S公司购物中心u个类铋瞬间divier（SUMO）1是一种泛素样蛋白，与底物蛋白共价结合，具有广泛的细胞功能(1). Sumoylation是一个基本过程，缺乏Sumoylion的小鼠在植入后早期死亡(2). 琥珀酰化的生物学结果取决于底物，包括亚细胞定位、蛋白质相互作用、稳定性和转录活性的改变(1,三–5). 哺乳动物SUMO-2和SUMO-3几乎相同，而SUMO-1与其他SUMO蛋白只有50%的序列同一性。SUMO-1和SUMO-2/3在功能上也有所不同；它们与不同但重叠的底物和效应蛋白组相关。此外，SUMO-2/3蛋白能够形成链；SUMO-1无法(6–8). 与SUMO-1相反，SUMO-2/3结合在热休克和其他蛋白质损伤应激反应中增加(9). 尽管存在这些差异，SUMO-1功能可以被SUMO-2/3取代体内(10).
所有SUMO蛋白通过一个由三种酶组成的普通酶级联与目标赖氨酸结合：E1、E2和E3。SUMO结合始于与激活酶E1（Aos1和Uba2的异二聚体）形成硫酯键。Aos1/Uba2将SUMO转移到单个E2-结合酶Ubc9，该酶识别并对底物进行聚合。特异性E3 SUMO连接酶促进Ubc9底物识别(1). 氨酰化是一个动态可逆的过程，SUMO可以被异肽酶快速解偶联(11).
单个E2 SUMO结合酶Ubc9通过替代机制与不同的一致序列结合。在大多数情况下，Ubc9通过与SUMO共有四肽ΨK结合来识别底物X（X）E，其中Ψ代表一个大的疏水氨基酸，K是目标赖氨酸(12). ΨKX（X）E四肽直接被Ubc9的活性位点识别，在一些例子中，该基序之前或之后的氨基酸不与Ubc9接触(13). 然而，并不是所有的共识位点都是sumoylated，并且一些SUMO底物具有额外的特异性决定簇，可以加强与Ubc9的结合(14). 例如，在负电荷氨基酸依赖的sumoylation基序（NDSM）中，共有四肽下游的酸性氨基酸对SUMO结合至关重要，并与Ubc9上带正电的补丁结合(15). 另一个扩展的共识基序，磷酸化依赖性sumoylation基序（PDSM）由ΨK组成X（X）E四肽后接脯氨酸定向磷酸化位点，除非磷酸化，否则不能被酰化(16). PDSM和NDSM可能代表同一主题的变化；磷酸化丝氨酸可以被酸性残基取代(14). 值得注意的是，据报道，非感官赖氨酸也发生了氨酰化反应，这表明共有四肽不是氨酰化的绝对要求(17,18). 然而，由于共有四肽或扩展基序的存在通常被用作SUMO底物鉴定的预测工具，因此在非感觉位点上结合SUMO的蛋白质并不容易找到。
迄今为止，已有一些关于SUMO-2或SUMO-3底物的蛋白质组学研究报道。维特盖尔等。(19)使用核体富集程序，然后进行His纯化、溶液中消化、高效液相色谱法分离肽和MS/MS.Rosas-Acosta等。(20)采用蛋白酶体抑制和热休克处理相结合，然后进行串联亲和纯化、肠激酶洗脱、溶液消化、HPLC和MALDI MS/MS，以确定SUMO-1和SUMO-3靶点。基于细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（SILAC）的两项研究已经发表：Vertegaal等。(7)生成His标记细胞系和核裂解物，然后进行SDS-PAGE和LC-MS/MS，而Schimmel等。(21)使用HeLa细胞过度表达His-SUMO-2、蛋白酶体抑制、全细胞裂解物和液相色谱-质谱/质谱联用。
为了提高SUMO底物鉴定的灵敏度，我们开发了一种新的SUMO-2底物纯化和鉴定策略。新颖之处在于在SDS-PAGE之前使用重组SUMO蛋白酶对底物进行去甲酰化，这大大降低了SDS-PAGE-分离样品的复杂性，并增加了已识别底物的数量。对382个已鉴定的SUMO-2底物的生物信息学分析表明，SUMO共有位点在SUMO-2蛋白质组中显著富集。然而，52%的已鉴定蛋白质缺乏任何已知的一致序列，这表明SUMO与非感觉位点的结合比之前预期的更为常见。此外，我们的数据集中存在许多含有NDSM而非PDSM的底物，这表明这些扩展的一致模体是应激诱导的SUMO-2共轭的不同靶点。为了进一步表征已鉴定蛋白质的生物功能，我们进行了基因本体（GO）(22)术语富集分析。有趣的是，DNA和核苷酸相关功能的GO类别在含有NDSM的SUMO-2底物中选择性富集。考虑到不同类型的共识站点使用替代机制受Ubc9约束(13,14,16)，我们的结果揭示了SUMO-2靶向机制与底物的生物功能之间的意外联系。
实验程序
质粒结构-
Myc-PARP-1和pSG5-His-HA-SUMO-2质粒已经在前面描述过(16,23).
