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美国国家科学院院刊。2009年11月24日；106(47): 19878–19883.
2009年11月10日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0908458106
预防性维修识别码：PMC2785260型
PMID：19903888

DAB2IP协调PI3K-Akt和ASK1通路以促进细胞存活和凋亡

大兴谢，a、，b条 水晶戈尔，一 Jian Zhou公司，一 Rey-Chen Pong先生，一 张海峰，c（c） 陆洋余，c（c） 罗伯特·维塞拉，天 王敏，c（c）和谢杰聪a、，1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

在转移性前列腺癌（PCa）细胞中，经常检测到细胞生存和死亡信号之间的失衡，例如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt的结构性激活和凋亡刺激激酶（ASK1）-JNK通路的失活。这里，我们表明DAB2IP蛋白，通常在PCa中下调，通过诱导G0/G公司1细胞周期停滞，并在应激反应中促凋亡。功能获得研究表明，DAB2IP可以抑制PI3K-Akt通路并增强ASK1激活导致细胞凋亡，而DAB2IP表达缺失导致PI3K-Akt激活和ASK1-JNK失活导致体内PCa生长加快。此外，来自DAB2IP的腺上皮−/−动物出现增生和凋亡缺陷。DAB2IP蛋白的结构功能分析表明，除了C2结构域在ASK1活性中的关键作用外，富含脯氨酸（PR）和类周期（PER）结构域对调节PI3K-Akt活性也很重要。因此，DAB2IP是一种能够桥接生存和死亡信号分子的支架蛋白，这意味着它在维持细胞内环境稳定中的作用。

关键词：细胞凋亡、前列腺癌、信号转导

细胞增殖、存活和凋亡之间的稳态平衡对于个体发育至关重要。这些过程中的任何不平衡都会导致细胞发生病理变化。许多癌细胞通常表现出加速细胞增殖、提高细胞存活率和抗凋亡能力。解剖正常细胞中运行的稳态机制将为恶性细胞中稳态机制的改变提供重要线索。

PI3-激酶（PI3K）-Akt信号通路在调节细胞增殖、存活和运动中起着重要作用。IA类PI3K是一种异二聚体，由110-kDa催化亚基（p110）和85-kDa-调节亚基（p85）组成。哺乳动物细胞含有三种不同的p85基因（α、β和γ）和三种不同的p110基因（α、β和σ）(1，2). p85使p110稳定在稳定状态(三). PI3K的激活是通过p85与磷酸酪氨酸蛋白的结合发生的，这可以解除p85对p110的抑制作用，然后PI3K从胞浆转运到质膜，其底物PI-4,5-P位于质膜上2驻留(4，5). PI3K激活后，在T308和S473磷酸化的Akt被激活(6). PI3K-Akt通路在致癌过程中的作用已被广泛研究，该通路中许多成分的表达或突变与人类癌症有关(1). 导致PI3K-Akt过度激活的机制包括基因激活突变(7，8)，蛋白质过度表达(9)，Ras癌基因突变(10)或缺乏磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）等抑制剂(11，12)已在多种癌症类型中显示。除了促进细胞增殖和存活外，PI3K-Akt途径还可以影响凋亡细胞死亡机制(1). 例如，Akt可以通过磷酸化S83残基使凋亡信号调节激酶1（ASK1）失活(13). ASK1是MAPK激酶（MAP3K）家族的成员，是c-Jun激酶（JNK）和p38 MAPK信号级联的上游激活物(14). ASK1的激活触发细胞凋亡，以应对不同的应激和凋亡刺激，如TNF-α或活性氧(15).

我们之前确定了DAB2IP/AIP1（DOC-2/DAB2交互蛋白或ASK1交互蛋白）(16，17)作为RAS-GT酶激活蛋白（RAS-GAP）家族成员，在前列腺癌（PCa）中具有生长抑制活性。DAB2IP表达的缺失，主要是由于其启动子的表观遗传调控，通常在雄激素非依赖性前列腺癌中检测到(18，19)以及其他癌症类型(20–23). 此外，一项使用两个全基因组关联数据库的研究表明，DAB2IP基因中的单核苷酸多态性与侵袭性PCa的风险相关(24). DAB2IP可以抑制H-RAS、R-RAS和TC21，但不能抑制与抑制表皮生长因子合法PCa生长相关的RAP1A活性(16). 除了GAP活性外，DAB2IP还通过其序列同源性（PH）和C2结构域促进ASK1与其抑制剂14-3-3的分离，从而参与TNF-α介导的内皮细胞凋亡(25，26). 显然，DAB2IP涉及各种细胞类型的多种生物功能。

