投资眼科视觉科学。2010年9月；51(9): 4437–4446.
铁蛋白亚单位组成改变：晶状体上皮细胞铁代谢的变化及下游对谷胱甘肽水平和VEGF分泌的影响
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吉尔·哈内德
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
珍妮·费雷尔
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
玛丽莲·M·拉尔
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
劳埃德·N·弗利舍
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗来纳州立大学分子生物医学科学系。
史蒂文·纳加尔
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
马乌戈扎塔·戈拉尔斯卡
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
M.克里斯汀·麦卡汉
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
来自北卡罗来纳州罗利市北卡罗莱纳州立大学分子生物医学科学系。
通讯作者。 通讯作者：M.Christine McGahan，北卡罗来纳州立大学分子生物医学科学系，地址：4700 Hillsborough Street，Raleigh，NC 27606；ude.uscn@nahagcm_sirhc. 2009年4月14日收到；2009年7月23日修订；2010年2月26日修订；2010年3月18日接受。
铁蛋白亚基组成具有细胞类型特异性，并控制细胞中的铁代谢。在这项研究中，晶状体上皮细胞亚单位组成的改变对依赖铁代谢的细胞内稳态机制产生了深远的影响。
摘要
目的。
铁存储蛋白铁蛋白对于铁的安全存储和防止产生铁催化氧化损伤是必要的。铁蛋白由两种类型的24个亚基组成：重（H）和轻（L）。这些亚基的比率是组织特异性的，改变这种比率可以对铁的储存和可用性产生深远的影响。在本研究中，使用每条链的siRNA来改变铁蛋白H:L链比率，并确定这些变化对铁蛋白合成、铁代谢的影响，以及对犬晶状体上皮细胞铁反应途径的下游影响。
方法。
采用犬晶状体上皮细胞原代培养。用定制的狗铁蛋白H链和L链siRNA转染细胞。通过标记新合成的铁蛋白链来确定从头合成铁蛋白35S-蛋氨酸、免疫沉淀和SDS-PAGE分离。通过培养细胞，测量细胞对铁的吸收和铁蛋白的结合59铁标记的转铁蛋白。用Western blot分析确定转铁蛋白受体的存在，用ELISA测定总铁蛋白浓度。用免疫荧光标记法测定细胞中铁蛋白的定位。测量VEGF、谷胱甘肽分泌水平和胱氨酸摄取。
结果。
FHsiRNA减少铁蛋白H链合成，但使铁蛋白L链合成加倍。FLsiRNA降低了铁蛋白H链和L链的合成。两种siRNA均阻断了铁蛋白H链的降解，而只有FHsiRNA阻断了铁素L链的降解。这种过量的铁蛋白L链存在于包涵体中，其中一些包涵体与溶酶体共定位。FHsiRNA大大降低了铁蛋白中的铁储存量，从而提高了铁的利用率，转铁蛋白受体水平和转铁蛋白对铁的摄取量都有所下降。铁有效性的增加也增加了胱氨酸的摄取和谷胱甘肽的浓度，并减少了缺氧诱导因子1-α和血管内皮生长因子（VEGF）在细胞条件培养基中的核转位积累。
结论。
用特异性siRNA改变铁蛋白H:L比率的大多数影响是由于不稳定池中铁的可用性发生变化。它们导致培养的晶状体上皮细胞中铁的摄取和储存、铁蛋白的合成和降解速率、VEGF的分泌以及谷胱甘肽水平发生显著变化。这些深刻的影响清楚地表明，维持特定的H:L比率是基本细胞内环境平衡机制的一部分。
铁蛋白是一种多聚铁存储蛋白，由两种类型的24个亚基组成：重（H）和轻（L）。这两条链的比例是组织特异性的，控制着铁的储存和可用性。1铁蛋白H和L链的表达在转录2和翻译水平。三此外，细胞可以通过每条链的不同降解和分泌速率来调节H:L比率。4,5
通过诱导每个链的过度表达和低表达（siRNA敲除），研究了铁蛋白H链和L链的作用以及H:L比率的改变对铁储存和生理病理过程的影响。在培养的红细胞和晶状体上皮细胞（LECs）中，H链铁蛋白的过度表达降低了细胞溶质不稳定铁池（LIP；被认为是细胞溶质中的有效铁池），增加了铁蛋白中的铁结合，并增加了细胞对氧化应激和紫外线照射的抵抗力。6——8此外，用siRNA改变H:L比率对HeLa细胞中铁的有效性有显著影响。铁蛋白L链siRNA（FLsiRNA）使L链水平降低80%，但对H链水平或任何指示铁可用性的参数没有影响。另一方面，铁蛋白H链siRNA（FHsiRNA）使H链水平降低75%，使L链水平增加三倍。FHsiRNA还增加铁的可用性，降低对过氧化氢诱导的氧化应激的抵抗力。9
我们最近发现，狗和人晶状体纤维细胞中的铁蛋白链发生了显著的改变，并且这些改变随着年龄的增长而增加。10虽然这些修饰如何影响整个铁蛋白分子的组装尚不清楚，但它们很可能影响铁蛋白的铁储存能力。这些变化可能通过异常链的聚集或增加无法安全储存的活性铁的可用性而导致白内障的发生。
