亚克隆到psiCHECK2报告载体（Promega）。对于报告载体上microRNA结合位点的突变，如前所述使用PCR重叠延伸法(57). 简言之，包含突变位点的引物被设计成具有重叠末端。第一轮PCR以野生型报告质粒为模板，使用Expand High Fidelity PCR系统进行，得到两端有突变序列的两个片段。片段被纯化并相互退火，以进行相互引物延伸。然后通过第二轮PCR产生具有所需突变的全长DNA片段。纯化的DNA被消化并与报告载体主干连接。
西部印记
细胞在哺乳动物蛋白提取试剂（Pierce）中溶解。使用BCA蛋白检测试剂盒（Pierce）定量后，在变性条件下用10%SDS-PAGE分离15μg总蛋白，并转移至PVDF膜（Millipore）。在5%脱脂牛奶（Bio-Rad）中封闭膜，然后用抗LIN28一级抗体（1:10000；Abcam）孵育，然后用与HRP结合的抗兔二级抗体（1:10000；Amersham Biosciences）孵养，再与β-肌动蛋白的HRP结合一级抗体一起孵育（1:10000，Sigma）。使用LumiGLO化学发光底物（细胞信号传递）观察免疫反应蛋白。
定量实时RT-PCR
使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，并在供应商提供的条件下使用高容量RNA-to-cDNA试剂盒（Applied Biosystems）进行反向转录。使用下列引物在ABI Prism 7900序列检测系统（Applied Biosystems）上通过RT-PCR对cDNA进行定量根据制造商的说明，使用SYBR Green PCR核心试剂（Applied Biosystems）进行PCR。对每个样本进行家政基因GAPDH的PCR扩增，作为样本装载的对照，并允许样本之间的标准化。
TaqMan miRNA分析流体卡
用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。根据制造商的说明，使用Megaplex RT引物池（Applied Biosystems）和Taqman microRNA逆转录试剂盒（AppliedBiosystes）对700 ng总RNA进行逆转录。将cDNA加载到Taqman miRNA面板A（Applied Biosystems）的微流体卡中，并按照制造商的说明进行定量PCR。
TaqMan miRNA分析
在供应商规定的条件下，使用TaqMan miRNA分析（Applied Biosystems）分析成熟miRNA的表达。简单地说，使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems），从5 ng总RNA在15μl反应体积内合成单链cDNA。反应首先在16°C下培养30分钟，然后在42°C下培育30分钟，再在85°C下孵育5分钟使其失活。使用Applied Biosystems 7900HT序列检测系统上TaqMan microRNA分析的序列特异性引物，通过定量PCR扩增产生的每个cDNA。每个20μl PCR包括10μl的2×通用PCR主混合物（不含AmpErase UNG）、1μl的20×TaqMan microRNA分析混合物和2μl的反转录产物。反应在95°C的384孔板中培养10分钟，然后在95°C40个循环中培养15秒，在60°C中培养1分钟。
细胞转染
对于瞬时转染，细胞在转染前24小时以50%的合流率进行电镀。分别使用FuGENE6转染试剂（Roche Applied Science）或Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）进行质粒和miRNA模拟转染。
慢病毒转导与稳定细胞系的建立
使用FuGENE6转染试剂（Roche Applied Science）将慢病毒载体和包装载体转染到包装细胞系293T（ATCC）。转染后8小时更换培养基，48小时后收集含有慢病毒的培养基。肿瘤细胞在8μg/ml Polybrene（Sigma）存在下感染慢病毒。