在此，我们进一步揭示DAB2IP可以协调PI3K-Akt失活与ASK1激活途径。除了其N末端C2结构域在ASK1活性中的关键作用外(17)结构功能分析表明，C末端富含脯氨酸（PR）和类周期（PER）结构域分别对调节PI3K和Akt活性至关重要。因此，DAB2IP蛋白是一种独特的支架蛋白，可以平衡细胞增殖、存活和死亡的途径。

结果

DAB2IP导致G0/G公司1细胞周期阻滞和促进细胞凋亡。

我们以前的数据表明，DAB2IP的丢失与转移性PCa细胞系有关(16). 利用不同病理状态（如良性前列腺增生（BPH）、原发癌和骨转移）的前列腺标本来确定DAB2IP的相对表达模式，我们进一步发现转移性前列腺癌中DAB2IP mRNA水平显著低于BPH或原发癌标本(图1A类)，表明DAB2IP降低与PCa进展相关。除了GAP活动(16)DAB2IP在PCa中的其他功能基本未知。因此，我们首先研究了DAB2IP是否可能影响细胞周期进展。使用从C4-2细胞系生成的稳定的DAB2IP转染亚系（即D2）、无内源性DAB2IP表达的致瘤PCa系和对照亚系（如Neo）(16)，我们比较了它们的细胞周期分布。G的百分比0/G公司1D2期细胞比Neo亚系多≈20%；相反，S或G2/D2亚系M期细胞少于Neo亚系[图1B类和支持信息（SI）图S1A类，表明DAB2IP可能引发G0/G公司1细胞周期阻滞。流式细胞术检测细胞周期蛋白D1和E对细胞DNA的双变量分析(27)显示两种细胞周期蛋白的“非计划”表达模式(28)在Neo子系中(图1B类). 在D2亚系中，细胞周期蛋白D1和E蛋白水平在G0相位或G1相位(图1B类)，表示DAB2IP可以降低G1导致G的相周期蛋白水平0或早期G1细胞周期阻滞。

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DAB2IP在前列腺癌中的表达及其功能作用。(A类)前列腺增生人类标本中DAB2IP mRNA相对水平的方框图(n个=12，左栏），原发性癌症(n个=12，中心杆）和骨转移(n个=12，右栏）。细线=中值；虚线=平均值；P（P）<0.001由Kruskal–Wallis ANOVA在RANKS上得出。(B类)DAB2IP感应G0/G公司1细胞周期阻滞。流式细胞术检测细胞周期分布。对于细胞周期蛋白/DNA多参数流式细胞术，梯形“窗口”代表同型IgG对照的荧光水平，表明细胞周期蛋白阴性细胞的分布范围。(C)DAB2IP的瞬时表达促进LY作用下C4-2细胞的凋亡。Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡。星号表示DAB2IP转染细胞与VC转染细胞的统计显著性(P（P）< 0.01). (D类)DAB2IP促进LY或TNF-α处理的D1和D2细胞凋亡。星号表示DAB2IP表达细胞和新细胞之间的统计显著性(P（P）< 0.01). (E类)敲除DAB2IP可降低PZ-HPV-7细胞的凋亡反应。星号表示转染DAB2IP-siRNA的细胞与对照siRNA的细胞的统计显著性(P（P）< 0.01). 所有数据（平均值±SEM）均来自三个独立实验。

因为DAB2IP可以通过ASK1促进TNF-α诱导的内皮细胞凋亡(17)，我们决定确定在PI3K抑制剂LY294002（LY）或TNF-α分别能够激活线粒体或死亡受体途径的情况下，DAB2IP是否会影响PCa细胞（例如，瞬时和稳定的DAB2IP转染的C4-2细胞）的凋亡(29). 在存在LY的情况下，在瞬时DAB2IP转染细胞中检测到的活细胞较少(图S1B类). Annexin V/PI分析表明，在LY治疗下，瞬时DAB2IP转染细胞的凋亡细胞死亡比载体控制（VC）细胞增加约3倍(图1C). 在稳定的转染子（即D1或D2）中，LY或TNF-α诱导的细胞凋亡显著高于Neo细胞，这与DAP2IP的表达水平相关(图1D类). 这种DAB2IP增强的细胞死亡是半胱天冬酶依赖性的，因为泛天冬酶抑制剂（Z-VAD）的存在可以消除DAB2IP效应(图1D类).