细胞培养和转染-
如前所述，维持并转染人K562红白血病细胞(24). 生成过表达His血凝素（HA）标记的SUMO-2（K562）的稳定细胞系HA-SUMO-2号机组)使用Bio-Rad基因脉冲电穿孔器通过电穿孔（975微法拉，220V）将30μg pSG5-His-HA-SUMO-2和3μg空pcDNA3.1共同转染K562细胞。转染细胞恢复2天，在含有G418（500μg/ml；Invitrogen）的培养基中选择新霉素耐药细胞2周。对耐药细胞进行稀释并选择用于单细胞克隆。K562HA-SUMO-2号机组细胞常规保存在含有G418（500μg/ml）的培养基中。人类HeLa宫颈癌细胞生长在Dulbecco改良的Eagle’s培养基中，该培养基添加了10%的胎牛血清和抗生素（青霉素和链霉素），并在5%的加湿CO中培养2大气温度为37°C。如前所述，通过电穿孔转染HeLa细胞(24).
热冲击处理-
在水浴中对细胞进行指定时间的热冲击，使培养基的温度为43°C。HeLa细胞在用热封闭剂（Wallac）密封的塑料袋中进行热休克。在细胞培养瓶（Falcon）中对K562细胞进行热休克。
西方印迹法-
对于Western blotting，首先将细胞颗粒悬浮在1体积的PBS中。通过在2体积的Laemmli样品缓冲液中煮沸来溶解细胞悬浮液。用8%SDS-PAGE分离裂解产物，转移到硝化纤维素膜上，并用α-HA抗体（Covance）进行印迹。
免疫沉淀-
对于大规模免疫沉淀，细胞悬浮于PBS中，并通过在PBS中煮沸1体积的1%十二烷基硫酸钠进行裂解。将裂解液与PBS中10体积的1%Triton X-100混合，超声处理，并通过18000 rpm离心10分钟进行清除。将清除的裂解液与9体积的1%BSA和1%Triton X-100混合在PBS。N个-将乙基马来酰亚胺添加到20 m的最终浓度米用IgG-Sepharose（Amersham Biosciences）对裂解产物进行预处理，并在室温下用α-HA-甘露糖（Sigma）培养2h。在37°C下用重组Ulp-1 SUMO蛋白酶（Invitrogen）处理1.5 h并在Laemmli样品缓冲液中煮沸之前，将珠状物强烈洗涤，悬浮在高盐蛋白酶缓冲液（Invit罗gen）中，并在低盐蛋白酶缓冲溶液（Invitro）中再次悬浮。小规模免疫沉淀使用类似的方案，但除非另有说明，否则不使用SUMO蛋白酶处理。α-Myc抗体（Sigma）与蛋白G珠（GE Healthcare）一起用于免疫沉淀Myc-tagged poly（ADP-核糖）聚合酶1（PARP-1）。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE分离，然后银染或转移到硝化纤维素膜上，并用α-拓扑异构酶I（Santa Cruz Biotechnology）、α-DDX21进行印迹(25)、α-PARP-1（西格玛）、α-Myc（西格马）或α-SUMO-2/3（Zymed Laboratories Inc.）抗体。
SUMO蛋白酶活性分析-
热休克K562的裂解产物HA-SUMO-2号机组如上所述，制备细胞并用α-HA琼脂糖（Sigma）进行免疫沉淀。在37°C的低盐SUMO蛋白酶缓冲液（Invitrogen）中，使用或不使用重组Ulp-1 SUMO酶（Invit罗gen）处理等量的免疫沉淀珠，处理时间为1.5h。用PBS反复洗涤珠，并在Laemmli样品缓冲液中煮沸。用α-HA抗体（Covance）进行Western blotting分析非结合SUMO底物。
纳米LC/ESI-MS/MS分析-