报告人分析
将细胞接种在24孔板上，并使用FuGENE6转染试剂用0.125μg报告载体和0.25μg miRNA表达质粒转染。或者，采用如下顺序转染方法。30牛顿米使用Lipofectamine RNAiMAX转染miRNA模拟物；转染24小时后，使用FuGENE6转染试剂转染0.125μg报告载体。在这两种情况下，报告载体转染48小时后，收集细胞，并根据制造商的说明使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行报告分析。用Fluoroskan Ascent FL荧光计（Thermo Fisher Scientific）测量报告者的活动。
免疫组织化学与共聚焦成像
切片依次在5%的正常血清、1:500稀释的兔抗LIN28抗体（4°C）和1:150稀释的Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（Invitrogen）中在室温下孵育1.5小时。切片用DAPI（Vector）复染。使用Axiovert 200 M倒置显微镜（蔡司）收集图像。
类胚体（EB）形成分析
将未分化的ES细胞胰蛋白酶化，并在不含小鼠白血病抑制因子的ES细胞培养基中重新悬浮。将ES细胞悬液应用于明胶涂层培养皿中，并在37°C下培养40分钟，以去除小鼠胚胎成纤维细胞。收集ES细胞并将其重新悬浮在不含小鼠白血病抑制因子的ES细胞培养基中。悬浮培养，1×106细胞放置在100毫米的培养皿中，每2天更换一次培养基。
let-7响应传感器的构建和转染
miRNA反应传感器是一种监测miRNA活性的技术，用于检测let-7小鼠胚胎中的表达体内在乳腺上皮祖细胞中在体外传感器包含一个组成表达的报告序列，该报告序列与let-7在报告基因的3′-UTR下游区域。在用传感器转染的培养细胞中，当let-7在场。因此let-7-响应传感器能够监测let-7实时活动。这个let-7传感器是通过引入两份第7b列到3′-UTR区域的完全补码序列雷尼利亚psiCheck 2载体（Promega）中的荧光素酶基因。这个let-7-互补寡核苷酸（正义，TCG AGA ACC ACA CAA CCT ACC TCA GGA TCC AAC CAC ACC TAC TAC CTC AGC；反义，GGC CGC TGA GGT AGT AGG TTG TGT TGG ATC CTG AGG TAG GTT GTG TGG TTC）从IDT购买，并在含有100 m的缓冲液中退火米醋酸钾，30 m米HEPES-KOH，pH 7.4，2 m米醋酸镁。将A2780细胞接种在6孔板中，并在转染前培养过夜至40%汇合。要测试let-7活性，使用FuGENE6转染试剂（Roche Applied Science）将总计1μg的感测载体导入细胞。所有转染实验均一式三份，并至少重复两次。根据制造商的说明，使用Fluoroskan Ascent FL荧光仪（Thermo Fisher Scientific），使用双荧光素酶报告分析系统（Promega），在转染48小时后进行荧光素素酶分析。
统计
使用SPSS统计软件包（SPSS，芝加哥，IL）进行统计分析。所有结果均以平均值±S.D.表示，在第页< 0.05.
结果
结合硅胶预测和miRNA文库筛选方法鉴定靶向LIN28的miRNA
的表达式第28行高度局限于ES细胞、体祖细胞和发育中的组织，但在大多数成人器官中无法检测到(2，4，5，8，14，27，–29). 然而，第28行在人类癌症中显著上调/重新激活(30，–35). 之间有一个双负调节回路第28行和miRNAlet-7(7，8，20，–26). 识别miRNAs调节林28，我们的初始筛选是在一个包含四个特征明确的癌细胞株的平台上进行的，其中两个（A2780和T47D）高表达内源性LIN28，其中两种（MCF7和HeLa）为LIN28阴性(A类). 与以前的报告一致(7，8，20，–26)、级别let-7在LIN28阳性细胞系中，其水平显著低于LIN28阴性细胞系中的水平(B类).