为了进一步确定DAB2IP在LY或TNF-α诱导的凋亡途径中的参与，使用siRNA敲除永生化正常前列腺上皮（PZ-HPV-7）细胞中的内源性DAB2IP。与对照siRNA相比，DAB2IP减少的细胞凋亡约为LY的3倍或TNF-α处理细胞的2倍(图1E类). 总之，这些发现表明DAB2IP可以引起细胞周期阻滞，也是一种能够增强内在或外在凋亡途径的促凋亡因子。

DAB2IP抑制Akt并激活ASK1活动。

为了揭示DAB2IP在这些事件中的作用机制，根据每个蛋白质的特定磷酸化位点确定Akt（S473）或ASK1（T845）的激活状态。与新细胞相比第页-LY处理后在D1和D2细胞中检测到Akt（S473）(图2A左边); 同时，第页-D1和D2细胞中ASK1（T845）显著升高(图2A正确). 在TNF-α治疗的D1和D2细胞中也观察到类似的结果(图2B类). 这些数据表明，在应激条件下，DAB2IP可以抑制Akt并促进ASK1的激活。此外，在相同处理下的PZ-HPV-7细胞中，在DAB2IP siRNA的存在下，检测到Akt增加和ASK1减少激活，以降低内源性DAB2IP水平(图2C). 因此，DAB2IP似乎是连接Akt和ASK1路径的调制器。

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DAB2IP抑制了PI3K-Akt并激活了ASK1。(A类和B类)LY（10μM）后从neo、D1和D2细胞制备细胞裂解物(A类)或TNF-α（100 ng/mL）(B类)处理30min，通过Western blot分析检测Akt或ASK1的活化。用总Akt或ASK1抗体剥离并重新制备同一膜，从而使相对激酶活化的定量标准化。数据（平均值±SEM）来自两个独立的实验。星号表示DAB2IP表达细胞和neo细胞之间的统计显著性，（*，P（P）< 0.1; **,P（P）< 0.05). (C)用DAB2IP或对照siRNA转染PZ-HPV-7细胞，然后用LY或TNF-α处理，如A类或B类，并对Akt和ASK1激酶的相对活性进行量化。星号表示转染DAB2IP-siRNA细胞的细胞与对照siRNA相比具有统计学意义(P（P）< 0.05).

DAB2IP通过PR域绑定到PI3K-p85。

从结构上看，DAB2IP包含几个潜在的功能域(图3A左边)包括PH、C2、GAP、PER、PR和亮氨酸拉链（LZ）域。由于PI3K调节亚基（即p85）包含Src同源性3（SH3），我们预测PR结构域可以与p85-SH3结构域结合。下拉数据(图3A正确和图S2A类)表明DAB2IP-F、-C和-CPR可与GST-p85-SH3结合，但不能与-N结合，表明PR是p85-SH的结合域。使用共免疫沉淀（co-IP），检测到DAB2IP与p85或ASK1的弱相互作用；然而，在任一LY下都检测到复合物形成的急剧增加(图3B类)或TNF-α治疗(图S2B类). 在ASK1-DAB2IP-PI3K复合物中，ASK1的活性形式（T845）变得比其非活性形式（S83）更为主要。此外，a减少了第页-在该复合物中检测到Akt（S473）(图3C)表明DAB2IP可能通过与PI3K和Akt的直接蛋白相互作用抑制PI3K。因为这个PR结构域包含10个脯氨酸重复序列的不寻常序列，我们使用三个不同的PR突变体进一步定位了p85的结合位点(图3D类). 下拉分析表明，前四个脯氨酸残基对p85结合至关重要，AAA突变体完全取消了与p85的结合(图3D类). Co-IP数据进一步证实，AAA突变体不仅不能与p85相互作用(图S2B类)但也削弱了该复合物中的Akt抑制和ASK1激活(图S2C). 所有这些数据都证实了PR域是p85的结合位点。