1×10的免疫沉淀和脱氨样品8K562细胞HA-SUMO-2号机组或亲代K562细胞经SDS-PAGE分离，凝胶呈银染。热处理K562的车道HA-SUMO-2号机组细胞被切成1毫米的薄片，每个薄片用0.2清洗两次米全日空航空公司4HCO公司三10%ACN，并用ACN脱水。蛋白质通过20 m处理被还原和烷基化米DTT和55米米碘乙酰胺。用50 m冲洗后米全日空航空公司4HCO公司三和ACN，蛋白质用胰蛋白酶在凝胶中消化（Promega，Madison，WI），并在37°C下培养过夜。用50%ACN和5%HCOOH从凝胶片中提取色氨酸肽。将肽提取物真空离心至干燥，并储存在−20°C下，直至通过质谱分析。
将干燥的肽溶解到10μl 0.1%甲酸（FA）中，并使用Ultimate毛细管LC系统、Famos自动采样器和Switchos II色谱柱切换装置（LC填料）通过自动纳米毛细管LC-MS/MS进行分析。LC系统与四极TOF质谱仪耦合（Q-Star Pulsar，Applied Biosystems/MDS Sciex，加拿大多伦多）。样品用0.3×5-mm PepMap C进行脱盐和预浓缩18μ-预柱（LC填料）。使用75μm×150 mm的肽图C实现肽分离18（3μm，100º）分析柱（LC填料）和两级梯度。首先流动相B的浓度在5分钟内从5%提高到20%，然后在20分钟内使用200 nl/min的流速从20%提高到60%。流动相a是0.1%FA和5%ACN的混合物。流动相B由0.1%的FA和95%的ACN组成。质谱仪被编程为累积信号1s以进行TOF-MS扫描，然后选择两个最强烈的峰进行3s产品离子扫描。分析员QS（Applied Biosystems）用于仪器控制。
使用Analyst QS 1.1（Applied Biosystems）、MASCOT内部服务器和Daemon（2.2.0；Matrix Science）对不同凝胶切片的数据进行组合和分析。使用Daemon中的以下数据导入过滤器选项，将Q-Star Pulsar的原始数据文件转换为MASCOT搜索的峰值列表：(一)默认前体电荷阶段2+和3+；(b条)MS-MS平均值：如果少于五个峰或前体<10或前体>100000，则拒绝光谱；分组前体质量公差，0.2；组间最大循环数；10; 每组的最小循环次数为1；(c（c）)信息相关采集调查扫描质心参数：重新确定前体电荷；高度百分比，50%；合并距离为0.01amu；和(d日)MS-MS数据质心/阈值：去除强度小于最高值0.01%的峰值；质心所有MS/MS数据；身高百分比，50%；合并距离为0.1 amu。
根据瑞士Prot数据库54.0版本搜索数据，该数据库共有276256个序列，经过分类过滤后有16891个序列。使用了以下搜索条件：分类法、，智人; 母离子和碎片离子的质量误差容限分别为0.3和0.3 Da；固定化修饰，半胱氨酸氨基甲酰化；可变修饰，蛋氨酸氧化；酶、胰蛋白酶；以及缺失劈理的数量，一个。当使用MASCOT 2.2.0内置功能根据诱饵数据库搜索数据集时，使用了相同的设置(26). 这次搜索的错误发现率为2.6%。在MASCOT肽总结报告中，设置如下：显著性阈值，第页< 0.05; 需要加粗的红色；预计截止值为0.05。所有仅用一个肽鉴定的蛋白质都被手动从数据集中删除。角蛋白作为常见污染物被去除。
GO富集分析-