A组合生物信息学预测和miRNA文库筛选方法确定miRNAs靶向第28行. A类用Western blots检测四种实验筛选的癌细胞株中内源性LIN28的表达。其中两个（A2780和T47D）为LIN28阳性，两个（MCF7和HeLa）为LIN28-阴性。B类，采用实时RT-PCR检测第7b列在这些细胞系中表达。正如预期的那样，LIN28负线表达了相对较高的let-7b。C类，筛选分析中使用的miRNA表达载体和报告载体的说明。赞成.，启动子；卢克（hRluc），雷尼利亚荧光素酶；赫鲁克，萤火虫荧光素酶。D类，已知的第28行-调节性miRNAlet-7用于试点筛选。与第7b列表达载体显著（*，第页<0.05）降低了第28行两个LIN28阴性细胞系中的3′-UTR报告载体。E类，的示意结构第28行信使核糖核酸。通过TargetScan预测miRNA结合位点。UTR公司，非翻译区；ORF公司，打开阅读框；E类，外显子。F类，四种细胞系中miRNA文库筛选的汇总热图。这里列出了miRNAs左边到正确的根据他们的预测得分（从高到低）。9个miRNAs（标记于绿色)显著降低了所有四种癌细胞系的报告活性。G公司慢病毒感染产生了稳定的细胞系，这些细胞系过度表达了这九种miRNA以及五种miRNA对照物，但没有降低荧光素酶活性。九个候选miRNAs中的三个(mir-30型，mir-125型、和mir-9)显著减少两者第28行mRNA和蛋白表达。
全基因组miRNA文库筛选已成功用于鉴定调节某些蛋白质编码基因的miRNA(58，59). 由于该方法耗时费力，我们设计了一种生物信息学驱动的筛选方法，其中通过miRNA结合位点预测生成一个浓缩的miRNA文库(即我们将生物信息学用于miRNA靶点预测，作为一个过滤器，生成一个限制/选择的miRNA库，在其上进行功能筛选）。这使我们能够在联合转染系统中进行实验筛选，其中荧光素酶报告子与前miRNA-表达载体联合转染(C类). 报告载体包含全长人类第28行3′-UTR序列，克隆于报告基因下游雷尼利亚(卢克（hRluc）)，因此报告基因的表达受第28行3′-UTR。萤火虫荧光素酶(赫鲁克)记者担任转染效率的内部控制(C类). 为了测试我们的筛选系统，我们首先选择了miRNAlet-7，一种已知的miRNAs调节第28行如预期，let-7在LIN28阴性细胞系中，萤光素酶活性显著降低，但在LIN28阳性细胞系中没有，在LIN28阳性细胞系中，miRNA前成熟被内源性阻断第28行(D类).
接下来，我们预测了人类3′-UTR中的miRNA结合位点第28行使用生物信息学miRNA靶预测程序TargetScan的基因（可在万维网上获得）(60). 共鉴定出23个在脊椎动物中广泛保守的潜在miRNA结合位点(E类). 上述miRNA的单个miRNA表达载体选自我们的全基因组miRNA文库。在癌细胞系中对每种载体进行了一次初步转染，并通过RT-PCR证实了miRNA的强制表达（数据未显示）。未有效表达的miRNA载体被排除在联合转染筛选之外。最后，共有17个miRNA被成功用于所有四种细胞系的功能筛选。简言之，这些miRNAs中有九个显著降低了所有四种细胞系中的荧光素酶活性（标记为绿色在里面F类). 为了进一步测试这9个候选miRNAs是否导致内源性第28行，我们生成了稳定的细胞系，分别过度表达这九个miRNA中的每一个，以及稳定的细胞株，表达五个miRNA（作为对照），但不降低荧光素酶活性。我们发现九个候选miRNAs中有三个(mir-30型，mir-125型、和mir-9)显著减少两者林28mRNA和蛋白质表达(G公司). 两个miRNAs的直接调控第28行3′-UTR(mir-9和mir-30型（在我们的研究中首次发现）被一个突变体证实第28行3′-UTR报告分析(). 的播种顺序mir-9或mir-30型在中第28行3′-UTR突变米-9或mir-30型显示在野生型中显著降低荧光素酶活性，但在结合位点突变体中没有第28行3′-UTR记者。尽管mir-18型降低第28行表达水平与mir-30型(G公司)，过度表达18岁以下儿童不能降低野生型和结合位点突变体中的荧光素酶活性第28行A2780和HeLa细胞中的3′-UTR报告者（数据未显示）。总共有四个miRNAs，let-7，mir-30型，mir-125型、和mir-9，在我们的初步筛选中确定。重要的是，已知两种miRNAs可以调节第28行哺乳动物(let-7和mir-125型) (7，61)使用我们的方法成功识别。