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DAB2IP通过PR域与p85交互。(A类)体外分析DAB2IP与p85的结合结构域。用各种cDNA构建物转染293细胞后，使用GST-p85-SH3融合蛋白进行下拉试验。每个输入裂解物的5%被用作负荷控制。(B类)DAB2IP复合物的体内分析。在相同的转染和处理条件下，293细胞的细胞裂解液用Flag、p85和ASK1抗体进行co-IP探针检测。(C)与活动ASK1和非活动Akt相关的DAB2IP复合体。用DAB2IP-F或VC转染293细胞，将细胞裂解物与Flag抗体进行co-IP，然后用第页-ASK1（T845或S83）或第页-Akt（S473）抗体。(D类)DAB2IP中p85结合关键脯氨酸残基的体外分析。DAB2IP中的四个脯氨酸簇加下划线，并用丙氨酸替换以生成AA1、AA2和AAA。用GST-p85-SH3融合蛋白拖出细胞裂解产物，并用Flag抗体进行检测。

DAB2IP中的PR域指示PI3K-Akt抑制和ASK1激活。

接下来我们研究了DAB2IP和p85复合物的形成是否对PI3K活性和ASK1激活有任何影响。DAB2IP-F（全长）能增强LY或TNF-α诱导的PI3K-Akt失活；然而，AAA突变体失去了这种活性(图4 A类和B类)表明PR结构域对PI3K-Akt抑制至关重要。此外，在LY或TNF-α处理下，DAB2IP-F隔离了p85并稳定了PI3K复合物（p85和p110），相反，AAA突变体中断了这种相互作用(图4C). 在这种情况下，基于p85（Y458）磷酸化状态，DAB2IP对p85的膜移位没有影响(图S2D类). 同时，在DAB2IP-F存在下，LY处理的细胞中ASK1活性（T845）显著增加，但AAA突变体未检测到(图4D类). 这些数据表明，PR结构域是PI3K-Akt抑制和ASK1激活的关键基序。

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PR域指示PI3K-Akt抑制和ASK1激活。在所有实验中，经LY或TNF-α处理后，用DAB2IP-F、AAA突变体或VC转染293个细胞，如图2. (A类)DAB2IP抑制PI3K活性。使用p110抗体对细胞裂解产物进行IP检测，并通过ELISA检测PI3K活性。未经处理的VC细胞的相对PI3K活性正常化。用80μM LY处理的VC细胞作为阳性对照。所有数据（平均值±SEM）均一式三份。星号表示VC或AAA转染细胞与DAB2IP-F转染细胞的统计学意义(P（P）< 0.01). (B类)功能PR域指示Akt抑制。如前所述，对相对Akt活性进行了量化。数据（平均值±SEM）来自三个独立的实验。星号表示VC或AAA转染细胞与DAB2IP-F转染细胞的统计显著性(P（P）< 0.01). (C)DAB2IP隔离PI3K复合体在压力信号下。细胞裂解物用p85抗体IP，然后用p110抗体进行检测。在未经处理的DAB2IP-F细胞中，p110水平被视为基线，并计算每个样本的诱导倍数。一个星号表示LY或TNF-α治疗的细胞具有统计学意义（*，P（P）< 0.01). 两个星号表示用DAB2IP-F转染的细胞相对于AAA的统计学显著性（**，P（P）< 0.01). (D类)DAB2IP指示ASK1激活。与之前一样，对ASK1的相对活性进行了量化。数据（平均值±SEM）来自三个独立的实验。星号表示VC或AAA转染细胞与DAB2IP转染细胞的统计显著性(P（P）< 0.01).

S604磷酸化对DAB2IP活动至关重要。

从我们之前的研究来看，DAB2IP中S604的磷酸化对于改变其构象至关重要(26). 这里，我们表明，在LY或TNF-α处理下，DAB2IP-F在S604被磷酸化，这导致与p85形成更复杂的结构；相反，S604A突变体未能被磷酸化并与p85相互作用(图S4A类). 这些数据表明，S604磷酸化对于改变DAB2IP结构以隔离PI3K复合物至关重要。