铁蛋白链除了安全储存潜在活性铁外，还有其他生理作用。例如，siRNA敲除表明H链铁蛋白有助于恶性间皮瘤细胞对凋亡的抵抗11L-链铁蛋白在铁依赖性细胞增殖中发挥作用。9
事实上，铁的生理作用是多种多样的，最近发现了新的活性()例如调节缺氧诱导因子（HIF）-1的水平，12,13一种调节许多基因的转录因子，包括血管内皮生长因子（VEGF），14,15它是由透镜制成的。16我们最近发现，铁控制了两个LEC中的VEGF分泌（McGahan MC等。爱荷华州2007年；48：ARVO E-Abstract 2436）和视网膜色素上皮（RPE）细胞（Ferrell J，Harned J，未发表数据，2008）。此外，铁控制LEC、RPE细胞和神经元中谷氨酸的合成和分泌。17铁调节的谷氨酸分泌对胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白对胱胺酸的摄取以及这些细胞中谷胱甘肽（GSH）的水平具有下游影响。18
本研究的目的是用siRNA改变每个铁蛋白链的铁蛋白H:L比率，并确定这些变化如何影响铁的储存和可用性、铁蛋白水平（包括其合成和降解动力学）、胱氨酸摄取、谷胱甘肽水平、HIF-1α转位到细胞核以及内皮细胞中血管内皮生长因子的产生。
方法
组织培养
狗在安乐死后从约翰斯顿县动物收容所（北卡罗来纳州）获得。摘除眼睛，将晶状体前囊从晶状体上剥离，置于含有10%胎牛血清（Hyclone，Logan，UT）和1%抗生素抗真菌（Mediatech，Manassas，VA）的DMEM（Invitrogen，Carlsbad，CA）中100 mm组织培养板上。LEC被种植到汇合处，然后播种到六孔板上进行实验。
siRNA转染
Dharmacon RNA Technologies（Lafayette，CO）利用本实验室测定的犬铁蛋白序列设计并生产了犬铁蛋白H链和L链（分别为SMARTpools，M-010264-00和M-040576-00）的定制siRNA。7Dharmacon siRNA设计利用创新策略来最佳地减少脱靶效应，包括基于生物信息学分析的先进合理设计、双链体的汇集，以及对正链和反义链的独特化学修饰，以增强siRNA的特异性。此外，FLsiRNA包括修饰试剂（On-TARGET Plus；Dharmacon），以最小化种子区域相关mRNA的非靶向沉默。
将细胞以90000至105000/孔的密度接种在DMEM+10%胎牛血清的六孔板上，并在37°C下孵育过夜，通常达到40%至50%的融合。对照非靶向siRNA池（Dharmacon）与每个平板上的铁蛋白H-和L-siRNA（FH-和FLsiRNA）一起转染，以解释任何非序列特异性细胞反应。根据制造商的协议，在无血清DMEM中形成亲脂转染试剂（0.93μL/mL，Lipofectamine 2000；Invitrogen）siRNA复合物，并以100 nM siRNA的最终浓度添加到每个孔中。过夜培养后，用适当的培养基替换转染培养基，这取决于接下来的具体治疗。在每次实验中监测从头合成铁蛋白链，以确认击倒。
逆转录和定量实时PCR
根据制造商的方案，用CTL、FH或FLsiRNA（RNeasy试剂盒和Qiashredders；Qiagen，Valencia CA）转染24小时后，从培养的LEC中提取总RNA。将四个3.5-cm微孔的细胞裂解液组合用于RNA提取。使用分光光度计（NanoDrop Technologies，德国威明顿）对RNA样品进行定量，并使用寡核苷酸dT引物和转录系统（ImProm-II逆转录系统；威斯康星州麦迪逊市Promega）对每个样品中的1.0μg RNA进行反转录。在热循环器（iCycler-iQ；Bio-Read Laboratories，Hercules，CA）中对主混合液（PowerSYBR Green；Applied Biosystems[ABI]，Foster City，CA）进行实时PCR。以0.3μM的浓度使用以下引物：FH上游引物，5′-CGATGTGGTGGCTTGAAGA-3′；FH下游引物，5′-AAGATCGACCCTCGTTG-3′；FL上游引物，5′-AAACCGTCCCAAGATGAGTG-3′；FL下游引物，5′-TGGTTCTCCAGGAAGTCACA-3′。一式两份，25μL反应含有5μL模板，对应于0.5%或0.05%的RT产物。我们先前克隆到哺乳动物表达载体（pTargeT；Promega）中的铁蛋白轻和重cDNA的编码序列7切除（ECoRI，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化；Qiagen）并用于生成标准曲线。热循环系统软件用于分析数据（3.0版）。iCyclerTM iQ可选系统软件；生物-Rad）。
新铁蛋白合成
通过将转染细胞在无血清和无蛋氨酸的DMEM中孵育20小时，用60μCi转染法定量新合成的铁蛋白的积累-35S-蛋氨酸（MP Biomedicals，Solon，OH）。在Tris裂解缓冲液（pH 8.0；50 mM Tris、150 mM NaCl、1%Triton X-100、0.02%叠氮化钠和0.006%蛋白酶抑制剂混合物）中的冰上裂解细胞，并在12000年后收集上清液克离心。用山羊抗马铁蛋白免疫沉淀铁蛋白（德克萨斯州蒙哥马利市Bethyl实验室），在还原条件下用12%SDS-PAGE分离铁蛋白亚基。用电子放射自显影系统（Instant Imager；Perkin-Elmer，Waltham，MA）对放射性进行量化，并归一化为纳入TCA沉淀的总细胞蛋白中的放射性。
