阻断SDF-1/CXCR4信号抑制胰腺癌进展在体外通过失活典型Wnt途径

免疫组织化学

标本来源于西安交通大学第一附属医院肝胆外科48例胰腺癌和8例正常胰腺标本。根据制造商的说明，使用SABC试剂盒（Maxim，中国福州）对CXCR4进行免疫组织化学染色。CXCR4的一级抗体（1 : 50）从eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）获得，并在4°C下培养过夜。为了评估蛋白质表达，染色强度分为0（阴性）、1（弱）、2（中等）或3（强）。根据阳性染色面积占肿瘤总面积的百分比，将染色范围分为0（0%）、1（1-10%）、2（11-50%）、3（51-80%）和4（>81%）。最后的免疫组织化学染色分数是通过将染色强度和程度相乘得到的(狮子座等, 2006).

CXCR4 shRNA表达载体构建

人类CXCR4基因序列（Genbank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_003467”，“term_id”：“1732746216”，“term_text”：“NM_003466”}}NM_003467)根据制造商的协议，使用Genscript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）和Ambion（美国德克萨斯州奥斯汀应用生物系统公司）提供的基于网络的siRNA目标查找器和设计工具分析潜在的siRNA靶点。合成了以下shRNA插入序列：5′-gatccTGAGAGCATGACGGACAAttcaagagaTTGTCCGTCATGCTTCTCAttttttggaaa-3′（目标位置：301）和5′-gatccAGCGAGAGACATTCTCtcaagaGAGATGCCACCTCGCTttttggaaa-3′（目标位置：1093）。作为阴性对照，还设计了一个插入序列为5′-gatccTTCCGAACGTCACGTTcaagagaACGTGACA的载体CGTTCGGAGAAttttggaaa-3′，不针对人类基因组中的任何区域。退火正反义寡核苷酸。消化后巴姆HI和Hin公司dIII，将片段插入shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo（GenScript Corp.，Piscataway，NJ，USA），并通过质粒测序确认。

CXCR4 shRNA表达载体的稳定转染

在24孔板中，5×10⁴转染前1天，细胞每孔电镀一次。根据制造商的建议，使用脂质体胺2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行转染。24点 转染后h，细胞溶液稀释为1 : 10和再生。在10%DMEM培养基中，400 μ克 毫升⁻¹在细胞粘附到平板上后，添加G418（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行选择。在96 well平板中使用有限稀释液进行重复菌落选择。14天后，G418（200 μ克 毫升⁻¹)添加用于未来稳定转染细胞培养。

定量实时聚合酶链反应（QT–PCR）检测mRNA表达

提取总RNA，2×10⁵用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）采集细胞。根据制造商的说明，使用SYBR®ExScript™RT–PCR试剂盒（中国大连塔卡拉生物科技有限公司）进行cDNA合成：500 ng总RNA与2 μl of 5×ExScript™RTase缓冲区，0.5 μl dNTP混合物，0.5 μl随机六聚体，0.25 μExScript™Rtase的l和0.25 μ总体积为10升的核糖核酸酶抑制剂 μl.反应在42°C下进行12次 min，然后在95°C下将逆转录酶灭活2 min.cDNA在−20°C下保存。使用SYBR Green Master Mix在ABI PRISM®7300序列检测系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行QT–PCR。最终反应体积为25 μl，含有12.5 μl 2×SYBR®Premix Ex Taq™，1.0 μ每层底漆（10 μM（M）), 0.5 μl 50×ROX参考染料，1.0 μl cDNA。循环条件如下：95°C初始变性10 分钟，然后在95°C下40次循环15次 s、 60°C和60°C s.每次测量均一式三份，每次分析均不包括模板对照。在每个QT–PCR中，进行分离曲线分析。GAPDH作为内控基因控制。使用2^{−ΔΔC类_t吨}方法(Livak和Schmittgen，2001年).

细胞增殖试验

细胞以5×10的浓度接种在96个平板中^三实验前一天。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT，0.5 毫克 毫升⁻¹（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）在播种后1、2、3、4、5天添加到每口井中。通常，细胞在37°C下培养4 h、 然后是150 μl二甲基亚砜。在490波长下测量吸收值 纳米。

流式细胞术分析

流式细胞仪分析前，1×10⁶收集细胞，用PBS洗涤两次，然后用冰镇70%乙醇固定24小时 4°C时为h。固定细胞用碘化丙啶染色（贝克曼·库尔特，美国佛罗里达州迈阿密）。孵育30天后 在37°C条件下，通过流式细胞仪对样品进行分析。使用MultiCycle软件对DNA直方图进行细胞周期分析。