考虑到S604位于PER结构域，并且该结构域的功能没有很好的表征，使用Scansite程序扫描了PER蛋白序列，数据显示Akt是一种潜在的结合蛋白(图S3). 为了证实这一点，DAB2IP-PER结构域[C-PER（氨基酸522-719）、C-tPER（氨基酸522-220）、，图5A类]已生成。Co-IP数据表明，Akt结合位点位于DAB2IP中氨基酸620–719之间(图5B类). 此外，在表达S604A突变蛋白的细胞中，DAB2IP和Akt之间的相互作用显著减少(图5B类和S4系列B类). 此外，我们发现DAB2IP对Akt的抑制程度为F>C-PER≈S604A>C-tPER(图5B类)，表明S604在PER域中对调节Akt活性的关键作用。

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S604磷酸化在DAB2IP活性中的作用。(A类)PER突变结构的示意图。(B类)在LY或TNF-α治疗后，用DAB2IP-F、S604A、C-PER和C-tPER构建物转染293细胞。对细胞裂解物进行Western印迹分析或与Akt共IP，并用Flag抗体探测。(C)ASK1增加S604磷酸化。用含有ASK1野生型（WT）或激酶失活（KR；Lys 709被Arg取代）的DAB2IP-F或S604A突变体共同转染293细胞，然后用Arg检测细胞裂解物第页-DAB2IP、DAB2IP或ASK1抗体。(D类)每个功能域在DAB2IP介导的凋亡中的作用。LY或TNF-α处理后，将不同DAB2IP突变体转染C4-2细胞，流式细胞术检测细胞凋亡。

为了进一步确定S604磷酸化的候选激酶，对ASK1进行了检测，因为在LY下ASK1与DAB2IP的相关性增加(图3)或TNF-α治疗(26). ASK1-WT而非ASK1-KR显著增加了S604磷酸化(图5C). 总之，S604磷酸化是DAB2IP活化的先决条件，它与PI3K-Akt形成复合物，其中ASK1是关键引发剂之一。

PR域对DAB2IP介导的细胞凋亡至关重要。

为了关联PCa中DAB2IP的结构-功能关系，用不同的DAB2IP构建物转染C4-2细胞，并评估细胞凋亡。AAA和S604A突变体均能减少LY-或TNF-α诱导的细胞凋亡，而AA1突变体的作用较小，AA2突变体则无作用(图5D类)，这与公关领域的功能作用相一致(图3D类). 此外，GAP突变体DAB2IP-R289L(16)，也没有效果(图5D类)表明GAP结构域不参与DAB2IP介导的凋亡。显然，在对各种外源或内源性应激信号的反应中，DAB2IP构象的变化对于调节参与细胞存活或凋亡的关键效应分子至关重要(图6E类).

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DAB2IP在前列腺中的生理作用。(A类)KD1和Con细胞的体内肿瘤生长。DAB2IP的Western blot分析，第页-Akt（S473），第页-ASK1（T845），第页-JNK（T183/Y185），第页-KD1和Con细胞中的ERK1/2（T202/Y204）。(B类)高架第页-KD1与Con肿瘤中的Akt、增殖标记物和凋亡减少。石蜡切片的IHC由第页-Akt（S473）和Ki-67抗体。（放大倍数：200×。）TUNEL分析由石蜡切片测定。（放大倍数：200×。）(C)DAB2IP前列腺中Akt激活增强−/−老鼠。用DAB2IP和Western blot分析组织裂解产物第页-Akt（S473）抗体。β-肌动蛋白作为负荷对照。如前所述，对相对Akt活性进行了量化。星号表示DAB2IP的统计显著性−/−与DAB2IP相比+/+老鼠(P（P）< 0.01). (D类)DAB2IP前列腺上皮中Akt激活增强−/−老鼠。石蜡切片的IHC通过第页-Akt（S473）抗体（放大倍数：400×.）(E类)DAB2IP功能模型。为了响应应激信号，S604磷酸化DAB2IP作为一种支架蛋白，通过不同的结构域隔离ASK1、Ras、Akt和PI3K（p85-p110），以协调的方式激发各种不同的生物活性。