总耗铁量
将转染细胞在无血清DMEM中预培养1小时，以去除仍与膜上受体结合的任何转铁蛋白，然后用含有240μg/mL的新鲜无血清DMEM替换培养基59Fe-Tf并孵育24小时。用冷PBS清洗细胞，并通过向每个孔中添加200μL蒸馏水进行溶解，然后进行冷冻和解冻。用γ计数器（Wallac Wizard；PerkinElmer）测量裂解液中的放射性。蛋白质含量通过双茚二酸（BCA）测定进行定量。
铁结合到铁蛋白中
转染细胞在无血清DMEM中预孵育1小时，取出培养基并用含有59铁转铁蛋白（4μM人转铁蛋白、5.8μM铁和8μCi/mL，按前述方法制备19持续20小时。用冷PBS在冰上冲洗细胞，然后在含有蛋白酶抑制剂混合物和苯甲基磺酰氟（PMSF；Sigma，St.Louis，MO）的10 mM Tris-Cl（pH 7.4）中溶解。30000中的蛋白质克上清液经丙酮沉淀，所得颗粒经空气干燥后再悬浮在少量PBS中。除去等分样品进行蛋白质测定后，装载剩余样品并进行8%的天然PAGE。用电子放射自显影术（即时成像仪；PerkinElmer）定量铁蛋白带中的放射性。
转铁蛋白受体的蛋白质印迹分析
转染后24小时，对细胞进行冲洗，并在无血清MEM中培养24小时。在RIPA缓冲液（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）中裂解并在14000离心后克将上清液浓缩在离心柱上15分钟（Microcon 30；Millipore，Billerica，MA），并通过BCA分析（Pierce）分析蛋白质含量。将每个样品中的25微克蛋白质与6微克纯化人胎盘Tf受体（TfR；德克萨斯州圣安东尼奥阿尔法诊断公司）作为阳性对照加载到8%变性Tris-tricine凝胶上。将蛋白质在20 V下转移到硝化纤维素膜上30分钟（Hybond-ECL；德国慕尼黑GE Healthcare）。在含有100 mM NaCl、0.1%吐温-20和5%脱脂干乳的10 mM Tris缓冲液（pH 7.5）中封闭印迹。所有培养均在室温下在封闭缓冲液中进行1小时。细胞膜在1:2000稀释的单克隆小鼠抗人TfR（Invitrogen）中培养，然后在不含牛奶的Tris缓冲液中进行六次洗涤（每次6分钟）。使用的二级抗体是HRP标记的山羊抗鼠抗体（BD Biosciences，Palo Alto，CA），稀释度为1:750。在另一组洗涤和在Tris-buffered生理盐水中最后洗涤后，使用ECL（GE Healthcare）进行检测。在4°C下隔夜封闭后，用1:500稀释的HRP-山羊抗人β-肌动蛋白（加州圣克鲁斯圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）重制印迹，作为负荷控制。
铁蛋白链降解
用非靶向对照siRNA、FHsiRNA或FLsiRNA转染后24小时，用60μCi转染培养LECs 18小时35S-蛋氨酸。标记期结束后，收集细胞（时间0）或冲洗细胞，并在含有大量未标记蛋氨酸（2 mM）和半胱氨酸（0.7 mM）的10%FBS的DMEM中再培养12或28小时，以防止放射性氨基酸再循环。使用与从头合成铁蛋白相同的方案对细胞进行裂解，并对铁蛋白进行免疫沉淀，然后用12%SDS-PAGE分离FH和FL链。铁蛋白带中的放射性通过电子放射自显影术（InstantImager；PerkinElmer）定量，并归一化为纳入TCA沉淀的总细胞蛋白中的放射性。
细胞内总铁蛋白的测定
用夹心ELISA法测定细胞裂解液中的铁蛋白浓度。转染细胞在含有蛋白酶抑制剂和PMSF的10 mM Tris-Cl（pH 7.4）中溶解。将来自类似处理的裂解液汇集在一起，并在离心柱上浓缩6到10倍（Centricon 10；Millipore）。用亲和纯化的山羊抗马铁蛋白（4μg/mL）在4°C下隔夜涂覆检测板（ProBind；BD Biosciences）。反应被阻断后，应用样品和标准品（狗肝铁蛋白；NEIA，Inc.，Cambridge MA），并在37°C下培养1小时。用0.05%吐温-20在PBS中洗涤三次后，添加HRP标记的山羊抗马铁蛋白（Bethyl；0.5μg/mL），并在室温下培养1小时。进一步清洗后，将ABTS过氧化物酶底物（马里兰州盖瑟斯堡KPL）涂敷10至20分钟，并在405 nm处用微孔板读取器读取吸光度（Sunrise；帝肯，北卡罗来纳州三角研究公园）。
铁蛋白免疫荧光