软琼脂集落形成试验

在六个孔板中，每个孔包含1%琼脂糖的底层，0.5%琼脂糖的中间层，包括7.5×10^三细胞和上层培养基。每六天更换一次顶层培养基。14天后，用Giemsa溶液（Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA）对细胞进行染色，并用Quantityone分析软件（BioRad Inc.，Hercules，CA，USA。

蛋白质提取和蛋白质印迹

从1×10中分离出总蛋白⁷200个单元格 μl含1%Nonide P-40（NP-40）的冰镇裂解缓冲液，50 毫摩尔 我⁻¹Tris（pH 7.4），150 毫摩尔 我⁻¹氯化钠、0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5%脱氧胆酸盐、200 μ克 毫升⁻¹苯甲烷磺酰氟（PMSF），和50 μ克 毫升⁻¹抑肽酶。15时通过离心法去除不溶物质 000 克用于15 4°C时最小值。用考马斯G-250分光光度法测定提取蛋白的浓度。澄清蛋白裂解物（30–80 μg） 在变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶（8-12%）上电泳拆分，并电转移到硝化纤维素膜上。最初用5%脱脂干乳在Tris缓冲盐水（TBS）中封闭膜2 h，然后用针对特异性蛋白质和GAPDH的一级抗体探测（作为负载对照）。在4°C下与一级抗体共培养过夜后，将膜与二级碱性磷酸酶结合的山羊抗兔抗体（1 : 2000年），山羊抗鼠抗体（1 : 3000）（中国上海康城）2 室温下h。免疫阳性条带通过增强化学发光（ECL）检测系统（Amersham Bioscience，Piscataway，NJ，USA）进行检测，并将图像转移到X射线胶片上。如果感兴趣的条带出现在每个标记蛋白对应的预期分子量，则western blot分级为阳性。所有分析均一式两份。本研究中使用的抗体：CXCR4（1 : 200）和基质金属蛋白酶-9（1 : 250）（NeoMarkers，Fremont，CA，USA），维门汀（1 : 200）和GAPDH（1 : 400）（圣克鲁斯生物技术，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国），P339-CXCR4抗体（1以下为：200）由圣路易斯华盛顿大学医学院的Joshua B.Rubin教授提供。

β-连环蛋白/Tcf转录报告分析

简言之，1×10⁵在用构建的TOPflash或FOPflash报告质粒（Millipore，Billerica，MA，USA）瞬时转染之前，将细胞每孔接种在24孔板中。TOPflash由胸腺嘧啶激酶（TK）启动子上游的Tcf/Lef位点和萤火虫荧光素酶基因的三个拷贝组成。FOPflash由三个Tcf/Lef位点的突变拷贝组成，并用作检测报告者非特异性激活的对照。所有转染均使用0.8 μg TOPflash或FOPflash质粒和2 μl脂质体2000。为了使报告分析中的转染效率正常化，将细胞与0.02进行共转染 μg内部对照报告质粒，包含由TK启动子驱动的肾形Renilla reniformis荧光素酶。24点 TOPflash或FOPflash转染后h，使用双荧光素酶检测系统试剂盒（美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司）进行荧光素酶检测。相对荧光素酶活性报告为转染效率归一化后的折叠诱导。

Matrigel侵犯分析

利用Millicell入侵室（Millipore，Billerica，MA，USA）进行入侵检测。第8个 μm孔插入物上涂有15 μg Matrigel（美国马萨诸塞州贝德福德市Bedton Dickinson实验室）。含或不含100的正常培养基 纳克 毫升⁻¹SDF-1型α（R&D systems Inc.，Minneapolis，MN，USA）被添加到底室以诱导癌细胞系。电池（5×10⁴)在顶室播种。Matrigel入侵室孵化20分钟 h在湿化组织培养箱中。用棉签从基质凝胶的顶部去除未侵入的细胞。滤池底面侵入细胞用甲醇固定，Giemsa染色。通过对染色细胞的计数来确定侵袭能力。

建立稳定的CXCR4击倒

使用shRNA敲除转录物是研究基因功能的有力工具。研究肿瘤细胞的长期生长模式在体外，我们开发了包含小发夹结构的pRNAT-U6.1/Neo载体，能够生成19个核苷酸双链RNAi寡核苷酸。我们成功获得稳定的shRNA载体转染细胞，称为pRNAT-M1（靶位：301）、pRNAT-M2（靶位；1093）和pRNAT_MN（阴性对照载体）。QT–PCR分析显示，与pRNAT-MN细胞相比，CXCR4 shRNA转染的细胞系中，尤其是pRNAT-M1细胞中，CXCR4 mRNA的表达被抑制了70%(P（P）<0.05). 与Miapaca-2细胞相比，pRNAT-MN细胞中CXCR4 mRNA表达减少约20%(图2A). 此外，与pRNAT-MN细胞相比，pRNAT-M1细胞中CXCR4蛋白水平也显著下调(图2B). 值得注意的是，在pRNAT-M1细胞中观察到丝氨酸339处CXCR4磷酸化降低。通过带分析，pRNAT-M1细胞中磷酸化CXCR4的比例也降低(图2C).