第28行-的调节功能mir-9和mir-30型通过3′-UTR报告分析验证。A类，的示意图mir-125型，let-7，mir-30型、和mir-9中的结合位点第28行3′-UTR。播种顺序（标记在灰色)在不同物种之间广泛保守。Hsa公司，人类；Ptr公司黑猩猩；嗯恒河猴；嗯，鼠标；雷诺数，大鼠；首席执行官，清管器；奥库，兔子；欧盟、刺猬；Cfa公司，狗；经济合作署，马；Bta公司，奶牛；D编号，armadillo；拉夫，大象；姆多，负鼠。B类和C类，报告人对野生型和mir-9结合位点突变报告子(B类)和mir-30型结合位点突变报告基因(C类)在A2780（LIN28阳性）和HeLa（LIN28阴性）细胞中。重量，野生型第28行3′-UTR记者；多个9，米-9结合位点突变体第28行3′-UTR记者；30英里，mir-30型结合位点突变体第28行3′-UTR记者。的过度表达米-9或mir-30型能够显著（*，第页<0.05）降低野生型荧光素酶活性，但不降低结合位点突变第28行3′-UTR记者。
miRNAs调节未分化ES细胞的Lin28
接下来，我们研究了在癌细胞系中发现的上述miRNAs是否能够调节第28行在生理条件下表达，例如在未分化的ES细胞中。为了解决这个问题，我们瞬时转染小鼠ES细胞株R1，模拟let-7，密尔-125，mir-9、和反光镜-30和控制模拟。在转染后24和48小时，收集总RNA和蛋白质第28行通过RT-PCR和Western blots检测表达。我们发现两者的表达第28行与对照转染相比，miRNA模拟物转染细胞的蛋白质和mRNA显著降低(，A类和B类). 对于两个miRNAs(mir-9和mir-30型)最初确定为第28行在本研究中，我们还通过免疫组化染色证实了蛋白的表达和定位。与Western blot结果一致米-9和mir-30型导致内源性第28行在ES细胞中，但它们对第28行在这些细胞中(C类).
miRNAs调节第28行在未分化的ES细胞中。miRNA模拟（30 n米)第页，共页let-7，mir-125型，mir-9，mir-30型，并将对照模拟物瞬时转染到小鼠ES细胞株R1中。在转染后24和48小时，收集总RNA和蛋白质第28行通过实时RT-PCR检测表达(A类)和蛋白质斑点(B类).A类，的第28行mRNA表达显著（*，第页与对照转染相比，转染miRNA模拟物的细胞数量减少。B类，与对照转染相比，用miRNA模拟物转染的细胞中的Lin28蛋白表达显著降低。C类，免疫组化染色进一步证实mir-9和mir-30型ES细胞中LIN28表达降低。
最后，我们问四个miRNA家族对第28行表达是累积的，或者在胚胎干细胞分化过程中，一个miRNA的作用优于其他miRNA。我们将每个miRNA以及所有四个miRNA的组合转染未分化的ES细胞。我们发现了mir-125型更有效地抑制第28行与其他三种miRNA的表达比较(补充图S1A类)所有四种miRNAs的联合转染在抑制第28行表达式为mir-125型独自一人(补充图S1A). 系列联合转染进一步证明mir-125型确实是联合转染中的主要功能miRNAmir-125型在上占主导地位第28行当这些miRNA在ES细胞中以等浓度存在时的表达(补充图S1B类). 然而，ES细胞分化过程中成熟miRNA的表达水平将是影响ES细胞分化的另一个重要因素第28行表达式。为了解决这个问题，我们检索了之前发表的小RNA文库在胚胎干细胞分化过程中通过深度测序获得的miRNA分析数据(62). 在分化的ES细胞中，mir-125a/b产生1557个序列读取，并且let-7a/b/c/d/e/f/g/i，mir-9、和mir-30a/b/c/d/e分别产生669、2和4284个序列读取(补充图S1C类). 