GO是一个广泛使用的受控词汇，用于描述基因和基因产品属性，包括三大类26000多个术语：生物过程、分子功能和细胞成分(22,27). 通过比较基质组与背景组中GO项的频率，确定给定SUMO基质组的统计丰富GO项。每个蛋白质的GO注释通过BioMart系统从Ensembl获取(28). GO项被构造为有向非循环图，因此树中较深的节点比靠近根节点的节点更具体。在计算注释蛋白质的数量时，这个层次结构被考虑在内，如下所示。如果一个蛋白质被注释为一个术语本身或该术语的子项，则它与某个GO术语相关。进行Fisher精确测试，得出第页给定基板组中每个GO项的值(例如NDSM)使用另一组(例如非感官）或完整蛋白质组作为背景。Fisher精确检验使用2×2列联表来评估两个变量之间关联的重要性(29). 为了纠正多重假设比较，我们使用了霍尔姆方法(30)调整第页使用完整蛋白质组作为背景分布时的值。若要仅显示最相关的GO术语，请将父术语的子术语与较低的第页值被从最终结果列表中排除。
结果
识别SUMO-2底物的蛋白质组学新策略-
我们设计了一种基于蛋白质组学的方法来鉴定SUMO-2靶点(). 我们的纯化策略是基于变性细胞裂解和免疫亲和纯化，然后使用SUMO蛋白酶进行SUMO-2解偶联，然后通过SDS-PAGE和质谱鉴定进行分离。热休克诱导Sumoylation，以最大限度地增加已识别的SUMO-2底物的数量(9). 稳定表达His-HA标记的SUMO-2的人K562红白血病细胞（K562HA-SUMO-2号机组). 异位表达的SUMO-2与内源性SUMO-2/3蛋白表现相似，因为它在未处理的细胞中基本上不偶联，并在热休克时有效地与底物偶联(). 变性细胞裂解是恢复SUMO-2结合物的重要步骤，因为它会导致内源性SUMO蛋白酶快速失活。在SUMO-2底物免疫沉淀之前，需要对裂解液进行复性。
识别热冲击诱导SUMO-2基板的策略。 一个，我们的纯化是基于内源性SUMO蛋白酶的快速失活和多氨酰化底物的去氨酰化。在1%十二烷基硫酸钠中煮沸细胞裂解后，内源性SUMO蛋白酶立即失活。基于抗体的纯化需要复性。将底物用重组Ulp-1 SUMO蛋白酶在珠上脱氨，用SDS-PAGE分离，并用质谱鉴定。B类，K562HA-SUMO-2号机组细胞表达His-HA标记的SUMO-2，在热休克时与底物蛋白结合。未经处理或热休克K562的裂解物HA-SUMO-2号机组用SDS-PAGE分离细胞和热休克亲本K562细胞，并用α-HA抗体检测。C，多个sumoylation位点的存在和不同长度SUMO-2链的形成导致底物显示出许多不同的sumoylion状态。不同的基材用颜色代码表示。在SDS-PAGE上，不同的磺酰化状态被分割成离散的谱带，因此单个谱带只包含一小部分多雾化底物。SDS-PAGE前的去甲酰化可产生浓缩且分离良好的底物。D类，在SDS-PAGE之前，用Ulp-1 SUMO蛋白酶在珠状物上有效地去氨酰化底物。K562型HA-SUMO-2号机组对细胞进行热休克，使用α-HA-淀粉纯化SUMO-2结合物，并将样品分为两部分。用或不用Ulp-1处理珠子，用PBS洗涤，并在Laemmli样品缓冲液中煮沸。蛋白质通过SDS-PAGE分离，并用α-HA抗体进行印迹。IP（IP），免疫沉淀。
我们方法的新颖之处在于在体外SDS-PAGE前的SUMO去共轭，允许将含有多个SUMO-酰化位点或SUMO链的底物浓缩到SDS-PAGE凝胶上的单一条带(). SUMO去共轭步骤降低了样品的复杂性，增加了已鉴定蛋白质的数量（数据未显示）。我们选择了一种基于凝胶的程序，因为它使我们能够有效地分离大量纯化的蛋白质，这些蛋白质随后可以很容易地可视化，并与模拟和对照样品进行比较。对于去甲酰化反应，我们使用了重组酵母Ulp-1，它可以有效地从HA珠中解偶联SUMO-2，正如高分子量SUMO-2结合物消失所证明的那样().