DAB2IP的下调导致Akt激活和ASK1失活，并与加速肿瘤生长或前列腺增生相关。

为了确定DAB2IP对体内肿瘤生长的任何影响，使用PC-3细胞生成稳定的DAB2IP敲除（即KD1）和对照（即Con）细胞。在s.c.小鼠模型中，注射后2周内，KD1细胞（12/12）的肿瘤摄取率和生长率显著高于对照细胞（3/12）(图6A类). 相比之下，所有对照肿瘤在注射后6-8周都可以触及。Western blot分析和免疫组织化学（IHC）均显示KD1肿瘤中Akt活性高度升高，ASK1-JNK活性降低(图6A类)其中肿瘤细胞表现出活跃的细胞增殖（即Ki-67染色）和减少的凋亡（即TUNEL染色）(图6B类). 为了进一步确定DAB2IP在前列腺、敲除（KO、DAB2IP）中的生理作用−/−)使用小鼠(30). DAB2IP（数字音频广播）−/−6个月大时，小鼠上皮细胞发生前列腺增生(图6D类)Akt过度激活(图6 C和D类)ASK1被抑制(图S5A类). 同样，Ki-67染色在这些增生性病变中也升高(图S5B类). 总之，DAB2IP的丢失增加了Akt过度激活的前列腺上皮细胞的生存优势，这通常在侵袭性PCa中检测到。

讨论

改变细胞增殖、存活和凋亡的稳态控制是许多疾病特别是恶性肿瘤的基础。在包括PCa在内的许多癌症类型中，PI3K-Akt信号轴被显示为主要的生存途径(1，31). 相反，ASK1（许多应激刺激下凋亡信号反应的重要介质）和/或其下游MKK4-JNK-c-Jun通路的激活不足与侵袭性PCa的发生有关(32). 尽管Akt和ASK1路径之间存在串扰(13，33)这些信号通路如何协调以维持细胞内环境稳定以应对各种刺激的机制尚不明确。我们的数据(图2和​和3）三)已揭示DAB2IP作为一种支架蛋白可以隔离Akt和ASK1，并通过调节不同信号的磷酸化状态来平衡每个不同激酶的活性。从机械角度来看，细胞死亡机制中有几个组件可能是Akt或ASK1的共同目标。例如，Bad是Bcl-2家族的促凋亡成员，通过与生存因子Bcl-XL形成无功能异二聚体来促进细胞死亡。Akt对Bad的磷酸化阻止了这种相互作用，恢复了Bcl-XL的抗凋亡功能(34). 此外，Akt通过磷酸化抑制产生蛋白酶caspase-9的催化活性(35). 另一方面，ASK1可以激活JNK或p38，这两种蛋白可以分别激活Bcl-2家族中的几个促凋亡靶点，如Bim和Bax(36). 因此，DAB2IP的存在有望通过灭活Akt和激活ASK1来增强凋亡效应。

p85是PI3K的一个调节亚单位，包含SH3、BCR、两个SH2结构域和一个与p110催化亚单位组成结合的间-SH2结构域。一般来说，SH3和BCR结构域在调节PI3K激酶活性方面起着负面作用(三)，这是由于p85–p110复合物的构象变化(1). 因此，SH3或BCR结构域被认为是p110亚单位催化活性的内在抑制剂(1，2). 很明显，我们的结果(图3和图S2)表明DAB2IP-PR结构域中的前四个脯氨酸是p85-SH3结构域的关键结合位点。尽管如此，这种相互作用对p85磷酸化没有影响，DAB2IP能够通过隔离和稳定p85-p110复合物来抑制PI3K活性，然后进一步钝化Akt(图4). 因为在TNF-α存在的情况下，DAB2IP能够从膜迁移到胞质溶胶(25)，我们认为DAB2IP-p85-p110复合物的形成可能阻止其转移到细胞膜，这为p85-SH3结构域对PI3K活性的抑制作用提供了额外的证据。综上所述，DAB2IP与PTEN在PI3K-Akt通路中具有类似的负调控作用。然而，DAB2IP是一种与各种效应分子相关的支架蛋白，而不是磷酸酶。