如前所述，将LECs培养并转染到6孔板中的22 mm玻璃盖玻片上。所有标记步骤均在室温下进行。用对照组和铁蛋白H-和L-siRNA转染细胞四天后，用37°C的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗细胞两次，然后用4%甲醛在DPBS（37°C）中固定15分钟。用冰镇甲醇渗透10分钟后，用1×PBS清洗细胞三次，用5%正常山羊血清封闭1小时，然后用兔H-和L-铁蛋白特异性抗血清孵育4在1×PBS+0.1%BSA中以1:1000稀释1小时。阴性抗体对照用正常兔血清代替铁蛋白抗血清孵育。在1×PBS中洗涤三次10分钟后，将细胞与在1×PBS中以1:1000稀释的山羊抗兔Alexa Fluor 488缀合IgG（Invitrogen）在黑暗中孵育1小时。在1×PBS中清洗三次10分钟后，将盖玻片安装在含有DAPI（ProLong Gold；Invitrogen）的防伪试剂中的载玻片上。一些细胞在37°C下与2.0μM红色荧光染料（Lysotracker red；Invitrogen）在DMEM中孵育1小时，以在固定和铁蛋白检测之前标记溶酶体。然后用显微镜（DM5000B；Leica，Bannockburn，IL）用常规荧光和DIC光学成像细胞。使用冷却CCD相机（Retiga 1300；QImaging，Surrey，BC，Canada）和成像软件（Simple PCI；Compix，Inc.，Cranberry Township，PA）拍摄图像，并使用图像编辑软件（Photoshop CS2；Adobe，San Jose，CA）整理图像。
核提取物中HIF-1α水平的测定
如对照组、FHsiRNA或FLsiRNA所述转染LECs。转染后10小时，制备核提取物（NE-PER试剂盒；Pierce）并储存在−80°C。根据制造商的协议，使用HIF-1α试剂盒（DuoSet IC人/鼠；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）通过夹心ELISA测定核提取物中的HIF1α水平。HIF-1α的数量归一化为相应细胞溶质提取物中的蛋白质数量，并表示为对照转染细胞中HIF-1β的百分比。
细胞条件培养基（CCM）中VEGF的测定
VEGF通过ELISA测定，使用来自R&D Systems，Inc.的抗体、标准物和试剂。按说明转染LEC，用无血清、无谷氨酰胺的MEM替换培养基，然后在37°C下培养24小时。将平板放在冰上，收集CCM，并在1200℃离心去除所有漂浮细胞克样品储存在−80°C。对于VEGF分析，96个分析板（ProBind；BD Biosciences）在PBS（0.8μg/mL）中涂敷单克隆抗人VEGF过夜（所有培养均在室温下进行）。在PBS+0.05%吐温-20中清洗三次后，标准（重组人VEGF165)将样品涂抹并孵育2小时。在整个分析过程中，PBS+1%BSA用作稀释剂。重复清洗，然后用生物素化抗人VEGF（25 ng/mL）再培养2小时。清洗平板，并添加1:200稀释的链霉亲和素HRP 20分钟。最后一组清洗后，基材（H2O（运行）2/添加四甲基联苯胺）20分钟，然后添加1 M H2SO公司4阻止反应。在微孔板阅读器（日出；帝肯）上，在30分钟内读取450/540 nm处的吸光度。
细胞内谷胱甘肽的测定
使用商用试剂盒（加利福尼亚州特梅库拉Chemicon）分析转染LEC的细胞内GSH浓度。转染四天后，细胞被裂解，在12000℃离心克（4°C）并放在冰上。在添加溶解于乙腈中的一氯二烷染料后，将裂解产物在室温下培养1小时，并在黑漆96-well板中避光。使用荧光计（Fluoroskan Ascent；Thermo-Scientific，Waltham，MA）测量荧光（390-nm激发，460-nm发射）。GSH水平根据裂解物中的蛋白质量进行标准化。
胱氨酸摄取
转染细胞用5μM标记我-35吸收缓冲液中的S-胱氨酸（pH 7.4），由137 mM NaCl、10 mM HEPES、5 mM葡萄糖、1 mM MgCl组成2，1 mM氯化钙2和0.7 mM KH2人事军官4并在37°C和5%CO中培养2分钟2取下缓冲液并用冰镇PBS清洗细胞三次，终止吸收。将细胞在冰上培养在含有蛋白酶抑制剂和PMSF的10 mM Tris缓冲液中20分钟，然后离心5分钟（14600克)温度为4°C。使用液体闪烁计数器（1409 Wallac；Perkin Elmer）测量裂解物样品中的放射性。通过TCA沉淀法确定放射性并入蛋白质。
统计
数据通过方差分析和Tukey的HSD检验进行多重比较；差异在对<0.05。
结果
在本研究中，我们通过用铁蛋白链（FH-或FLsiRNA）的siRNA转染培养的LEC来改变铁蛋白H:L链比率，并测定对从头开始的铁蛋白H-和L-链合成和降解速率、铁蛋白中的铁可用性和储存、总铁蛋白浓度、，以及对铁调节途径的下游影响（见).
FH-和FLsiRNA对FH-、FLmRNA和铁蛋白H-、L-链从头合成的影响
FHsiRNA显著降低了FH mRNA的拷贝数，但对FL mRNA没有影响。FLsiRNA对靶mRNA的影响具有相同的特异性()。FHsiRNA转染后2天即显著降低铁蛋白H链的合成(A） ●●●●。在转染后4天，这种下降保持不变。令人惊讶的是，FHsiRNA在转染后第2天导致从头合成的铁蛋白L链大幅增加（100%）。在第4天仍然可以观察到大幅增加（50%）。FLsiRNA转染没有类似的显著效果。L-链的从头合成在第2天显著减少约40%，在第4天显著减少26%(B） ●●●●。出乎意料的是，在转染后第4天，H链合成也显著降低（22%）。
FH和FLsiRNA对培养LEC中FH和FL mRNA的影响。从培养的LEC中提取总RNA，这些LEC分别转染有抑制FH-或FLsiRNA表达的siRNA或非靶向Ctl-siRNA。用SYBR绿色母体混合物在mRNA水平上通过qRT-PCR分析铁蛋白H和L链基因表达的变化。拷贝数是根据每个基因cDNA的已知浓度的连续稀释产生的标准曲线确定的*与控制显著不同(对< 0.05).