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图2

建立稳定的CXCR4击倒。(A类)不同CXCR4 shRNA表达载体转染后CXCR4表达的QT-PCR分析：pRNAT-M1（靶位301）、pRNAT_M2（靶位1093）、pRNA T-MN（阴性对照）和Miapaca-2，^*P（P）与pRNAT-MN细胞相比<0.05；(B类)不同转染胰腺癌细胞的CXCR4抗体免疫印迹。GAPDH被检测为负荷控制；(C类)Western blot显示转染细胞上丝氨酸339（P339-CXCR4）磷酸化CXCR4和CXCR4的不同表达。GAPDH被检测为负载控制。

CXCR4的去除抑制细胞增殖，延迟细胞周期并降低克隆形成能力

为了证实CXCR4抑制对细胞生长的影响，培养了稳定的CXCR4 shRNA转染体。MTT分析显示，pRNAT-M1细胞的生长速度慢于pRNAT-MN细胞。在接种后的第50天，pRNAT-M1和pRNAT-MN细胞之间出现了不同的生长(P（P）<0.05). 然而，Miapaca-2细胞和pRNAT-MN细胞之间没有差异(P（P）>0.05) (图3A). 根据流式细胞术对细胞周期分布的分析，我们发现从G0期到G1期的进展存在明显的延迟（51.23与76.51%），S期下降（41.16与23.0%）和G2-M相（1.61与0.39%). 此外，在pRNAT-M1细胞中也观察到G1亚凋亡间隔(图3B). 探讨CXCR4基因敲除对肿瘤发生的影响在体外，我们进行了软琼脂集落形成测定。结果表明，与pRNAT-MN细胞相比，pRNAT-M1细胞的集落形成减少(P（P）<0.05) (图3C).

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图3

CXCR4敲除对细胞表型的影响。(A类)在第1、2、3、4和5天对pRNAT-M1、pRNAT-MN和Miapaca-2进行MTT分析；(B类)通过流式细胞术分析pRNAT-M1和pRNAT-MN来证明细胞周期相的分布；(C类)采用软琼脂试验评价细胞集落形成能力。菌落计数如图所示；^*P（P）与pRNAT-MN细胞相比<0.05。

CXCR4敲除抑制Wnt活性、Wnt靶基因和侵袭相关基因

Wnt作为胃肠道癌症发展的重要途径/β-catenin通路和与细胞侵袭性相关的基因备受关注。这个β-catenin/Tcf转录报告试验被认为是评估Wnt通路活性的重要评估方法。由于TOPflash有三个TCF结合位点，因此可以应用于表示Wnt途径的激活。我们的数据表明，与pRNAT-MN细胞相比，CXCR4敲除细胞的TOPflash活性降低(P（P）<0.05），FOPflash活性不变(图4A). 此外，QT-PCR分析表明，pRNAT-M1细胞中的Wnt靶基因如CTNNB1、UPA和CD44受到抑制，但MYC和CCND1的表达没有改变(图4B). 同时，CXCR4的抑制导致Slug、Vimentin和MMP-9的表达降低(P（P）<0.05) (图4C).

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图4

CXCR4基因敲除对Wnt靶基因和侵袭相关基因的影响。(A类)β-连环蛋白/Tcf转录报告分析。用对照报告质粒进行标准化，显示出相对荧光素酶活性。^*P（P）与pRNAT-MN细胞相比<0.05；(B类)QT–PCR分析以检测CTNNB1(β-catenin）、UPA、SLUG、CD44、MYC（c-MYC）、Vim（Vimentin）、CCND1（cyclin D1）基因表达^{−ΔΔC类_t吨}方法。^*P（P）与pRNAT-MN细胞相比<0.05；(C类)western blot分析检测MMP-9和波形蛋白的表达。GAPDH被用作负荷控制。

我们感谢圣路易斯华盛顿大学医学院的Joshua B Rubin教授慷慨提供磷酸化CXCR4特异性抗体。我们还感谢王信阳博士、尤元毅博士的技术支持，并感谢徐丽教授、陈伟教授的有益讨论和论文修订。本研究得到了国家自然科学基金（30700817号）、陕西省科学技术局自然科学基金项目（2006K09-G7号）和西安市科学局自然科学项目（GG06178号）的资助。