382 SUMO-2基板的识别-
K562的免疫沉淀蛋白HA-SUMO-2号机组制备细胞和亲代K562细胞进行质谱分析。脱氨后，通过SDS-PAGE分离蛋白质，并通过银染色进行可视化。热处理K562HA-SUMO-2型样品在整个分子量范围内均呈强染色。相反，来自亲代K562细胞和未经处理的K562的样本HA-SUMO-2号机组细胞显示，除强IgG带外，只有弱染色显示特异性免疫沉淀(). 热休克K562HA-SUMO-2号机组莱恩被切成薄片，用胰蛋白酶处理。消化后，从凝胶块中提取胰蛋白酶肽，并通过LC-MS/MS进行分析。将从各个凝胶条带中收集的数据进行合并，并使用严格的标准对数据库进行搜索；即至少两个已鉴定的肽，显著性阈值为第页<0.05为阳性蛋白命中所必需。我们使用了一种诱饵数据库方法，其错误发现率为2.6%。热处理K562的质谱分析HA-SUMO-2号机组车道导致了382个SUMO-2基板的识别（补充表1）。根据PubMed的一项文献调查，115种已鉴定的底物是新的，因为之前没有报道它们与四种哺乳动物SUMO副产物中的任何一种结合(7,19–21,31–45). 我们还分析了来自热休克亲本K562和未处理K562的凝胶切片HA-SUMO-2号机组细胞。这些样本没有超过阈值的命中，可能反映了未受应力细胞中SUMO-2结合物的低化学计量比().
热冲击诱导SUMO-2基板的识别。 一个，SUMO-2底物从未经处理和热休克的K562中免疫沉淀HA-SUMO-2号机组和热休克的亲代K562细胞。免疫沉淀蛋白在带有重组Ulp-1的珠上进行去甲酰化，通过SDS-PAGE分离，银染，并通过LC-MS/MS鉴定。B类，用拓扑异构酶I抗体进行Western blotting分析来自免疫沉淀和去氨酰化样品的等分样品(地形I)、DDX21和PARP-1。C，PARP-1以热冲击诱导的方式进行SUMO-2修改。转染Myc-tagged PARP-1和SUMO-2的HeLa细胞在43°C下受到热休克2 h。细胞在变性条件下裂解、复性、超声处理并离心。α-Myc免疫沉淀物(IP（IP）)用SDS-PAGE分离，并用SUMO-2/3进行印迹。
通过免疫沉淀和脱氨样品的蛋白质印迹验证纯化。DNA拓扑异构酶I、核仁RNA解旋酶2（DDX21）和PARP-1经质谱鉴定为阳性，在热休克的K562中很容易检测到HA-SUMO-2号机组样品(). 相反，对照组K562HA-SUMO-2型在长时间暴露中只显示微弱信号，在亲代K562细胞中未检测到信号。接下来我们分析了PARP-1的sumoylation。将Myc-PARP-1和SUMO-2转染HeLa细胞并进行热休克。使用针对Myc表位的抗体免疫沉淀PARP-1。将免疫沉淀物与SUMO-2/3和Myc标记进行印迹，以检测PARP-1。SDS-PAGE后出现的琥珀酰化阶梯表明PARP-1以热休克诱导的方式发生了多烯化().