H链和L链siRNA对LECs从头合成铁蛋白亚基的影响。(A类,B类)将LECs接种在六孔板中，然后用非靶向对照或FH-或FLsiRNA转染。两天后和四天后，用35S-蛋氨酸20小时。从细胞裂解液中取出TCA沉淀样品，然后从裂解液中免疫沉淀铁蛋白。将溶解的免疫沉淀物进行12%SDS-PAGE，铁蛋白H和L链带中的放射性归一化为并入蛋白质的放射性总量（TCA）。数据表示为转染非靶向siRNA的对照细胞的百分比。直方图表示至少八个样本的平均±SEM*与控制显著不同(对< 0.05); 方差分析和Tukey检验。(C类)显示新合成的H链和L链铁蛋白亚基的代表性凝胶35siRNA处理后的S-蛋氨酸。
随着转染FHsiRNA的细胞中L链铁蛋白水平的急剧增加，我们希望观察铁蛋白链是如何分布的，以及L链铁素的大量增加是否局限于任何特定的亚细胞室。转染非靶向对照siRNA的细胞在转染后4天显示内源性铁蛋白H链和L链水平(A、，D） ●●●●。FHsiRNA转染导致铁蛋白H链染色大幅减少(B） 而铁蛋白L链变得比转染对照siRNA的细胞更丰富(E） ●●●●。FLsiRNA转染后，H链和L链铁蛋白的信号均减少(C、，F） ●●●●。
FH-或FLsiRNA转染改变了免疫定位测定的铁蛋白链水平。用对照非靶向siRNA转染细胞(A类,D类,G公司,J型)，FHsiRNA(B类,E类,H（H）,K（K）,M（M）——O（运行）)，或FLsiRNA(C类,F类,我,L（左）)并在4天后使用免疫标记法对铁蛋白链进行标记(A类,B类,C类)H-或(D类——F类,J型——M（M）)L-特异性抗血清，随后是Alexa Fluor-488结合二级抗体(绿色荧光）和DAPI染色(蓝色核）。阴性抗体对照用正常兔血清（对照血清）代替铁蛋白特异性抗血清孵育(G公司,H（H）,我)。显示了每种siRNA处理的代表性细胞的放大倍数较高，并标记有L-铁蛋白(J型——L（左）)。(M（M）)FHsiRNA转染细胞4天，固定前用红色荧光染料标记1小时(N个)。覆盖层(O（运行）)显示同位化(黄色的)溶酶体中的铁蛋白(箭头).
FH-和FLsiRNA对铁蛋白链降解的影响
总铁蛋白水平也由铁蛋白H链和L链的降解速率控制，通常降解速率很低。5为了确定铁蛋白siRNA如何影响这些速率，用35S-蛋氨酸18小时。然后在0、12和28小时后测量每条链中的标签数量。在对照细胞中，H链在28小时内稳定降解，而L链并没有随时间显著降低。与对照组相比，FLsiRNA在任何时候都不会改变L链铁蛋白水平，但它确实抑制了H链降解。相反，FHsiRNA显著阻止了H链的降解，并导致标记的L链铁蛋白的大量显著积累().
siRNA敲除后铁蛋白链降解。用对照非靶向siRNA、FHsiRNA或FLsiRNA转染后24小时，用60μCi转染培养LECs 18小时35S-蛋氨酸。标记期结束后，收集细胞（时间0）或冲洗细胞，并在含有10%FBS和大量过量冷蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM中再培养12或28小时，以防止放射性标记的再循环。铁蛋白是用山羊抗马铁蛋白和H-和L-铁蛋白链通过12%SDS-PAGE分离的裂解物进行免疫沉淀的。测量铁蛋白带中的放射性，并将其归一化为并入总细胞蛋白中的放射性。12小时和28小时时每条链的降解表示为时间0时相应链和转染处理的百分比（%CTL时间0）。每个条代表四个样品的平均值±SEM*与时间0对应项显著不同(对< 0.05); 方差分析和Tukey检验。
我们很好奇为什么L-链铁蛋白似乎没有被降解，而且其水平甚至继续增加。在高倍镜下，转染对照或FLsiRNA的细胞通常表现为弥漫性L-链铁蛋白标记(J、，L） ，而许多用FHsiRNA转染的细胞通常在细胞核周围显示出L-链铁蛋白积聚的聚集体(K） ●●●●。在另一项研究中，我们发现L链铁蛋白在LEC中的过度表达导致L链铁素细胞质内含物的积累。5在本研究中，许多用FHsiRNA转染的细胞含有更大的球形L-链铁蛋白积累区域，这让人想起溶酶体(M） ●●●●。为了确定L-链铁蛋白是否像正常降解过程中预期的那样靶向溶酶体，我们在转染后4天用红色荧光染料（Lysotracker red；Invitrogen）标记转染细胞1小时(N） ●●●●。这种荧光、膜渗透性染料标记酸性细胞器，主要是溶酶体和内胚乳。一些用红色染料标记的结构也含有L-链铁蛋白(O） ●●●●。然而，并非所有的L-链铁蛋白都与溶酶体共定位，这是由于蛋白质周转的动态性质。值得注意的是，最大的铁蛋白阳性结构与最大的溶酶体共定位。
转染细胞中的总铁蛋白浓度
由于铁蛋白是一种长寿命蛋白质，因此必须确定siRNA诱导的从头合成和降解铁蛋白的变化对LEC中总铁蛋白浓度的影响。ELISA测定，转染FLsiRNA后2天，总铁蛋白浓度降低了10倍以上。随后，在4天时，铁蛋白反弹至大约比对照低三倍。相反，FHsiRNA在转染后2天将LECs中的铁蛋白浓度增加了近200倍。转染4天后，铁蛋白浓度继续增加，达到比对照组高500倍的水平()。这些急剧增加很可能是由于从头合成的铁蛋白L链大幅增加，同时L链铁蛋白降解受到完全抑制。