我们将上述比例的四种miRNA转染到未分化的ES细胞中，其中四种miRNAs均不存在。我们始终发现mir-125型在抑制内源性方面最有效第28行表达式(补充图S1D类). 根据上述结果，我们得出结论：mir-125型家族是最主要的miRNA调节第28行ES细胞分化过程中的表达let-7和mir-30型家庭也可能在抑制第28行在分化早期表达。由于miRNA模拟物的转染只会暂时影响miRNA的表达，因此在胚胎干细胞分化的整个过程中很难控制miRNA的水平。因此，为了在ES细胞分化的后期解决同样的问题，我们从ES细胞分化研究中检索了三个已发表的miRNA图谱数据集(63，–65). 我们发现在ES细胞分化过程中，let-7在大多数体细胞祖细胞中普遍上调/表达，而其他三种miRNA可能是组织类型特异性的。例如在ES细胞向神经元分化的过程中，let-7显著上调，并且mir-9也显著增加(63，–65). 这表明在胚胎干细胞的晚期分化阶段，这四种miRNAs可能在不同的组织谱系中发挥不同的功能，其中一种或两种可能在抑制第28行表达。
ES细胞分化过程中LIN28及其调控miRNAs的表达水平呈负相关
的表达式第28行高度局限于ES细胞和发育中的组织，随着分化的进行，其表达显著降低(2，4，5，8，14，27，–29). 因此，我们研究了林28其调节性miRNAs在ES细胞分化过程中发生动态变化。ES细胞通常分化在体外通过在悬浮培养物中自发地自我组装成三维细胞聚集物（称为EB），EB模拟了早期胚胎发育的许多特征。我们选择了两个小鼠ES细胞系（R1和C57）并诱导其分化和形成EB(A类). 通过实时RT-PCR监测EB形成期间（第0-18天）的生殖层标记物表达模式(B类)，以及的表达式第28行通过实时RT-PCR和Western blots检测。第28行在ES分化和EB形成的第6天，mRNA水平显著降低(C类)、和第28行分化第6-8天蛋白质表达降低(，D类和E类). 为了检测EB形成过程中miRNA的整体表达变化，使用了含有381个miRNA探针的低密度TaqMan分析(F类). 有趣的是，无监督聚类分析表明上述四个miRNA家族(let-7，mir-125型，mir-9、和mir-30型)我们的筛选结果表明，它们聚集在同一组中，并具有相似的表达模式(F类，蓝色星团). 重要的是，它们的表达水平在未分化的ES细胞中几乎无法检测到，并且从第6天开始显著增加，同时第28行表达降低。在分化的EB细胞中，它们的表达水平保持较高(，F类和G公司). 这一高通量结果通过两个ES细胞系的实时RT-PCR分析得到了进一步验证(H（H）). 总之，在ES细胞分化和EB形成过程中第28行减少，而其调节性miRNAs(let-7，密尔-125，mir-9、和mir-30型)显示负相关的表达模式。这一结果强烈表明，这四种miRNAs在第28行在早期发育等生理条件下的调节。
的表达式级别第28行其调节性miRNA在ES细胞分化过程中呈负相关。 A类，ES细胞分化在体外通过在悬浮培养中自发地自组装成三维细胞聚集体（EB）。免疫染色显示Lin28在未分化的ES细胞中高表达。B类实时RT-PCR监测分化和EB形成过程中的多能性和分化标记。C类，第28行实时RT-PCR分析EB形成过程中mRNA的表达。D类和E类用Western blots分析EB形成过程中Lin28蛋白的表达。F类，使用TaqMan miRNA分析分析EB形成期间的全球miRNA表达谱。一项无监督的聚类分析表明第28行-调节性miRNAs聚集在一起。G公司，通过TaqMan miRNA分析确定EB形成期间miRNA表达的详细变化。所有四个林28-从EB形成的第6天起，调节性miRNAs显著上调。H（H），两个ES细胞系中TaqMan miRNA分析的实时RT-PCR验证。
LIN28阳性肿瘤细胞系中LIN28调节性miRNAs在全球范围内下调