值得注意的是，DAB2IP作为一个关键“平台”，通过其单个结合域招募PI3K、Akt和ASK1蛋白来调节各种信号(图6E类). 例如，LY-或TNF-α介导的不同途径最终合并为相同的下游效应-Akt失活和ASK1激活。众所周知，TNF-α诱导的ASK1激活需要几个连续步骤(37–39)，我们已经证明DAB2IP将ASK1抑制剂14-3-3从其C末端分离，然后促进ASK1活化(17). 在本研究中，我们进一步表明DAB2IP介导的PI3K-Akt结合和抑制也有助于ASK1的激活(图4D类). 在反馈回路中，ASK1增加了DAB2IP中的S604磷酸化，这显著增强了DAB2IP与Akt和PI3K复合体的结合能力(图5和图S4)这意味着该磷酸化位点与DAB2IP从非活性状态到活性状态的构象变化有关。因此，ASK1–DAB2IP–PI3K复合物是平衡细胞存活和凋亡的“信号平台”，不仅存在于PCa或正常前列腺上皮细胞中，也存在于其他细胞类型中(图S6). 基于这些结果，DAB2IP能够增强PI3K或TNF-α药物抑制剂靶向治疗的效果。考虑到这些药物在较高剂量下可能产生的非靶向效应，我们认为通过基因或诱导方法恢复靶组织中DAB2IP的表达有望提高这些药物的治疗指数。

总体而言，如中所示图6E类DAB2IP是一种独特的支架蛋白，可通过多种信号通路调节细胞生长、存活和死亡，如Ras-Raf-ERK、PI3K-Akt和ASK1-JNK。因此，DAB2IP的丢失导致细胞生存和凋亡途径的失衡，这在肿瘤发展中起着重要作用(图6).

材料和方法

有关质粒构建和转染、抗体、免疫沉淀、下拉分析和Western blot分析，请参见SI文本.

细胞培养和临床标本。

C4-2（WT、Neo、D1、D2）和PC-3细胞保存在添加5%FBS的T培养基中(16). PZ-HPV-7是一种来源于良性前列腺外周带的永生化正常细胞系，保存在PrEGM培养基（Lonza）中。人类胚胎肾293细胞保存在含有10%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）（Invitrogen）中。LY294002购自Cayman，TNF-α购自Invitrogen。

机构审查委员会批准了本研究中的组织采购协议，并获得了所有患者的适当知情同意。良性前列腺增生标本取自经尿道前列腺切除术，原发癌标本（Gleason评分6-9）取自我院前列腺切除术。R.L.Vessella（华盛顿大学西雅图分校）提供的所有转移性样本均来自骨转移患者，Gleason评分=9。通过qRT-PCR分析测定每个样本的DAB2AIP mRNA水平。看见SI文本了解详细信息。

DAB2IP的RNA干扰。

用Invitrogen合成了人DAB2IP的三对siRNA寡核苷酸（5′-GGAGCAACAGUUACCUGTT-3′[siRIP1-A]；5′-GGGAGAGGACUCUGACATT-3′[siRIP1-B]；5’-GGACUUUUUUCACATT-3′[CiRIP1-C]）和对照siRNA（5′-CTGGACTCCAGAAGAACA-3′）。根据制造商的方案，使用LipofectAMINE 2000（Invitrogen）将siRNA（20μM）转染到细胞中。

DAB2IP对细胞周期或凋亡的影响分析。

如前所述进行细胞周期分析和细胞周期蛋白/DNA多参数流式细胞术(27，40).

对于凋亡，用LY（40μM）处理24小时或用TNF-α（100 ng/mL加CHX 10μg/mL）处理6小时后的细胞被采集并固定在-20°C的80%冰镇乙醇中至少24小时。用Bender Medsystems试剂盒进行Annexin V/FITC染色。TUNEL分析采用罗氏荧光原位细胞死亡检测试剂盒进行。

PI3K活性测定。

采用非放射性竞争ELISA法（Echleon Biosciences）评估PI3K活性。使用未处理的细胞计算相对PI3K活性（=1）。

动物模型。

所有实验程序均已获得机构动物护理和使用委员会的批准。对于s.c.模型，5×105在动物左右两侧注射细胞。肿瘤体积（mm三)用卡尺测量，用椭球公式（π/6×长×宽×深）计算。组织标本进行免疫组化。请参见SI文本了解详细信息。

统计分析。

图形数据中的所有误差条代表平均值±SEM。学生的双尾t吨测试用于确定具有以下特征的组之间的统计相关性P（P）<0.05视为显著。

补充材料

支持信息：

致谢。

我们感谢赖旺博士和苏丹·何博士的技术建议。这项工作得到了美国陆军拨款W81XWH-04-1-0222（给J.-T.H）的部分支持。

脚注

作者声明没有利益冲突。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/cgi/content/full/0908458106/DC补充.

工具书类

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