表1。
| 治疗 | 2天 | 4天 |
|---|
| Ctl siRNA | 5.9 ± 4.0 | 4.9 ± 1.8 |
| FHsiRNA | 1066 ± 274* | 2497 ± 1140* |
| FLsiRNA | 0.4 ± 0.3* | 1.5 ± 1.1* |
铁在不同H:L比组装铁蛋白中的掺入
其他研究表明，铁蛋白H:L比率的改变会影响铁蛋白储存铁的能力。9由于FHsiRNA转染显著改变了LECs中的H:L比率，因此测定了LECs中铁蛋白的铁储存能力。细胞被装载59转染铁转铁蛋白后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离细胞溶质蛋白，并测定条带的放射性。放射性带的大小符合铁蛋白标准（450 kDa，未显示）。FH siRNA转染细胞在第2天显著减少了铁蛋白中的铁掺入，并继续减少，到第4天时低至对照细胞的9%(A、，B） ●●●●。FHsiRNA-处理细胞的放射自显影图上检测到两条迁移率略有不同的铁蛋白带。转染FLsiRNA的LECs在转染后2天显示铁掺入铁蛋白的显著增加。然而，到第4天，铁的掺入量与对照水平没有差异。
H链和L链siRNA对铁并入铁蛋白的影响。(A类)在用非靶向对照、FHsiRNA或FLsiRNA转染后2天和4天，LECs与59铁转运蛋白。细胞裂解后，用丙酮沉淀蛋白质，再悬浮在PBS中，取出一等分样品进行蛋白质测定，剩余样品进行8%的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。金额59将铁蛋白带中的Fe标准化为每个样本中的总蛋白，数据以用非靶向siRNA转染的对照细胞的百分比表示。柱状图表示至少五个样本的平均值。(B类)4天时间点的代表性自动放射自显影*与控制显著不同(对< 0.05); **与对照组显著不同(对< 0.01); 方差分析和Tukey检验。
转染细胞中铁有效性的变化
由于铁蛋白的合成受铁的调节，FHsiRNA诱导的L链铁蛋白的增加可能是由于铁可用性的增加。由于转铁蛋白受体（TfR）水平随着细胞内铁可用性的增加而降低，因此TfR水平通常被用作细胞铁状态的指标。事实上，与非靶向siRNA对照细胞相比，用FHsiRNA处理细胞时，通过Western blot分析检测到的TfR水平降低了近40%(A） ●●●●。此外，通过TfR对异铁转铁蛋白铁摄取的功能性分析表明，FHsiRNA-转染细胞铁摄取几乎相同的减少（几乎40%，B） ●●●●。这些结果表明，FHsiRNA处理增加了铁的可用性，这解释了为什么这些细胞中L链铁蛋白合成增加。FLsiRNA对LECs中的TfR水平或铁摄取没有影响。
铁蛋白H链和L链的siRNA敲低对LECs转铁蛋白受体和铁摄取的影响。(A类)TfR蛋白印迹。用非靶向对照FHsiRNA或FLsiRNA转染细胞后24小时，冲洗细胞并在无血清MEM中培养24小时。在RIPA缓冲液中溶解并离心后，上清液浓缩在离心过滤柱上。将每个样品中的25微克蛋白质加载到8%变性Tris-tricine凝胶上，并将6微克纯化人胎盘TfR作为阳性对照。用单克隆鼠抗人TfR、二级HRP抗体和ECL检测转铁蛋白受体。用1:500稀释的HRP-山羊抗人β-肌动蛋白（用作负荷控制）重制印迹。所示斑点代表了三个实验，数据表示为平均值±SEM。*与对照组显著不同(对< 0.01); 方差分析和Tukey检验。(B类)铁吸收。用240μg/mL培养转染细胞59Fe-Tf在无血清DMEM中放置20小时，制备裂解物，并使用γ计数器计算胞浆部分的放射性。将每个样品中的放射性归一化为蛋白质，数据表示为用非靶向siRNA转染的对照细胞的百分比。数据显示为八个样品的平均值±SEM*与控制显著不同(对< 0.05); 方差分析和Tukey检验。
不同转染LEC的胱氨酸摄取和GSH水平
正如我们最近证明的那样，细胞内铁可用性的增加增加了谷氨酸/胱氨酸反转运蛋白对胱氨苷的摄取，同时伴随着LEC中GSH浓度的增加。18在本研究中，FHsiRNA转染增加了LIP中有效铁的含量。这一增加通过以下金额的减少得到证实：59铁蛋白中发现Fe()，LEC中TfR水平下降(A） 、和减少59LECs对铁转铁蛋白的吸收(B） ●●●●。TfR水平通常被认为是细胞铁状态的反映。事实上，FHsiRNA治疗导致LEC中胱氨酸摄取和谷胱甘肽浓度显著增加，正如细胞内铁增加所预期的那样()。相反，FLsiRNA转染后4天，LEC的胱氨酸摄取或GSH水平均无明显变化。
转染4天后，铁蛋白H-和L-链siRNA对胱氨酸摄取和谷胱甘肽浓度的影响。用非靶向对照、FHsiRNA或FLsiRNA转染LECs，裂解，并在裂解物中测量细胞内GSH。在一组平行的实验中，我-35然后测定S-胱氨酸摄取量。数据以转染非靶向siRNA的对照细胞百分比表示。直方图表示至少四个样本的平均值±SEM*与控制显著不同(对< 0.01); 方差分析和Tukey检验。
不同转染LECs条件培养基中VEGF的浓度