第28行也被认为是一种在5-15%的人类肿瘤中上调/重新激活的癌基因(30，–37). 我们检查了第28行-这些肿瘤中的miRNAs调控也被解除。首先我们重新分析了包含218个样本的公开可用的miRNA数据集（正常对照组织，n个= 46; 肿瘤，n个= 172) (66)，我们成功地从这四个基因中检索到16个miRNAs第28行-调节性miRNA家族。有趣的是，我们发现这16种miRNAs中有11种在人类肿瘤中显著下调（降低超过20%）(，A类和B类). 这表明第28行-癌症中的miRNAs调控被解除。为了提供进一步的实验证据，我们选择了两个高表达第28行以及17种癌细胞系第28行蛋白质无法检测(C类). 的表达式林28-通过实时RT-PCR分析这些细胞系中的调节性miRNAs。如所示C类，所有四个miRNA家族(let-7，mir-9，mir-30型、和mir-125型)与LIN28阴性株相比，LIN28阳性株的表达水平较低。负相关第28行抑制miRNA的表达表明，这些miRNA的全局放松调控可能是致癌的重要机制第28行人类癌症中的上调/再激活。
林28-调节性miRNAs在全球范围内下调第28行-阳性癌细胞株。A类，从Broad Institute检索到一个公开的miRNA微阵列数据集(66). miRNAs调节的正常表达水平第28行分析并显示为热图。我们发现16个中有11个第28行-调节性miRNAs（标记于绿色)与正常对照组织相比，人类肿瘤中的表达显著下调（降低20%以上）。B类，miRNAs调节的平均表达水平总结第28行在公共miRNA微阵列数据集的正常和肿瘤标本中。C类，通过蛋白质印迹检测19个人类癌细胞系中的LIN28蛋白水平。其中两个细胞系（10.5%）为LIN28阳性。这个第28行-通过实时RT-PCR分析这19个细胞系中调节性miRNA的表达水平。所示为LIN28阳性株系中每个单个miRNA的平均表达摘要(绿色)和LIN28-负极线(白色).
接下来，我们测试了miRNA抑制剂是否能够拯救/上调内源性第28行在肿瘤细胞中表达。我们将每个miRNA抑制剂和这些抑制剂的组合以及对照寡核苷酸转染到LIN28-阳性（T47D）和LIN28-阴性（HeLa）细胞系。我们发现，在LIN28阳性细胞系T47D中，所有四种抑制剂，无论是单独使用还是组合使用，都能够增加LIN28蛋白的表达。然而，在LIN28阴性细胞系HeLa中，这些激活的LIN28表达均未达到可检测水平(补充图S2). 阻断所有四个miRNAs并没有激活内源性第28行在LIN28阴性肿瘤细胞中表达。这表明沉默第28行在成人组织中可能由多种机制控制，而不仅仅是通过miRNA抑制。在LIN28阳性肿瘤中，可能至少有两种第28行-抑制不起作用的途径(例如miRNA抑制和表观遗传沉默）。
miRNAs调控LIN28介导的let-7表达
我们的发现提出了一种新的调节机制，其中一种miRNA可能通过蛋白质编码基因间接调节另一种miRNA；例如，mir-125型，mir-9、和mir-30型可以调节let-7通过抑制表达第28行表达式。为了验证这个假设，我们转染了mir-9和mir-125型模拟成LIN28阳性细胞系（T47D）。正如预期的那样mir-9和mir-125型内源性显著降低林28实时RT-PCR检测到的表达(A类). 然后我们检查了内源性第7b列实时RT-PCR表达。如所示B类，两者都是mir-9和mir-125型显著增加第7b列在T47D细胞中表达。重要的是，当我们转染mir-9或密尔-125在LIN28-阴性细胞系（MCF7）中第7b列表达水平没有受到影响(B类). 最后，为了监控let-7活动，alet-7传感器(C类)与米-9和mir-125型模仿。如所示D类，mir-9和mir-125型显著降低荧光素酶活性let-7T47D细胞中的传感器，表明内源性let-7活动增加了mir-9和mir-125型模仿。在LIN28阴性株MCF7中，模拟转染始终没有改变let-7传感器。综上所述，我们的结果显示了一种新的调控机制，其中第28行-调节性miRNAs调节let-7蛋白质编码基因的表达和活性第28行.