SUMO-2底物中NDSM和PDSM位点的差异流行率-
由于sumoylation经常与转录抑制结合(1)，我们很惊讶没有发现转录相关GO类别的显著丰富(和). 相反，属于分子功能本体论的高度丰富的GO类别包括“RNA加工”（8.2倍）和“RNA结合”（7.3倍）。最常见的GO术语“异质核核糖核蛋白复合物”属于细胞成分本体论，在我们的数据集中比基因组中丰富64倍（补充表2）。
SUMO-2基质中的共识类型和GO类别。 一个与RNA相关过程相关的GO类别在热休克诱导的SUMO-2底物中富集。将热休克诱导的SUMO-2底物与基因组背景进行比较，以确定属于分子功能本体的正向和负向富集GO术语。B类，许多SUMO-2底物缺乏共有四肽。古典音乐的流行，NDSM公司,PDSM公司对我们列出的热休克诱导SUMO-2底物和基因组进行了比较。C，几个GO类别有选择地与NDSM公司.与基因组相关的GO类别比例，非-NDSM公司、经典和NDSM公司进行了分析。仅含共有四肽的经典SUMO-2底物；NDSM公司，含有NDSM的SUMO-2基板；PDSM公司，含有PDSM的SUMO-2基板；非一致性，缺乏一致性四肽的SUMO-2底物；非-NDSM公司，SUMO-2基板缺少NDSM。
T型能够的我
| GO术语 | GO术语ID | 第页值（调整后）一 |
|---|
| 嘌呤核苷酸结合 | GO:0017076号 | 2.13e（电子）−02 |
| RNA结合 | 去：0003723 | 5.83e（电子）−13 |
| RNA加工 | 去：0006396 | 3.74e（电子）−08 |
| 翻译 | 去：0006412 | 3e（电子）−03 |
| 阳离子结合 | GO:0043169号 | 1.28e（电子）−11 |
| 膜固有的 | 去：0031224 | 1.33e（电子）−12 |
为了评估SUMO-2修饰中各种共有位点的使用，我们根据共有位点类型对底物进行分类。为了实现这一点，我们开发了一个名为SUMOFI的新软件，该软件使用ScanProsite从一组选定的蛋白质中搜索用于靶向SUMO底物的基序(46). SUMOFI根据Yang将Ψ定义为Met、Leu、Val、Ile或Phe和NDSM等。(15). 在SUMOFI的帮助下，我们将基质分为以下几组。经典是指仅含有共有四肽的SUMO-2底物，NDSM公司或PDSM公司指包含NDSM或PDSM的SUMO-2基板，非-NDSM公司是指缺乏NDSM的SUMO-2底物，而非感官是指缺乏共有四肽的SUMO_2底物。尽管经典和NDSM公司，大多数SUMO-2底物（52%）是非感官的(和). 为了评估这是否是由于热休克特异性效应所致，我们分析了最近一项SUMO-2蛋白质组学研究中非感觉成分的比例，该研究中未使用热休克诱导SUMO-2结合(21). 结果惊人地相似，即51%为非感官，表明大部分SUMO-2蛋白质组确实在缺乏任何已知SUMO共识序列的位点上进行了修饰。比例NDSM公司和PDSM公司不同之处在于NDSM公司与基因组相比显著丰富，但只有一个PDSM公司包含在我们的数据集中(和). 这意味着，与PDSM位点不同，NDSM位点被热休克诱导的SUMO-2修饰所特异定位，尽管Ubc9可能以类似的方式识别这两个扩展的基序(15).
T型能够的二
SUMO-2底物中丰富共识类型的p值与基因组背景的比较
| 共识类型 | 第页价值 |
|---|
| 经典 | 0.023 |
| NDSM公司 | 3.12e（电子）−06 |
NDSM位点的发生取决于底物的生物功能-
为了了解不同的基序是如何在SUMO-2修饰中使用的，我们根据共有位点的类型对底物基团进行了GO分类。某些GO术语，但并非所有SUMO-2丰富的GO术语在NDSM公司和非-NDSM公司(和). 与DNA和核苷酸相关功能相关的GO类别，如“DNA代谢过程”和“解旋酶活性”在NDSM公司比不-NDSM公司。相同的GO术语在NDSM公司与古典音乐相比也是如此。重要的是，当检测基因组中所有NDSM位点蛋白时，DNA代谢过程或解旋酶活性没有显著富集(15). 相反，一些富含SUMO-2的术语，如RNA结合和RNA加工，在NDSM公司、经典和非经典-NDSM公司(和).