铁是转录因子HIF-1活性的关键调节因子。20HIF-1调节多种蛋白质的产生，包括VEGF()。在本研究中，以氯化血红素形式添加的过量铁降低了VEGF，而铁螯合物双吡啶增加了培养LEC CCM中VEGF的积累()。毫不奇怪，与对照组相比，增加LECs细胞内铁可用性的FHsiRNA显著减少了HIF-1α向细胞核的移动量50%(对< 0.002,n个= 4). FHsiRNA还将CCM中VEGF的积累减少了约60%()。FLsiRNA对细胞核中HIF-1α水平无影响，但使CCM中VEGF的积累略有减少。
铁、铁螯合、FHsiRNA和FLsiRNA对LEC条件培养基中VEGF积累的影响。转染LECs，转染4天后在CCM中检测VEGF。在一组平行的实验中，未转染细胞（LEC）生长到汇合处，并在无血清培养基中以氯化血红素（1.5μM）或铁螯合剂联吡啶（0.3 mM）的形式用铁处理6小时。测定CCM中VEGF的积累。数据表示为每个实验中对照细胞CCM中VEGF的百分比*与控制显著不同，对<0.05，方差分析和Tukey检验。
讨论
多元蛋白质铁蛋白负责细胞内铁的安全储存。铁蛋白H链具有铁氧化酶活性，有助于铁沉积到铁蛋白核心，而铁蛋白L链被认为有助于核心的巩固。21铁蛋白H链和L链的比率具有组织特异性，并显著影响细胞储存和回收铁的能力。22
铁蛋白H链和L链的过度表达最初用于改变几种不同细胞类型中的H:L比率，以便研究这种蛋白质组成差异的生理重要性。这些研究结果表明，铁蛋白H链的过度表达增加了铁蛋白中的铁储存量，降低了LIP的大小，7,8,23保护细胞免受紫外线或过氧化氢照射的损伤7,8并且具有抗凋亡作用。24铁蛋白L-链的过度表达不会显著影响细胞内铁的分布，对氧化应激也没有保护作用。7
遗传性高铁蛋白血症白内障综合征（HHCS）中铁蛋白L链的过度表达是自然发生的。25在这种显性遗传综合征中，患者的铁蛋白L链mRNA的调节元件发生突变，导致其组成合成。因此，高水平的富含L-链的铁蛋白在包括晶状体在内的组织中积累。然而，这种富含L链的铁蛋白几乎没有铁隔离。26事实上，L链铁蛋白过度表达的HHCS患者的铁稳态明显不受影响。唯一受到铁蛋白积聚不利影响的组织是晶状体，早在婴儿期就出现白内障。这种效应很可能是由于过度表达的铁蛋白亚基聚集所致。值得注意的是，在L链铁蛋白起始密码子发生突变的患者中，L链合成的结构性下调对铁代谢没有明显影响。27综上所述，这些观察结果得出结论，即使L链铁蛋白合成发生剧烈变化，也不会对铁代谢产生显著影响。尽管铁蛋白L链和H链在结构上非常相似，但H链铁蛋白基因中没有已知的自然发生的改变铁蛋白表达的突变。
在实验上，H:L比率可以通过使用每个亚单位特有的siRNA来改变。事实上，与反义处理相比，用siRNA转染HeLa细胞的H链或L链铁蛋白能更有效地减少铁蛋白链的合成。9在这项早期研究中，FLsiRNA对细胞铁稳态没有直接影响，但促进了细胞增殖。另一方面，FHsiRNA处理降低了细胞对铁补充和螯合的抵抗力。结论是，H链铁蛋白起着铁缓冲作用，控制潜在氧化还原活性铁的水平。
在我们目前的研究中，使用针对犬铁蛋白H链和L链定制的siRNA处理培养的犬LEC，可以非常有效地减少每条链的合成。FH和FL mRNA的定量显示，其中一个siRNA对另一个链的mRNA没有非靶向效应。在一项有趣的发现中，FHsiRNA或FLsiRNA显著改变了另一条链的从头合成和铁蛋白的铁储存能力/容量。例如，FHsiRNA使铁蛋白H链合成减少50%，但也导致L链合成急剧增加，并完全阻止了两条链的降解。因此，LEC中铁蛋白的积累增加了500倍。铁蛋白的积累具有很高的L:H比率，降低了铁的细胞内储存能力，并可能增加LIP的大小。据报道，铁的可用性增加可以阻止RPE细胞中蛋白质的溶酶体降解28特别是铁蛋白降解。29由于铁蛋白中储存的铁不会催化破坏反应，因此这种机制可能是增加铁储存容量的重要保护机制。
我们发现一些LEC的溶酶体中积累了大量的L链铁蛋白，其中铁蛋白L链表达增加（FHsiRNA处理）。然而，也发现一些游离在细胞质中或不与溶酶体共定位的包涵体内。这些非溶酶体、含铁蛋白的结构可能与L链铁蛋白在转染的LEC中过度表达时观察到的结构类似。5溶酶体中存在一部分L链铁蛋白，表明LEC中发生了“正常”溶酶体介导的降解。然而，它并没有揭示铁蛋白进入溶酶体后降解速度或降解是否受阻的任何信息。在一些细胞中，最大的溶酶体含有最大数量的铁蛋白，这可能反映了FHsiRNA转染诱导的降解大量多余铁蛋白L链的企图。细胞内铁可用性的增加以及细胞内“正常”铁动力学的扰动可能会降低溶酶体中铁蛋白周转的效率。由于用于免疫荧光的L-链特异性抗体标记组装铁蛋白（“正常”或富含L-）中的L-链以及游离L-链，因此我们无法确定溶酶体中是否有任何特定形式的抗体比细胞质中的抗体占优势。