miRNAs调节let-7由介导的表达林28. A类，转染mir-9和mir-125型显著模仿（*，第页<0.05）减少林28T47D细胞中的mRNA表达。B类，转染mir-9和密尔-125显著模仿（*，第页<0.05）增加第7b列在LIN28阳性细胞系T47D中表达，但在LIN28阴性细胞系MCF7中不表达。C类，一种miRNA响应传感器，一种监测miRNA活性的技术，带有与第7b列在组成性表达的报告基因的3′-UTR的下游区域。D类，转染mir-9和mir-125型显著模仿（*，第页<0.05）降低了第7b列-LIN28-阳性细胞系T47D中的响应传感器，但LIN28-阴性细胞系MCF7中没有响应传感器。
讨论
据估计，人类基因组包含约1000个miRNAs(67)，根据最新版本的miRBase，其中900多个已经被鉴定。据预测，miRNAs可靶向多达三分之一的人类mRNAs(60). 每个miRNA可以针对数百个转录物(68，–71)和蛋白质(70，71)直接或间接，并且多个miRNA可以聚合到单个转录目标上(72). 因此，miRNA提供的潜在调节电路是巨大的，但识别miRNA调节蛋白编码基因仍然具有挑战性。生物信息学预测方法和全基因组遗传筛选都被用来表征miRNA靶点(58，59). 在这里，使用组合方法，我们成功地鉴定了四个miRNA家族，包括两个新鉴定的家族(mir-9和mir-30型)，用于调节第28行在ES细胞和癌细胞中表达。然而，与对其他蛋白质编码基因进行miRNA文库筛选时获得的结果类似(58，59)，许多人预测林28-调节性miRNAs对内源性第28行表达式。例如，使用全基因组miRNA库Sage等。(58)报告说只有mir-221/mir-222家庭管理的第27页基普1和Nagel等。(59)还发现只有米-135家庭被压制空气污染指数表达式。这表明蛋白质编码基因可能受比先前认为的更少数量的miRNAs调控。然而，在这项研究中，我们只包括了被预测与第28行3′-UTR在我们的筛查中。因此，其他miRNAs可能会靶向第28行。我们研究中确定的所有四个miRNA家族都包含多个成员(例如人类let-7家庭成员12人；这个mir-125型家庭和米-9每个家庭有三个成员；和mir-30型家里有六个人）(). 这些家族位于不同的染色体位置，表明它们的表达受不同的5′-UTR调控序列和转录因子的调控。此外，几个第28行-调节性miRNA位于相同的基因组位点并聚集在一起(例如let-7e和mir-125a型位于相同的基因组位点mir-30b型和mir-30天) (). 这表明它们可能由同一个初级miRNA转录物加工而成，并能协调调节第28行表达式。因此，这四个miRNA家族（至少24个成员）在第28行是广泛而复杂的。
表2
人类LIN28调节性miRNAs的基因组定位和组织
| miRNA名称 | 集群 | 基因组定位 |
|---|
| mir-30e型 | mir-30e型和mir-30c-1型 | 1: 41220027–41220118 (+) |
| mir-30c-1型 | mir-30c-1型和mir-30e型 | 1: 41222956–41223044 (+) |
| mir-30c-2型 | | 6: 72086663–72086734 (−) |
| mir-30天 | mir-30b型和mir-30天 | 8: 135817119–135817188 (−) |
| mir-30a型 | | 6: 72113254–72113324 (−) |
| mir-30b型 | mir-30b型和镜子-30d | 8: 135812763–135812850 (−) |
| let-7a-1 | let-7a-1，let-7f-1号机组、和let-7d | 9: 96938239–96938318 (+) |
| let-7a-2 | mir-100型和let-7a-2 | 11: 122017230–122017301 (−) |
| let-7a-3号机组 | let-7a-3号机组和第7b列 | 22: 46508629–46508702 (+) |
| 第7b列 | let-7a-3号机组和第7b列 | 22: 46509566–46509648 (+) |
| 第7c列 | mir-99a型和let-7c | 21: 17912148–17912231 (+) |
| let-7d | let-7a-1，let-7f-1号机组、和let-7d | 9: 96941116–96941202 (+) |
| let-7e | mir-99b、let-7e和mir-125a | 19:52196039–52196117（+） |
| let-7f-1号机组 | let-7a-1，let-7f-1号机组、和let-7d | 9: 96938629–96938715 (+) |