T型能够的三
NDSM中GO类别的p值（包含NDSM的SUMO-2基板），使用指定的组作为背景
| GO术语 | GO术语ID | 经典一 | 非-NDSM公司b条 | 基因组 |
|---|
| ATP酶活性 | GO:0016887号 | 0.002 | 0.0004 | 0.001 |
| DNA代谢过程 | 去：0006259 | 0.013 | 0.016 | 0.002 |
| 螺旋酶活性 | 去：0004386 | 0.006 | 0.001 | 0.005 |
| 嘌呤核苷酸结合 | GO:0017076号 | 0.009 | 0.0001 | 6.28e−05版 |
| RNA结合 | 去：0003723 | 0.787 | 0.876 | 0.001 |
| RNA加工 | 去：0006396 | 0.5 | 0.228 | 0.0002 |
| 翻译 | 去：0006412 | 0.83 | 0.81 | 0.064 |
讨论
我们提出了一种新的SUMO-2底物纯化和鉴定策略。从技术上讲，创新在于使用重组SUMO蛋白酶在SDS-PAGE之前对底物进行去甲酰化，这大大降低了SDS-PAGE-分离样品的复杂性，并增加了已识别底物的数量。这种蛋白酶处理方法应广泛适用，例如，当识别泛素和其他类泛素修饰物的底物时，这些修饰物共轭为可变长度的链。市面上有几种具有去泛素活性的重组酶，如His6-USP7CD（Boston Biochemicals），可用于帮助识别泛素底物。
Ubc9使用替代机制结合不同的SUMO基序(13–16). 因此，不同的SUMO基序被替代机制锁定。为了了解这些不同的基序是如何在SUMO-2修饰中使用的，我们根据存在的共有位点类型对底物基团进行GO分类。SUMO调查人员现在可以使用我们的SUMOFI Web服务器轻松地进行类似的分析。引人注目的发现是，与DNA和核苷酸相关功能相关的GO类别在NDSM公司表明SUMO-2靶向机制的偏好取决于底物的生物功能。我们的数据不能用这些类别蛋白质中NDSM位点的普遍丰度来解释(15). 例如，GO类解旋酶活性在应激诱导的含有NDSM的蛋白质的SUMO-2库中强烈富集，但不是在所有含有NDSM的蛋白质中。因为NDSM位点在属于其他功能群的蛋白质中也很丰富(15)，这些基团可能在其他生物环境中优先修饰。因此，NDSM内或邻近的其他特异性决定因素可能允许对NDSM底物子集进行特定的上下文相关的修饰。NDSM也可能具有一些新功能，这些功能在我们的数据中得到了反映。例如，sumoylated NDSM可以招募一组特定的效应蛋白或影响SUMO修饰动力学的蛋白，例如去甲酰化酶。
迄今为止，SUMO底物识别在很大程度上依赖于这样的假设，即大多数sumoylation是由Ubc9结合到SUMO共有四肽ΨK启动的X（X）E类(47). 令人惊讶的是，本研究中发现的52%的SUMO-2底物缺乏任何已知的SUMO共识位点。目前可用的基于序列的底物预测策略排除了非一致性底物，我们的数据表明，含有一致性四肽的蛋白质在文献中出现过多。我们认为，SUMO底物识别机制比先前预期的更为广泛，并且许多SUMO衬底被独立于共有四肽的未知机制靶向。为了找到这种机制，我们从我们的非感官底物中寻找富含赖氨酸残基的短肽基序，但未能找到这种基序。新的sumoylation基序可能很难找到，因为复杂的位点特异性涉及更多的决定簇，而不仅仅是简单的线性肽基序。例如，泛素结合酶E2–25K在α螺旋内的非感官赖氨酸上被酰化，但如果二级结构被破坏，则酰化作用被导向相邻的共识位点(18). 此外，特异性决定因子可以作为模块发挥作用，这些模块定位于实际的sumoylation位点之外。SUMO相互作用基序与活化的SUMO-Ubc9配合物非共价结合可能提供这种模块(48). 另一种可能性是，非感觉性sumoylation利用了与泛素化类似的原理，E3连接酶与特定序列元件结合，提供特异性(49). 反过来，目标赖氨酸具有低选择性，并且可能在多种低选择性赖氨酸上发生偶联，甚至在引入非天然位置的赖氨酸中也可能发生偶联(50). 很明显，需要新的质谱技术来无偏见地鉴定磺酰化位点，以充分了解非感官磺酰化合的机理。技术进步还可能揭示新型SUMO共有序列，如在磷酸蛋白质组学领域，磷酸肽富集技术以指数方式增加了已识别磷酸化位点的数量，从而可以识别多种新的磷酸化基序(51).
我们的Web服务器SUMOFI现在可以在以下位置免费使用：http://csbi.ltdk.helsinki.fi/sumofi/它可以用于从用户定义的蛋白质列表或常见模式生物的基因组中寻找SUMO靶向基序。