FLsiRNA对H链合成的抑制作用非常有趣，特别是因为我们证明FLsiRNA不影响FH mRNA水平。FLsiRNA减少了L-和H-链铁蛋白的从头合成，从而降低了这些细胞中的总铁蛋白水平。尽管FLsiRNA阻止了H链铁蛋白的降解，但总铁蛋白却出现了这种下降。在用H-或L-链铁蛋白表达载体转染的LECs的早期研究中，4,5我们假设，当L链铁蛋白不足以形成异聚铁蛋白时，LEC通过分泌或降解该链严格控制H链铁蛋白水平。本研究的结果表明，FLsiRNA降低了L-链铁蛋白的可用性。有效性降低将增加H链铁蛋白的分泌，降低新合成（标记）铁蛋白的水平，并降低LEC中的总铁蛋白浓度。L-链铁蛋白从头合成的显著减少最初可能会增加H:L-链比率，并有利于铁与铁蛋白结合的增加（如第2天所示）。然而，到第4天，由于新合成的H链铁蛋白的可用性持续降低，H:L比率可能已经稳定到铁结合到铁蛋白中的程度不再与对照中的不同。
铁蛋白合成、TfR水平和Tf对铁的吸收是铁可用性和氧化还原活性LIP大小的公认指标。铁代谢相关蛋白的表达，如铁蛋白和TfR，在翻译水平上由铁调节，因为铁决定细胞质铁调节蛋白（IRP）的活性。在缺铁细胞中，IRP可以与铁蛋白mRNA结合并阻止其翻译。相反，与TfR mRNA结合的IRP使其稳定并增加TfR合成。30因此，TfR表达的减少反映了铁可用性的增加。IRP含有铁硫簇。在含有足量铁的细胞中，IRP不与mRNA结合，而是作为细胞溶质顺乌头酸酶发挥作用。我们已经证明，当IRP作为一种顺乌头酸酶发挥作用时（即，在充足的铁可用性条件下），它调节谷氨酸的生成。17从生理学的角度来看，这个调节系统是有意义的，因为缺铁的细胞不需要更多的铁。事实上，他们必须减少铁的摄入，以避免过量铁的破坏性后果，包括破坏性的自由基反应。
我们目前的研究结果表明，IRP监管系统的功能符合预期。FHsiRNA处理的LECs表现出增加的铁可用性，这是通过降低TfR水平、从Tf摄取铁以及LECs中铁蛋白的铁掺入来测量的。FHsiRNA处理后，LECs含有两个具有不同迁移率的铁标记铁蛋白池。低迁移率（上）带主要由L链铁蛋白组成，可能只有L链（数据未显示）。这一发现并不令人惊讶，因为L链铁蛋白存在大量过剩，并且其酸性低于铁蛋白H链。因此，它具有较低的电泳迁移率。这两条谱带中铁的低水平与富含L链铁蛋白的低铁储存能力相一致。
从头合成铁蛋白和铁蛋白降解维持细胞内总铁蛋白的水平。FHsiRNA处理的LECs中总铁蛋白在4天后增加500倍，远远大于从头合成和降解的影响。然而，这种蛋白质的半衰期很长，而且测量铁蛋白合成和总含量的方法不同，因此很难或不可能进行定量比较。从头合成和降解的测量不仅需要初级抗体与铁蛋白的相互作用；还有其他步骤：抗原-抗体复合物的分离、多次洗涤、凝胶电泳和放射自显影。因此，只有新合成的，35检测到S-标记的铁蛋白，在这些条件下可能并没有捕获或检测到所有新合成的铁蛋白。相反，通过ELISA测定总铁蛋白浓度将捕获细胞裂解液中的大多数铁蛋白（如果不是全部的话），包括以前合成的未降解铁蛋白。考虑到该蛋白质的半衰期较长，以及siRNA处理导致的降解率下降，预计ELISA结果将与从头合成数据有很大差异。
显然，铁蛋白亚基合成的改变以及最终完整铁蛋白分子中的H:L比率显著改变了细胞内铁动力学。我们的结果表明，这些改变可能影响IRP的结合活性及其顺乌头酸酶活性。我们在其他工作中已经证明，铁对乌头酸酶活性的调节对LECs和RPE细胞中的谷氨酸合成、胱氨酸摄取和GSH水平具有重要的下游影响。17,18正如预期的那样，FHsiRNA引起的铁可用性增加显著增加了LEC中的胱氨酸摄取和GSH水平。
铁在调节VEGF生成中也很重要()通过其对HIF-1的影响，HIF-1在转录水平上调节VEGF的合成。铁水平的增加增加了HIF-1α的降解，从而减少了其进入细胞核的运动，在细胞核中它与HIF-1β结合形成异二聚体转录因子HIF-1。HIF-1控制数十种蛋白质的合成，包括VEGF。FHsiRNA降低了LECs细胞核中的HIF-1α水平以及CCM中的VEGF积累，这与其增加细胞内铁有效性的能力一致。FLsiRNA对LECs细胞核中HIF-1α水平无影响，但对VEGF分泌影响较小。原因尚不清楚；然而，它们可能与FLsiRNA在降低铁蛋白H链水平方面的作用一致，或者可能与进行测量的不同时间点有关。
细胞调节铁蛋白H:L链比率的能力对于控制铁代谢以及关键细胞内抗氧化剂GSH的下游调节至关重要。此外，VEGF的分泌也受到铁蛋白H:L比率变化的影响。尽管VEGF在晶状体中的作用尚不清楚，但这种生长因子在视网膜的生理和病理中起着关键作用。目前的研究结果表明，细胞内铁代谢与VEGF之间存在潜在的重要关系，显然需要进一步研究。从目前的研究中可以清楚地看出，维持细胞型特异性铁蛋白H:L比率对细胞内环境稳定至关重要，因为该比率控制着细胞铁的可用性和依赖铁的许多基本过程，包括增加抗氧化剂GSH的水平，它可以保护细胞免受铁催化的自由基反应。
脚注
由美国国立卫生研究院拨款EY04900和北卡罗来纳州资金支持。
披露：J.哈内德，无；J.费雷尔，无；M.M.拉尔，无；Fleisher法律公告，无；S.Nagar公司，无；M.戈拉尔斯卡，无；M.C.麦加汉，无
工具书类
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