| let-7f-2号机组 | let-7f-2号机组和mir-98型 | 十： 53584153–53584235（−） |
| let-7g | | 3: 52302294–52302377 (−) |
| 第7列 | | 12: 62997466–62997549 (+) |
| mir-98型 | let-7f-2号机组和mir-98型 | 十： 53583184–53583302（−） |
| mir-125a型 | mir-99b型，let-7e、和mir-125a型 | 19: 52196507–52196592 (+) |
| mir-125b-1型 | | 11: 121970465–121970552 (−) |
| mir-125b-2型 | | 21:17962557–17962645（+） |
| mir-9-1型 | | 1: 156390133–156390221 (−) |
| mir-9-2型 | | 5: 87962671–87962757 (−) |
| mir-9-3型 | | 15: 89911248–89911337 (+) |
的表达式第28行高度局限于ES细胞和发育中的组织，并随着分化的进行而显著减少(2，4，5，8，14，27，–29). 我们发现，在未分化的ES细胞以及EB形成和分化的前6天，我们在本研究中确定的所有四个miRNA家族的表达几乎无法检测到。在此时间窗口内，第28行表达水平极高。从EB形成的第6天开始，所有四个第28行-调节性miRNA家族的表达显著增加，而两者第28行mRNA和蛋白质水平开始急剧下降(和). 这种负相关的表达模式表明，这些miRNAs可能在抑制第28行在发育和分化过程中的表达。在大多数成人组织中，第28行几乎完全沉默；然而，这四种miRNAs在高水平表达(A类和). 有趣的是，其中一些miRNA(例如mir-9)似乎是组织特异性的，而其中一些(例如mir-30)几乎在所有成人组织中表达。这表明存在一个复杂的miRNAs时空调控网络，影响第28行在生理条件下表达。最后，考虑到这一点第28行可以与一起作为重编程因素华侨城4号，SOX2标准、和NANOG公司将体细胞重新编程为诱导的多能干细胞(19)，出现了是否共同转染第28行-带有这些重编程因子的miRNA调节抑制剂可以提高重编程效率(). 支持这个假设，梅尔顿等。(73)最近有报道称let-7促进体细胞去分化为诱导的多能干细胞。
提供的调节电路第28行-发育和肿瘤发生中的调节性miRNAs。
在人类癌症中，第28行在大约5-15%的患者中上调/重新激活，并作为癌基因发挥作用(30，–37). 有趣的是，我们发现这四个第28行-调节性miRNA在肿瘤中整体下调(和)可能是由于这些miRNAs的遗传和/或基因组改变或其生物发生途径的放松调控(66). 值得注意的是，与LIN28阴性肿瘤细胞系相比，在LIN28阳性肿瘤细胞系中，这些miRNAs的表达水平相对较低。因此，下调第28行-调节性miRNAs可能是第28行人类癌症的再激活(C类). 最近的研究表明第28行作为促进恶性转化和肿瘤生长的癌基因(30，–37). 重要的是，林28可能有助于维持肿瘤干细胞，这是一种相对罕见的肿瘤细胞亚群，具有启动和维持肿瘤生长的独特能力(34). 迅速积累的证据表明，miRNAs参与了癌症的发生和发展(66，74，–80). 有趣的是，其中两个第28行-调节性miRNAs(let-7和mir-125型)已被证明是肿瘤抑制基因。例如let-7Slack实验室首次证实了癌症(76). 据发现let-7家庭负调控let-60/RAS输入秀丽线虫通过绑定到多个let-7-其3′-UTR中的互补位点(76). 此外，发现let-7研究表明，肺肿瘤中RAS蛋白的表达低于正常肺组织，而RAS蛋白在肺肿瘤中的表达明显高于正常肺组织let-7作为一种抑癌基因(76，81，–84). 因此，我们的研究可能会为癌症治疗带来新的治疗策略(). 例如，纳米颗粒输送第28行-调节性miRNA模拟物可能是靶向肿瘤中LIN28阳性肿瘤干细胞群的一种有吸引力的治疗方法。
*这项工作得到了NCI国立卫生研究院、Grant R01CA142776和卵巢癌SPORE P50-CA83638-7951项目3的全部或部分支持。这项工作还得到了乳腺癌联盟、卵巢癌研究基金会（Liz Tilberis学者）、玛丽·凯·阿什慈善基金会以及美国国防部拨款W81XWH-10-1-0082的部分支持。
本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图S1和S2.
2使用的缩写如下：
- 锿
- 胚胎干
- 微小RNA
- 微小RNA
- UTR公司
- 非翻译区域
- 电子束
- 胚状体。
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